參苓白術(shù)散通過IκBα/NF-κB通路調(diào)控Lewis肺癌小鼠腫瘤自噬的研究

張云亭，劉羽茜，蔣宗鎣，張 林，董 秀，馮曉帆，王靖宇，王艷杰

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 沈陽 110847）

近年來，有關(guān)肺癌的防治一直是醫(yī)學(xué)研究攻克的重點和難點[1]。目前臨床治療肺癌常用的化療藥物主要為抗腫瘤效果顯著、抗腫瘤譜廣的鉑類藥物，但鉑類藥物容易引起嚴重的免疫功能下降、胃腸道功能降低、精神萎靡等毒副作用[2]。中藥因其多靶點效應(yīng)、毒副作用低、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢逐步參與到臨床肺癌的綜合治療當中。臨床研究表明使用培土生金法聯(lián)合化療治療非小細胞肺癌能夠提高臨床療效，改善患者生活質(zhì)量，不良反應(yīng)較單純化療組明顯減少[3]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)參苓白術(shù)散含藥血清能通過調(diào)控 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達有效的抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的SPCA1 肺癌細胞的增殖，說明在體外實驗中參苓白術(shù)散能夠通過調(diào)控LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而抑制肺癌細胞的增殖[4]。炎癥反應(yīng)貫穿于腫瘤疾病始末的全過程，而自噬的激活能夠抑制促腫瘤的炎癥反應(yīng)，增強抗腫瘤免疫活性。眾多證據(jù)表明[5-6]，細胞自噬可以調(diào)節(jié)過度的炎癥反應(yīng)。腫瘤微環(huán)境中自噬與免疫的交互作用共同影響著腫瘤發(fā)生、進展[7]。參苓白術(shù)散等培土生金法中藥復(fù)方能夠調(diào)節(jié)機體免疫功能[8]，但是其是否能夠干預(yù)腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，從而調(diào)控自噬有待進一步研究。因此本實驗通過觀察參苓白術(shù)散對肺癌小鼠腫瘤細胞自噬相關(guān)蛋白Atg3、Atg5、Beclin-1 和LC3 表達的影響，及其對炎癥相關(guān)通路IκBα/NF-κB 通路和促炎因子TNF-α、IL-1β 的含量的影響，為進一步探索參苓白術(shù)散聯(lián)合順鉑治療肺癌的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物

雄性 C57BL/6J 小鼠 40 只，SPF 級，體質(zhì)量 18-22 g；購于北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號SCXK(京)2016-0002。動物實驗在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部進行，動物使用許可證號SYXK(遼) 2015-0001。本研究所涉及的動物實驗部分均符合中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理委員會批準，批準號IACUC.2018019。

1.2 主要藥物和試劑

參苓白術(shù)散（北京同仁堂有限公司，生產(chǎn)批號16101054）、順鉑（齊魯制藥有限公司，生產(chǎn)批號1W2A1301004B）、TNF-α 和 IL-1β ELISA 試劑盒（美國 ADL 公司）、IκBα、NF-κB、Atg3、Atg5、Beclin-1、LC3B 和二抗（美國Proteintech）、SABC 試劑盒、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；全蛋白抽提試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒、預(yù)染蛋白分子量、SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒、ECL 檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 儀器

YrdimesSW07D0567 蛋白轉(zhuǎn)印儀（威泰克有限公司），EG1150C 型包埋機，超薄切片機LKB-1，HI1220型烘片機（德國LEICA），JEM-1011BX51 型OLYMPUS顯微鏡（日本OLYMPUS），ELITE300PLUS E5W0541基礎(chǔ)電泳儀電源（威泰克有限公司），5415C 高速冷凍離心機（德國Eppendorf），RM2235 型手動石蠟切片機，THZ-312 臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），DolphinChemiPlusIDPK1012012 凝膠成像分析系統(tǒng)（威泰克有限公司）。

2 方法

2.1 模型的建立與實驗動物分組

常規(guī)培養(yǎng)小鼠肺癌Lewis 細胞（購自中國科學(xué)院細胞庫），達到一定數(shù)量后收集細胞并計數(shù)，制作濃度為 1×107個/mL 的細胞懸液。SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠40 只，每只右側(cè)腋窩皮下接種細胞懸液0.1 mL；待腫瘤組織形成后用游標卡尺測定瘤體的瘤長（a）和寬（b），計算腫瘤體積（tumor volume，TV），TV=1/2×a×b2，每日1 次，7 天后待腫瘤體積達到50 mm3視為Lewis 肺癌小鼠模型建立成功。建模成功后隨機分成4 組，每組10 只，分別為模型組、順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組。模型組給予等量蒸餾水灌胃；順鉑組給予腹腔注射順鉑（5 mg·kg-1）每周1 次，共2 次；中藥組按照體表面積折算法進行人和大鼠等效計量換算，給予參苓白術(shù)散（9.36 g·kg-1）每天1 次，連續(xù)灌胃 14 天；中藥+順鉑組給予參苓白術(shù)散（9.36 g·kg-1）每天1次，連續(xù)灌胃14 天，同時給予腹腔注射順鉑（5 mg·kg-1）每周 1 次，共2次。

2.2 各組小鼠腫瘤體積、相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率的測定和計算

模型建立成功后和給藥第14 天分別測定小鼠腫瘤長（a）和寬（b），計算腫瘤體積（tumor volume，TV）體積，TV=1/2×a×b2，然后計算相對腫瘤體積（relative tumor volume，RTV），計算公式為 RTV=Vt/V0，其中 V0為模型建立成功后分籠給藥時測量的腫瘤體積，Vt為給藥14天后測量的腫瘤體積，然后計算相對腫瘤增殖率T/C（%），計算公式如下：T/C（%）=TRTV/CRTV×100%,其中TRTV為各治療組RTV，CRTV為Lewis模型組RTV。

2.3 透射電鏡觀察各組腫瘤細胞超微形態(tài)變化

取腫瘤組織于干冰上修成1 mm3組織小塊，先放入4%多聚甲醛固定2 h 以上，PBS 沖洗，然后1%鋨酸固定2 h，PBS 沖洗。梯度乙醇、丙酮脫水，包埋，聚合。1 μm半薄切片，甲苯胺藍染色定位，然后超薄切片，檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾雙染，透色電鏡觀察，拍照比較分析。

2.4 ELISA 法測定各組腫瘤組織中TNF-α 和IL-1β的含量

腫瘤組織按照1:9（M:V）加PBS 研磨制備組織勻漿，離心取上清，按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測，酶標儀450 nm 處測定各反應(yīng)孔的吸光度值，并計算TNF-α和IL-1β的含量。

2.5 免疫組化法測定腫瘤組織IκBα 蛋白表達水平和NF-κB的入核率

切片滅活內(nèi)源性酶，封閉，滴加一抗50 μL，37℃孵育2h，PBS浸洗。滴加二抗，37℃度孵育20 min，PBS浸洗。DAB 溶液顯色，復(fù)染，返藍，梯度脫水封片。光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細胞中IκBα 和NF-κB 蛋白的表達水平，細胞質(zhì)呈棕黃色為IκBα 陽性表達細胞，細胞質(zhì)和細胞核呈棕黃色為NF-κB 陽性表達細胞，隨機選取3 個視野采用Image J 軟件進行平均光密度測定，取其平均值作為該切片的代表值，并計算NF-κB P65 入核率，即細胞核陽性細胞數(shù)占總陽性胞數(shù)的百分比，取其平均值作為該切片的代表值。

2.6 Western Blot 法測定腫瘤組織 Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3II的蛋白表達水平

腫瘤組織加入1 mL預(yù)冷過的Lysis Buffer裂解液，充分研磨，離心分離上清，得到總蛋白提取物，用BCA法進行蛋白定量測定。配制分離膠和濃縮膠，上樣，電泳，然后轉(zhuǎn)膜，封閉。然后滴加一抗（1:500-1000），4℃搖床振蕩孵育過夜。第二天TBST洗滌，滴加二抗，室溫搖床振蕩1-2 h，TBST 洗膜。采用ECL 化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J 軟件測定目的蛋白和內(nèi)參蛋白和條帶的光密度值，計算目的蛋白和內(nèi)參的光密度比值，進行統(tǒng)計分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 參苓白術(shù)散對Lewis 肺癌小鼠腫瘤體積、相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率的影響

治療前各組腫瘤體積達到0.05 cm3（50 mm3），提示造模成功，并且各組小鼠腫瘤體積無顯著差異（P＞0.05）；治療結(jié)束后，和模型組比較，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組腫瘤體積和相對腫瘤體積顯著降低（P＜0.01）（表1）。中藥組相對腫瘤增殖率為54.51%，中藥+順鉑組相對腫瘤增殖率為42.31%，順鉑組相對腫瘤增殖率為44.77%，其中中藥+順鉑組相對腫瘤增值率最低，說明中藥聯(lián)合順鉑治療抑制腫瘤增殖效果最顯著。

表1 參苓白術(shù)散對Lewies肺癌小鼠腫瘤體積和相對腫瘤體積的影響（，n=10）

表1 參苓白術(shù)散對Lewies肺癌小鼠腫瘤體積和相對腫瘤體積的影響（，n=10）

注：和模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.2 參苓白術(shù)散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞超微形態(tài)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示模型組腫瘤細胞和細胞核結(jié)構(gòu)清晰，細胞器豐富，可見少量自噬小體，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組腫瘤組織中細胞體積縮小，細胞核呈不規(guī)則形態(tài)，自噬小體數(shù)量增加（圖1、圖2）。

圖1 各組皮下瘤體

圖2 參苓白術(shù)散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞超微形態(tài)的影響

3.3 參苓白術(shù)散對腫瘤組織TNF-α 和IL-1β 含量的影響

ELISA 結(jié)果顯示（圖3），和模型組比較，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組腫瘤組織TNF-α 和IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01）。和順鉑組比較，中藥組和中藥+順鉑組腫瘤組織TNF-α 和 IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01）。說明中藥治療和中藥聯(lián)合順鉑治療降低肺癌腫瘤組織中促炎因子TNF-α和IL-1β的含量更顯著。

圖3 參苓白術(shù)散對Lewis肺癌小鼠腫瘤組織TNF-α和IL-1β含量的影響

3.4 參苓白術(shù)散對腫瘤組織中IκBα 和NF-κB P65 蛋白表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示：IκBα 和 NF-κB 陽性細胞顯示為棕色（圖4）。與模型組相比，順鉑組、中藥組及中藥+順鉑組的腫瘤組織中IκBα 陽性細胞數(shù)量顯著增加，平均光密度值顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組的腫瘤組織中NF-κB 陽性細胞數(shù)量顯著減少，NF-κB P65 入核率顯著降低（P＜0.01）。說明順鉑、中藥以及中藥聯(lián)合順鉑能夠增加 IκBα 的蛋白表達水平，而降低 NF-κB P65 入核率，從而抑制IκBα/NF-κB通路（表2）。

圖4 參苓白術(shù)散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞IκBα和NF-κB P65蛋白表達的影響

表2 參苓白術(shù)散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞IκBα表達和NF-κB入核率的影響（，n=6）

表2 參苓白術(shù)散對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞IκBα表達和NF-κB入核率的影響（，n=6）

注：和模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.5 參苓白術(shù)散對腫瘤組織中Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示（圖5）：與模型組相比，順鉑組、中藥組和中藥+順鉑組的腫瘤組織中Atg3、Atg5、Beclin-1 和LC3II/LC3I 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；和順鉑組比較，中藥+順鉑組LC3II/LC3I蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明參苓白術(shù)散能夠增加肺癌組織中 Atg3、Atg5、Beclin-1 和 LC3II/LC3I蛋白表達水平，促進腫瘤細胞自噬，中藥聯(lián)合順鉑上調(diào)LC3II/LC3I蛋白表達水平作用最顯著。

圖5 參苓白術(shù)散對Lewis肺癌小鼠Atg3、Atg5、Beclin-1和LC3蛋白表達的影響

3 討論

肺癌在中醫(yī)學(xué)范疇內(nèi)屬“肺積”“結(jié)癖”“息責(zé)”等，雖然病變的部位是在肺，但發(fā)病的原因與脾、肝、腎等臟腑均有關(guān)系。肺癌等肺系疾病經(jīng)日久損耗后，常會出現(xiàn)肺氣不足的情況。脾與肺為母子關(guān)系，子盜母氣，則脾氣也會不足，出現(xiàn)脾虛之癥。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提到：“虛則補其母，實則瀉其子?！彼钥梢杂醚a脾益肺的方法治療肺癌。參苓白術(shù)散出自《太平惠民和劑局方》，為培土生金方的代表方劑之一。方中人參、茯苓、白術(shù)為君藥，蓮子、山藥、白扁豆、薏苡仁為臣藥，君臣合用以滲濕健脾，補脾益肺。砂仁醒脾行氣和胃、暢達氣機；桔梗載藥上行、宣開肺氣；甘草健脾和中、調(diào)和藥性，三者共為佐使藥。本方用甘溫藥物補脾，兼能補益肺氣以培土生金，對肺癌中后期造成的肺脾氣虛有顯著療效。目前，參苓白術(shù)散已逐漸應(yīng)用于臨床肺癌的輔助治療[9]，參苓白術(shù)散的作用機制也在逐步被研究發(fā)現(xiàn)[10-11]。如方中君藥茯苓最主要的活性成分之一茯苓多糖，已被證實具有抗炎、抗腫瘤及提高機體免疫力等作用[12]。方中君藥人參[13-14]的主要活性成分人參皂苷及白術(shù)[15]中的活性成分白術(shù)內(nèi)酯等，同樣被實驗研究證明具有抗炎及抗腫瘤等作用。

自噬是真核生物特有的，為了維護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所進行的一種程序性細胞死亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與治療過程中均有體現(xiàn)[16]，是近年的研究熱點。自噬的發(fā)生被自噬相關(guān)基因嚴格調(diào)控[17]。其中beclin-1是形成自噬體過程中的必需基因，同時也是重要的抑癌基因[18]。李璐等[19]研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中beclin-1表達量顯著降低，可以通過上調(diào)beclin-1 的表達來發(fā)揮抑制腫瘤的作用。Atg5 參與自噬泡的形成，在眾多調(diào)控自噬的基因中占主要地位，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均有參與[20]。程建超等[21]發(fā)現(xiàn)調(diào)控Atg5的表達可以抑制肺癌腫瘤生長。Atg3 對LC3 的脂化起重要調(diào)節(jié)作用。LC3 是自噬發(fā)生的標志之一，參與自噬膜的形成并調(diào)控溶酶體和自噬體的結(jié)合[22]。當自噬發(fā)生時，活化后的LC3-I被修飾形成LC3II，經(jīng)過融合蛋白的轉(zhuǎn)移后，在自噬體膜上促進自噬體的成熟[23]。LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值，常被作為衡量自噬程度的標準[24]。有研究表明[25]誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生自噬后，腫瘤細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表達水平顯著提高。

NF-κB 是一種誘導(dǎo)性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達，對細胞的增殖、凋亡、自噬等均有影響[26]。未被激活時，NF-κB 和其相應(yīng)的抑制蛋白IκB在細胞漿中結(jié)合存在。受到外界刺激時，IκB激酶家族通過磷酸化使IκB 從無活性的三聚體中降解出來，從而激活 NF-κB 信號通路[27]。NF-κB 信號通路作為典型的炎癥通路，激活后會持續(xù)刺激TNF-α、IL-1β等的表達，引起炎癥反應(yīng)，促使腫瘤炎性微環(huán)境持續(xù)存在，促進腫瘤細胞的生成、增殖和轉(zhuǎn)移[28-29]。NF-κB的激活過程中會出現(xiàn)mTOR 信號通路的激活，進而抑制細胞自噬的發(fā)生。有研究表明通過抑制NF-κB 信號通路可以上調(diào)自噬蛋白的表達，促進腫瘤細胞發(fā)生自噬[30-31]。梁曉暉等[32]通過實驗發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB 信號通路中相關(guān)蛋白的磷酸化，可以達到促進腫瘤細胞自噬的效果。

本實驗結(jié)果顯示，中藥組和中藥聯(lián)合順鉑組中TNF-α、IL-1β 的含量均有降低，NF-κB 蛋白表達水平降低，IκBα 蛋白表達水平升高，這提示參苓白術(shù)散能夠通過促進IκBα 蛋白的表達，抑制IκB 激酶家族磷酸化，來抑制NF-κB 的激活和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。中藥組和中藥聯(lián)合順鉑組中 Atg3、Atg5、Beclin-1 和 LC3II/LC3I的表達明顯增加，這提示參苓白術(shù)散能夠通過抑制炎癥通路的激活來調(diào)控肺癌腫瘤細胞的自噬。

綜上所述，參苓白術(shù)散可能通過上調(diào)IκBα蛋白表達，抑制NF-κB的激活，改善腫瘤炎性微環(huán)境，從而促進Lewis 肺癌小鼠腫瘤細胞自噬。這為臨床上使用參苓白術(shù)散進行中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌并降低機體炎癥反應(yīng)提供了一定的實驗依據(jù)。