黑龍江省番茄栽培品種對南方根結(jié)線蟲的抗性評價(jià)

趙亞男，王旋，常豆豆，黃銘慧，姜野，秦瑞峰，孟凡立，于瑾瑤，趙磊，蔣丹，謝倚帆，王從麗，李春杰

(1.中國科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 大豆分子設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

0 引 言

植物寄生線蟲是威脅世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病原物，每年全球由其引起的損失超過1 500億美元[1]。其中，根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是最影響經(jīng)濟(jì)效益的植物寄生線蟲，是蔬菜作物中最具有毀滅性的土傳病害[2]。溫帶、亞熱帶及熱帶地區(qū)的植物受害尤其嚴(yán)重，病害發(fā)生后，一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重的達(dá)75%以上[3]。近年來，隨著我國人們生活水平的提高，蔬菜需求量迅速增加，使保護(hù)地蔬菜種植面積逐漸擴(kuò)大。因保護(hù)地密閉、高溫、高濕和復(fù)種指數(shù)增加等因素，導(dǎo)致蔬菜根結(jié)線蟲病發(fā)生逐年加重。黑龍江省設(shè)施內(nèi)蔬菜已有根結(jié)線蟲病發(fā)生的報(bào)道[4-5]，特別是番茄(SolanumlycopersicumL.)根結(jié)線蟲病的發(fā)生危害逐年加重，殺線蟲劑雖有效，但是多數(shù)殺線蟲劑為高毒農(nóng)藥，殘留量大且難降解，污染土壤環(huán)境并威脅人們身體健康。南方地區(qū)的嫁接技術(shù)是防治根結(jié)線蟲的有效措施，但是成本較高，北方地區(qū)還沒有實(shí)行嫁接技術(shù)控制根結(jié)線蟲病[6-8]。種植抗性品種是防治番茄根結(jié)線蟲病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。目前在野生番茄中已經(jīng)鑒定出10個(gè)根結(jié)線蟲的抗性基因，其中Mi-1是單顯性基因，也是唯一克隆并導(dǎo)入番茄栽培種的抗性基因，如VFNT含有的Mi-1基因具有對3種根結(jié)線蟲的抗性，即抗南方根結(jié)線蟲(M.incognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)和花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)，但對北方根結(jié)線蟲(M.hapla)是感病的[9-12]。黑龍江省番茄栽培品種對根結(jié)線蟲病抗性評價(jià)報(bào)道甚少，僅1999年于秋菊等對當(dāng)時(shí)的番茄品種進(jìn)行了抗性篩選[4]。本研究針對目前當(dāng)?shù)胤言耘嗥贩N對根結(jié)線蟲病進(jìn)行抗性鑒定，明確不同品種對當(dāng)?shù)啬戏礁Y(jié)線蟲的抗性程度，篩選抗性及高抗品種，同時(shí)為選育抗南方根結(jié)線蟲番茄品種提供材料。

1 材料和方法

1.1 參試材料

參試番茄：在當(dāng)?shù)厥袌霾少徚?1個(gè)番茄栽培品種，VFNT品種為中科院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)田有害生物控制學(xué)科組實(shí)驗(yàn)室保存，作為對南方根結(jié)線蟲的抗性對照(表1)。

根結(jié)線蟲：南方根結(jié)線蟲(M.incognita)從黑龍江省大慶市郊區(qū)蔬菜大棚采集，前期研究鑒定為1號小種[5]。在智能溫室內(nèi)(22～28 ℃，光照16 h·d-1)番茄中蔬4號(802-19-4(西農(nóng)72-4粉選系)與802-12-7(豐瑪Tm-2nv粉選系)的雜交后代[13])根上繁殖。北方根結(jié)線蟲(M.hapla)由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，于溫室番茄中蔬4號品種根上繁殖。

1.2 試驗(yàn)方法

根結(jié)線蟲卵懸液制備：參照王鑫鵬等[14]方法制備懸液。取被南方根結(jié)線蟲侵染45 d后的番茄根系，洗凈后放入樂扣密封桶內(nèi)，加入200 ml的1%NaClO，用力震蕩3 min，再將根及溶液一起倒入從上到下依次為200目和500目的篩子上，用高壓水槍沖洗。收集500目篩子上的卵于燒杯中，制成卵懸液，用磁力攪拌器將其混合均勻，將卵懸液注入計(jì)數(shù)板于顯微鏡下調(diào)查卵的濃度，重復(fù)三次取平均值，計(jì)算出卵的濃度，備用。

盆栽方法：在直徑為12 cm、深為12 cm的一次性塑料營養(yǎng)缽內(nèi)裝滅菌沙土(體積比2∶1)至距上沿3 cm處。將待鑒定的番茄種子在濕潤雙層濾紙內(nèi)發(fā)芽24 h，在每缽內(nèi)播種3粒，出苗后每缽定苗1株，每個(gè)品種10盆，重復(fù)二次。待番茄苗長至約10 cm高時(shí)，在苗根部對稱兩側(cè)用1 ml微量移液器的槍頭打孔，孔深約4 cm，將1 000個(gè)卵均勻注入兩個(gè)孔內(nèi)。接種42 d扣盆，番茄地上部分剪掉后將完整的根系洗出，根據(jù)番茄根被根結(jié)線蟲侵染并形成根結(jié)的根數(shù)占整個(gè)根系的比例進(jìn)行定級[15]。

根結(jié)線蟲病的病情分級：0級，無根結(jié)；1級，0<有根結(jié)的根數(shù)占總根系<10%；2級，10%≤有根結(jié)的根數(shù)占總根系<25%；3級，25%≤有根結(jié)的根數(shù)占總根系<50%；4級，50%≤有根結(jié)的根數(shù)占總根系<75%；5級，75%≤有根結(jié)的根數(shù)占總根系≤100%的根系上有根結(jié)。

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)×各級代表值)×100/(調(diào)查總株數(shù)×最高代表值)

番茄抗性評價(jià)指標(biāo)：

(1)病情指數(shù)(DI，disease index)：DI=0為免疫(I，Immunity)；0

(2)卵塊數(shù)量(EM，egg mass·g-1)：EM=0為免疫(I)；0

卵塊數(shù)量調(diào)查：卵塊染色參照Omwega等[16]方法，用75 mg·L-1亮藍(lán)染色30 min后用自來水沖洗掉多余染料，然后調(diào)查每株根部的卵塊總數(shù)，之后用吸水紙將根系表面多余的水吸走，測整個(gè)根系的重量，計(jì)算每克根內(nèi)卵塊數(shù)量。

(3)卵的繁殖系數(shù)(RF，Reproduction factor)：RF=每株根系的總卵量/最初接種量。RF=0為免疫(I)；0

根內(nèi)卵的提?。簠⒄胀貊矽i等[14]方法，計(jì)算每克根內(nèi)卵量。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄品種對南方根結(jié)線蟲侵染后的抗性評價(jià)

從M．incognita侵染后的根部癥狀看，參試21個(gè)番茄品種的抗感反應(yīng)有明顯的差異(表2)?？剐詫φ誚FNT所有植株均未發(fā)病，表現(xiàn)為免疫；紅春桃和水果番茄的病情指數(shù)分別為12和20，表現(xiàn)為抗??；奧冠1號、紫玫瑰和齊研矮粉的病情指數(shù)分別為82、80和77.5，表現(xiàn)為高感；其余16個(gè)番茄品種的病情指數(shù)均在51～75，對南方根結(jié)線蟲侵染的癥狀均表現(xiàn)為感病。

不同番茄品種根部卵塊數(shù)量差異很大(表2)。紅春桃和VFNT根部未有卵塊，表現(xiàn)為免疫；水果番茄每克根平均卵塊數(shù)量為3.57個(gè)，表現(xiàn)為高抗；帝皇紅櫻桃、黃皮球、紫草莓、綠羅成和齊研矮粉每克根平均卵塊數(shù)量均超過100個(gè)，表現(xiàn)為高感；其余14個(gè)品種每克根卵塊數(shù)均在51～100個(gè)，表現(xiàn)為感病品種。

表2 不同番茄品種對南方根結(jié)線蟲的抗性評價(jià)Table 2 Evaluation of tomato resistance to Meloidogyne incognita

線蟲卵的繁殖系數(shù)，紅春桃和VFNT根部均未提取到卵，表現(xiàn)為免疫；水果番茄根部線蟲卵的繁殖系數(shù)為4.88，表現(xiàn)為抗?。黄溆?9個(gè)品種根部線蟲卵的繁殖系數(shù)為45.2～88.8，表現(xiàn)為感病品種。

總之，21個(gè)番茄品種對M．incognita侵染根系后表現(xiàn)出的抗感性差異很大。從根系的根結(jié)癥狀看，抗性對照VFNT表現(xiàn)為免疫，即該品種抗侵染；紅春桃根系雖然有少量根結(jié)，即有侵染癥狀，但是根部沒有卵塊，根內(nèi)也沒有卵，即線蟲不能繁殖；水果番茄根系有少量根結(jié)，表現(xiàn)為抗病，根部卵塊和卵量很少，表現(xiàn)為抗病，即不利于線蟲繁殖；紫玫瑰和奧冠1號的病情指數(shù)屬于高感，但是根部卵塊數(shù)量和卵的繁殖系數(shù)屬于感病品種；帝皇紅櫻桃、黃皮球、紫草莓、綠羅成和齊研矮粉從根部卵塊數(shù)均表現(xiàn)為高感，說明這5個(gè)品種的根系利于M．incognita的繁殖；其他12個(gè)品種從病情指數(shù)和卵塊數(shù)及卵的繁殖系數(shù)均屬于感病。

2.2 抗南方根結(jié)線蟲的番茄品種含有Mi-1基因的驗(yàn)證

紅春桃和水果番茄對接種北方根結(jié)線蟲后的反應(yīng)與VFNT的反應(yīng)一致，都表現(xiàn)為感病，并且北方根結(jié)線蟲在紅春桃和水果番茄上的繁殖能力更強(qiáng)(表3)，進(jìn)而驗(yàn)證了紅春桃和水果番茄品種具有和VFNT一樣的Mi抗性基因。由于目前商業(yè)可得的品種抗性均是Mi-1，進(jìn)而說明紅春桃和水果番茄含有Mi-1抗性基因。

表3 不同番茄品種對北方根結(jié)線蟲的抗性評價(jià)Table 3 Evaluation of tomato resistance to M.hapla

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)抗南方根結(jié)線蟲的番茄品種較少，僅有紅春桃和水果番茄2個(gè)品種和抗性對照VFNT表現(xiàn)為抗性，通過對北方根結(jié)線蟲表型鑒定為感病說明這兩個(gè)品種含有和VFNT一樣的Mi-1抗性基因。該研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了目前市場上售賣的番茄栽培品種中僅有少數(shù)含有Mi抗性基因，大部分品種都不含Mi基因[17]，即證實(shí)了抗南方根結(jié)線蟲的番茄品種非常缺乏[18]。目前國內(nèi)使用的大部分抗根結(jié)線蟲番茄品種主要是從國外引進(jìn)，該研究中對南方根結(jié)線蟲免疫的VFNT是源于美國的品種，從當(dāng)?shù)睾Y選出的紅春桃和水果番茄對利用抗病品種防治南方根結(jié)線蟲病具有重要應(yīng)用價(jià)值。

品種的抗性鑒定需選擇適宜的環(huán)境溫度、準(zhǔn)確的接種源、合適的苗齡、恰當(dāng)?shù)慕臃N量和接種天數(shù)，以更準(zhǔn)確的獲得品種的抗性水平。南方根結(jié)線蟲在我國發(fā)生較為普遍，并且發(fā)病嚴(yán)重，由于Mi-1抗性對溫度是敏感的，該病的發(fā)生與寄主環(huán)境密切相關(guān)，夏季溫度高時(shí)，品種的抗性會減弱甚至喪失[12]。國外學(xué)者早已關(guān)注抗病育種時(shí)首先要對現(xiàn)有的番茄品種進(jìn)行抗性評價(jià)，但是不同的研究者采用抗性鑒定方法差異較大，主要不同之處在于選用的接種源、接種苗齡、接種量和接種天數(shù)的不同，從而使植株的發(fā)病程度存在差異[17]。如果苗齡小、接種量大會導(dǎo)致抗病(非高抗)變?yōu)楦胁?，失去了材料的真?shí)特性，從而使已有的抗性評價(jià)指標(biāo)失去準(zhǔn)確性，所以抗性評價(jià)指標(biāo)應(yīng)該根據(jù)苗齡、接種量和接種天數(shù)相應(yīng)的進(jìn)行調(diào)整。而品種在田間抗性鑒定時(shí)田間線蟲基數(shù)大小是影響植株抗性表現(xiàn)的主要因素之一，同時(shí)種植樣本數(shù)量越大越能體現(xiàn)品種對田間病原的真實(shí)抗感反應(yīng)。

本研究不僅采用了根結(jié)線蟲的致病參數(shù)(病情指數(shù))評價(jià)番茄品種的抗性水平，還采用了線蟲繁殖參數(shù)(根部卵塊數(shù)和卵的繁殖系數(shù))進(jìn)一步驗(yàn)證番茄的抗性水平，即采用多項(xiàng)指標(biāo)評價(jià)了番茄品種對根結(jié)線蟲病的抗性，通過多項(xiàng)參數(shù)的互相驗(yàn)證，進(jìn)而使評價(jià)結(jié)果更準(zhǔn)確。因不同品種受到南方根結(jié)線蟲侵染脅迫后，植株長勢和相關(guān)抗病指標(biāo)顯示很可能不一致，用單一的鑒定指標(biāo)對其抗病性的準(zhǔn)確性可能會有偏差[19]，21個(gè)番茄品種受根結(jié)線蟲侵染后，根系大小和鮮重明顯不同，通過線蟲繁殖參數(shù)的驗(yàn)證更加準(zhǔn)確。該研究參照Li等[20]的方法也采用了每克根內(nèi)的卵塊數(shù)和卵量，如果僅用根部卵塊數(shù)來評價(jià)抗病性，有時(shí)根部卵塊數(shù)雖然不多，可視為抗病，當(dāng)植株的根系小，換算成每克根的卵塊數(shù)時(shí)可能為感病；有時(shí)卵塊數(shù)多時(shí)，評價(jià)為感病，但其根系大，換算成每克根的卵塊數(shù)則為抗病。

關(guān)于品種對根結(jié)線蟲的抗性評價(jià)指標(biāo)，陳振德等[21]認(rèn)為應(yīng)采用多種指標(biāo)綜合判斷更能準(zhǔn)確評價(jià)其抗病性，如劉華等[22]對番茄產(chǎn)量和收獲后期的根部發(fā)病情況等也進(jìn)行了評價(jià)。但本研究僅對不同品種番茄的苗期進(jìn)行了植株抗性評價(jià)，沒有對植株生長后期和產(chǎn)量影響進(jìn)行評價(jià)。因此，根結(jié)線蟲病的品種抗性鑒定方法應(yīng)該根據(jù)鑒定的目的、需求和鑒定場所，如盆栽或田間的實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整，綜合參考評價(jià)指標(biāo)更科學(xué)、更準(zhǔn)確。