尖葉假龍膽不同組分對(duì)酒精性肝損傷模型大鼠的保護(hù)作用研究

卜義凡 樸圣愛(ài) 李紫薇 胡曉陽(yáng)

作者單位:150000 哈爾濱,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[卜義凡(碩士研究生)、李紫薇(碩士研究生)、胡曉陽(yáng)];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒一科(樸圣愛(ài))

酒精性肝損傷(alcoholic liver disease,ALD)是由于過(guò)量攝入酒精導(dǎo)致的肝臟相關(guān)疾病的總稱,主要表現(xiàn)形式有酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化,四種表現(xiàn)形式可單獨(dú)或混合存在[1]。目前ALD治療方法較為局限,一般為戒酒和對(duì)癥治療,晚期主要為肝移植。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)憑借整體審查、辨證論治的特點(diǎn),在ALD防治方面具有一定優(yōu)勢(shì)。尖葉假龍膽是蒙醫(yī)學(xué)中清熱解毒、利膽退黃的藥物,其味苦、性涼,常用來(lái)治療黃疸、肝炎等疾病,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其有保肝、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎和抗氧化等作用[2-3]。課題組在前期研究中已證實(shí)了尖葉假龍膽對(duì)ALD的治療作用[4-5],本研究主要探索尖葉假龍膽各組分拮抗ALD效果,通過(guò)建立慢性ALD大鼠模型,用滲漉法分離尖葉假龍膽的不同組分,測(cè)定其對(duì)ALD模型大鼠脂代謝系統(tǒng)、氧化—抗氧化系統(tǒng)、乙醇代謝酶、炎性細(xì)胞因子等指標(biāo)的影響以及觀察肝臟病理變化來(lái)驗(yàn)證尖葉假龍膽不同組分的護(hù)肝作用效果并分析其對(duì)肝臟的保護(hù)機(jī)理,確定其中作用效果最優(yōu)的組分,從而為今后對(duì)酒精性肝損傷的預(yù)防與治療提供新的思路,并為尖葉假龍膽的更深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量為180～220 g之間,購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證編號(hào):SCXK(黑)2018-001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室,實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行。

1.2 藥品與試劑

蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制);56°紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司,批號(hào)20180524);烏拉坦(上海山浦化工有限公司,批號(hào)20180917);谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、白介素8(interleukin-8,IL-8)、白介素10(interleukin-10,IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factorβ,TGF-β1)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)ELISA試劑盒(購(gòu)自上海素爾生物科技股份有限公司,貨號(hào)20181202B、20180906、DECO0195、DRE20142、DECO0008、DEE20030、DECO0007、DEE20031、 DEE20033、 DEE20035、 E04727r-1、03148B、03739B)。尖葉假龍膽全草(保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)的方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室,購(gòu)自黑龍江省大興安嶺地區(qū),經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為龍膽科假龍膽屬的尖葉假龍膽植物的干燥全草);復(fù)方蛋氨酸膽堿片(白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠,批號(hào)17050158)。

1.3 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,RE52CS-1);循環(huán)水真空泵(鄭州長(zhǎng)盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,SHB-Ⅲ);恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠,B-260);中藥材粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司,FY130);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司,JH3102);滲漉筒(自制);超薄切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司,2135);顯微影像成像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)公司,Moticam3000);全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)M.D公司,Glamour 2000);臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司,Mikro22/22R);紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津制作所,UV-2550);多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司,Infinite M200 pro)。

1.4 藥液制備

尖葉假龍膽全草以10倍量蒸餾水浸泡1小時(shí)后,煎煮藥物1小時(shí),過(guò)濾藥渣,取其水煎液,再將過(guò)濾后的藥渣以10倍量的水加熱回流提取0.5小時(shí),過(guò)濾藥渣,取其水煎液,將兩次取得的藥液合并,于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中將合并后的提取液減壓濃縮成浸膏,加入適量的蒸餾水稀釋成濃度為0.5 g/mL藥液,冷藏備用,為實(shí)驗(yàn)中全草組使用藥物。取尖葉假龍膽全草600 g粉碎成粗粉,10倍量蒸餾水密閉浸泡24小時(shí)。將藥材粗粉加入滲漉筒,均勻壓平,分別以蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇十倍體積洗脫,收集洗脫液進(jìn)行減壓濃縮成浸膏,再加適量蒸餾水稀釋成相同體積的稀釋液備用。將復(fù)方蛋氨酸膽堿片粉碎后用蒸餾水稀釋成0.04 g/mL的溶液。

1.5 造模與分組

80只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組、全草組、水洗脫組、30%乙醇洗脫組、60%乙醇洗脫組及90%乙醇洗脫組共8組。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M人類飲酒習(xí)慣,采取梯度酒精灌胃配合高脂飼料喂養(yǎng)造模,實(shí)驗(yàn)第1周,除空白組外,各組大鼠以8 mL/kg的56°紅星二鍋頭灌胃。第2周開(kāi)始,各組大鼠給予的酒精量每周遞增1 mL/kg,至第8周酒精灌胃量達(dá)到15 mL/kg,空白組大鼠則全程給予相同體積的生理鹽水灌胃,同時(shí)空白組大鼠予以普通飼料喂養(yǎng),其余各組以普通飼料與高脂飼料每隔一日交替喂養(yǎng)。由于長(zhǎng)期酒精灌胃導(dǎo)致動(dòng)物死亡無(wú)可避免,造模過(guò)程中模型組和60%乙醇洗脫組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別死亡3只,陽(yáng)性藥組、全草組、30%乙醇洗脫組分別死亡2只,水洗脫組與90%乙醇洗脫組分別死亡1只。

1.6 給藥方法

實(shí)驗(yàn)第5周至第8周除空白組和模型組外,其余各組均通過(guò)灌胃法給予實(shí)驗(yàn)大鼠相應(yīng)的藥物。為了模擬人類飲酒和用藥的過(guò)程,并為大鼠消化吸收留出相應(yīng)的時(shí)間,每日給藥與酒精灌胃錯(cuò)時(shí)6小時(shí),即采取于上午給予酒精造模而下午(間隔6小時(shí))給予藥物灌胃的方法,給藥體積為10 mL/kg。具體方法為:陽(yáng)性藥組給予復(fù)方蛋氨酸膽堿片稀釋液(0.04 g/mL)10 mL/kg進(jìn)行灌胃,全草組給予尖葉假龍膽全草水煎稀釋液10 mL/kg,水洗脫組給予尖葉假龍膽水洗脫液10 mL/kg,30%乙醇洗脫組給予尖葉假龍膽30%乙醇洗脫液10 mL/kg,60%乙醇洗脫組給予尖葉假龍膽60%乙醇洗脫液10 mL/kg,90%乙醇洗脫組給予尖葉假龍膽90%乙醇洗脫液10 mL/kg,空白組和模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃。陽(yáng)性藥組給藥量相當(dāng)于復(fù)方蛋氨酸膽堿片0.4 g/kg,其余各實(shí)驗(yàn)組給藥量相當(dāng)于尖葉假龍膽生藥材5 g/kg。

1.7 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及脂代謝的影響 末次給藥6小時(shí)后禁食水,12小時(shí)后腹腔注射20%濃度的烏拉坦溶液(0.5 mL/100 g)麻醉,腹主動(dòng)脈采血,離心機(jī)配平后條件設(shè)置為4℃、3500 r/min,離心10分鐘,分離血清,按照試劑盒要求的操作方法于全自動(dòng)生化儀分析血清中ALT、AST、TG、TC含量。

1.7.2 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠炎性細(xì)胞因子的影響 末次給藥6小時(shí)后禁食水,12小時(shí)后腹腔注射20%濃度的烏拉坦溶液(0.5 mL/100g)麻醉,腹主動(dòng)脈采血,離心機(jī)配平后條件設(shè)置為4℃、3500 r/min,離心10分鐘,分離血清,按照試劑盒要求的操作方法于全自動(dòng)生化儀分析血清中IL-6、IL-8、IL-10和TGF-β1含量。

1.7.3 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠肝臟指數(shù)和肝組織病理形態(tài)的影響 末次給藥6小時(shí)后禁食水,12小時(shí)后將大鼠逐一稱重,腹腔注射20%烏拉坦溶液(0.5 mL/100 g)麻醉,將整個(gè)肝臟取出并用生理鹽水沖洗。用濾紙將整個(gè)肝臟吸干,電子天平稱重,計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)計(jì)算公式為:肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重×100%。剪取3 mm3左右大小的肝臟組織,戊二醛固定后常規(guī)漂洗、逐級(jí)脫水、包埋、固化后切片,片厚6μm,電鏡下觀察肝組織形態(tài)。

1.7.4 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響 肝組織經(jīng)甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片等常規(guī)處理后,按照試劑盒說(shuō)明操作,采用SP兩步法進(jìn)行免疫組化染色,400倍顯微鏡下觀察。染色評(píng)分計(jì)算方法:染色總分=染色強(qiáng)度×染色面積,染色強(qiáng)度以無(wú)染色記0分,輕度著色記1分,重度著色記3分;染色面積以陽(yáng)性細(xì)胞著色記分,無(wú)染色記0分,低于10%記1分,10%～50%記2分,50%～80%記3分,高于80%記4分。

1.7.5 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響 剪取約1 g肝組織置于加入9 g生理鹽水的勻漿器中,充分研磨得到10%的肝組織勻漿液。將肝組織勻漿液在4℃,3500 r/min條件下離心10分鐘,取上清液,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,測(cè)定肝組織中MDA、SOD、GSH、ADH、ALDH含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)選用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理,實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料均符合正態(tài)分布且方差齊,故統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用Dunnett's檢驗(yàn),以P＜0.05有顯著性差異,P＞0.05則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶及脂代謝的影響

如表1所示,相較空白組,模型組大鼠血清中ALT、AST、TG和TC含量顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相較模型組,陽(yáng)性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組和90%乙醇洗脫組ALT、AST、TG和TC值均降低,具有顯著差異(P＜0.05);在降低TG值方面90%乙醇洗脫組優(yōu)于全草組、水洗脫組、30%乙醇洗脫組和60%乙醇洗脫組(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其AST和TC的含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠轉(zhuǎn)氨酶及脂代謝的影響(±s)

表1 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠轉(zhuǎn)氨酶及脂代謝的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05;與90%乙醇洗脫組相比,c P＜0.05。

組別 鼠只 ALT(U/L) AST(U/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L)空白組 10 31.56±4.99 20.18±6.25 4.30±0.47 4.04±0.83模型組 7 64.53±3.99a 46.58±5.61a 7.85±0.61a 7.36±0.45a陽(yáng)性藥組 8 37.10±5.66b 24.11±6.38b 4.86±0.59b 4.58±1.06b全草組 8 45.87±7.43b 34.26±8.88b 6.08±0.78bc 5.72±1.02b水洗脫組 9 54.76±10.02bc 37.96±7.36 6.84±0.65bc 6.25±1.02 30%乙醇洗脫組 8 55.65±5.10bc 39.48±6.59 6.77±0.48bc 6.43±0.45 60%乙醇洗脫組 7 47.40±5.43b 32.98±6.07b 5.95±0.49bc 5.58±0.89b 90%乙醇洗脫組 9 39.56±5.37b 26.76±6.19b 5.12±0.47b 4.87±0.98 b

2.2 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠炎性細(xì)胞因子的影響

如表2所示,與空白組相比,模型組血清IL-6、IL-8和TGF-β1含量升高,IL-10含量降低,具有顯著差異(P＜0.05)。相較模型組,陽(yáng)性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組和90%乙醇洗脫組IL-6、IL-8和TGF-β1含量降低,IL-10含量升高,具有顯著差異(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其IL-8和IL-10含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠細(xì)胞因子的影響(±s,pg/mL)

表2 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠細(xì)胞因子的影響(±s,pg/mL)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05;與90%乙醇洗脫組相比,c P＜0.05。

組別 鼠只 IL-6 IL-8 IL-10 TGF-β1 7±249.85模型組 7 131.83±12.87a 202.80±45.62a 31.91±6.96a 1738.64±215.19a陽(yáng)性藥組 8 67.95±6.55b 97.80±43.96b 54.46±7.18b 857.40±226.80b全草組 8 85.27±11.32b 132.49±44.88b 45.44±7.27b 1194.77±317.31b水洗脫組 9 110.67±14.03bc 152.31±41.40 40.24±8.98 1384.22±247.00bc 30%乙醇洗脫組 8 107.94±11.55bc 161.31±47.23 40.05±6.80 1397.11±230.25bc 60%乙醇洗脫組 7 90.74±10.74bc 134.49±46.46b 46.36±7.18b 1193.48±239.54b 90%乙醇洗脫組 9 75.45±10.36b 106.83±45.16b 52.15±7.10b 974.38±243.71空白組 10 58.96±10.30 80.83±46.95 58.06±7.10 768.1 b

2.3 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠肝臟指數(shù)和肝組織病理形態(tài)的影響

如表3所示,與空白組相比,模型組的肝臟指數(shù)升高,具有顯著差異(P＜0.05)。與模型組相比,陽(yáng)性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組肝臟指數(shù)降低,具有顯著差異(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其肝臟指數(shù)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s)

表3 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 肝臟指數(shù)(%)10 2.49±0.18模型組 7 2.83±0.32a陽(yáng)性藥組 8 2.58±0.10b全草組 8 2.54±0.15b水洗脫組 9 2.73±0.24 30%乙醇洗脫組 8 2.63±0.26 60%乙醇洗脫組 7 2.50±0.11b 90%乙醇洗脫組 9 2.57±0.18空白組b

肝組織形態(tài)見(jiàn)圖1。空白組核型正常,線粒體正常。模型組線粒體明顯變形,核型不整。陽(yáng)性藥組形態(tài)相對(duì)較好,溶酶體增多,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多。全草組線粒體輕度腫脹,核型不整,脂滴略多。水洗脫組肝細(xì)胞核固縮,線粒體增多,脂滴多。30%乙醇洗脫組線粒體輕度腫脹,核型不整,脂滴增多。60%乙醇洗脫組線粒體輕度腫脹,核型不整。90%乙醇洗脫組核型基本正常,線粒體輕度腫脹,可見(jiàn)少量脂滴。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織病理形態(tài)變化(透射電鏡,×10000)

2.4 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

如表4所示,與空白組相比,模型組TNF-α和ICAM-1染色評(píng)分升高,具有顯著差異(P＜0.05)。與模型組相比,陽(yáng)性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組TNF-α和ICAM-1染色評(píng)分降低,具有顯著差異(P＜0.05)。水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,其變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響(±s,分)

表4 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響(±s,分)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

ICAM-1空白組組別 鼠只 TNF-α 10 1.40±0.52 1.30±0.48模型組 7 8.14±1.46 a 7.00±2.00 a陽(yáng)性藥組 8 1.63±0.52 b 1.63±0.74 b全草組 8 2.88±1.25 b 2.88±0.99 b水洗脫組 9 5.44±1.67 5.44±1.67 30%乙醇洗脫組 8 5.38±1.77 5.88±1.55 60%乙醇洗脫組 7 2.86±1.07 b 3.14±0.90 b 90%乙醇洗脫組 9 1.89±0.93 b 1.67±0.71 b

TNF-α染色各組肝細(xì)胞呈不同程度陽(yáng)性反應(yīng),陽(yáng)性物質(zhì)主要分布于胞漿,呈棕黃色細(xì)顆粒狀,見(jiàn)圖2。ICAM-1染色各組肝細(xì)胞呈不同呈度的陽(yáng)性反應(yīng),陽(yáng)性物質(zhì)主要表達(dá)于肝細(xì)胞膜,部分肝細(xì)胞漿染色陽(yáng)性,呈棕黃色細(xì)顆粒狀,見(jiàn)圖3。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組大鼠TNF-α染色情況(×400)

圖3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠ICAM-1染色情況(×400)

2.5 尖葉假龍膽不同組分對(duì)ALD大鼠氧化—抗氧化系統(tǒng)的影響

如表5所示,與空白組相比,模型組肝組織MDA升高,SOD、GSH、ADH和ALDH降低,具有顯著差異(P＜0.05)。與模型組相比,陽(yáng)性藥組、全草組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組肝組織MDA降低,SOD、GSH、ADH和ALDH升高,具有顯著差異(P＜0.05),尤以陽(yáng)性藥組和90%乙醇洗脫組效果最好;水洗脫組和30%乙醇洗脫組作用效果較弱,水洗脫組SOD、GSH和ALDH含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),30%乙醇洗脫組SOD含量變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表5 不同組分對(duì)ALD模型大鼠氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響(±s,U/mg)

表5 不同組分對(duì)ALD模型大鼠氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響(±s,U/mg)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05;與90%乙醇洗脫組相比,c P＜0.05。

組別 鼠只 SOD GSH(ng/mg) MDA(nmol/mg) ADH(U/mg) ALDH(U/mg).11 184.76±13.08模型組 7 25.51±4.06a 0.73±0.12a 0.91±0.05a 137.91±18.04a 91.18±9.58a陽(yáng)性藥組 8 40.39±4.06b 1.34±0.11b 0.51±0.05b 254.34±13.05b 159.59±7.71b全草組 8 33.69±3.93b 1.18±0.06b 0.69±0.11bc 222.52±13.86bc 143.78±10.85b水洗脫組 9 29.03±5.44 0.86±0.12 0.79±0.09bc 168.03±11.28bc 104.11±10.61 30%乙醇洗脫組 8 29.55±4.86 0.92±0.14bc 0.78±0.08bc 174.54±15.33bc 114.70±15.93bc 60%乙醇洗脫組 7 35.45±3.18b 1.19±0.17b 0.70±0.07bc 228.51±17.78bc 139.44±15.99bc 90%乙醇洗脫組 9 38.28±5.82b 1.32±0.14b 0.55±0.09b 252.29±24.27b 160.21±22.01空白組 10 42.36±3.87 1.58±0.11 0.44±0.06 298.96±20 b

3 討論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,尖葉假龍膽具有清熱解毒、利膽退黃等功效,臨床中常用于治療黃疸、肝炎等病;現(xiàn)代研究表明,尖葉假龍膽主要化學(xué)成分為酮類化合物、萜類化合物、木脂素類化合物、黃酮類化合物和甾體類化合物,具有保肝、抗炎、抗氧化、抗心律失常、抗心肌缺血、抗腫瘤、降糖等藥理作用[2-3],并且前期研究已證實(shí)尖葉假龍膽水煎液能通過(guò)降低轉(zhuǎn)氨酶、調(diào)節(jié)脂代謝系統(tǒng)、減少氧化損傷等途徑發(fā)揮對(duì)ALD的保護(hù)作用[4-5],因此本研究具有充分的中醫(yī)學(xué)理論依據(jù)和藥理學(xué)研究基礎(chǔ)。然而,僅僅研究尖葉假龍膽飲片層面的效用,存在化學(xué)物質(zhì)繁雜、作用機(jī)制難以明確以及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)不易把握等問(wèn)題,制約了臨床療效,阻礙了其現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)應(yīng)用。因此本研究選擇對(duì)其組分層面的作用效果進(jìn)行探索,以期為未來(lái)進(jìn)一步深入研究,開(kāi)發(fā)藥效物質(zhì)與作用機(jī)制相對(duì)明確的現(xiàn)代中藥奠定基礎(chǔ)。

既往研究認(rèn)為ALD與過(guò)量攝入乙醇所引起的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂代謝障礙、線粒體功能障礙、內(nèi)毒素等多因素有關(guān)。長(zhǎng)期大量攝入酒精可能導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂和肝細(xì)胞微管創(chuàng)傷,脂肪和分泌性蛋白在肝細(xì)胞內(nèi)堆積,導(dǎo)致肝臟指數(shù)升高[6]。肝臟受到損傷時(shí),肝細(xì)胞膜通透性增高,肝細(xì)胞內(nèi)的AST和ALT會(huì)順濃度差釋放入血,導(dǎo)致血液中ALT和AST升高。結(jié)合本研究結(jié)果來(lái)看,尖葉假龍膽組分能夠降低肝臟指數(shù),改善肝組織形態(tài),降低ALT、AST、TG和TC含量,提示其能通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝系統(tǒng)和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)氨酶發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

乙醇在代謝中產(chǎn)生的乙醛會(huì)打破機(jī)體中原本的氧化系統(tǒng)與過(guò)氧化系統(tǒng)之間的平衡出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài),肝組織中具有細(xì)胞毒性的氧化產(chǎn)物MDA升高,抗氧化物質(zhì)GSH和SOD含量下降,機(jī)體抗氧化能力減弱,清除自由基能力下降,也會(huì)使肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[7]。此外,酒精的代謝主要在ADH系統(tǒng)和ALDH系統(tǒng)參與下完成,ADH和ALDH含量降低,使乙醇和乙醛代謝速率下降,使乙醛堆積并產(chǎn)生乙醛蛋白加合物導(dǎo)致肝損傷[8]。本研究中,尖葉假龍膽組分能夠降低MDA含量,提高抗氧化物質(zhì)和代謝酶含量,提示其能夠通過(guò)調(diào)節(jié)氧化-抗氧化系統(tǒng),加速酒精代謝達(dá)到拮抗ALD的作用。

與炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子在ALD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。酒精導(dǎo)致IL-6和IL-8刺激肝臟中的成纖維細(xì)胞、貯脂細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子,介導(dǎo)肝中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),導(dǎo)致肝臟組織發(fā)生炎癥反應(yīng)、脂肪堆積和纖維化[9-10];過(guò)量TNF-α可誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷和凋亡,乙醇可以刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量TNF-α;TGF-β1是學(xué)界公認(rèn)的導(dǎo)致纖維化的最強(qiáng)的一種細(xì)胞因子,能導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚,使肝細(xì)胞死亡、組織纖維化;ICAM-1是免疫球蛋白超家族的粘附分子中的一員[11],能介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和肝竇內(nèi)膜的黏附作用,然后向肝內(nèi)浸潤(rùn),通過(guò)微循環(huán)障礙造成肝臟的損傷[12-15]。IL-10作為抑炎細(xì)胞因子,能抑制炎癥損傷拮抗ALD的發(fā)展。本研究中,尖葉假龍膽各組分能降低炎性因子含量,抑制TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá),提升抑炎因子含量,提示其可能提高調(diào)節(jié)炎性因子水平,減輕炎癥反應(yīng),從而改善ALD。

綜上所述,用滲漉法分離提取出的尖葉假龍膽組分對(duì)ALD有拮抗作用,不同組分作用效果有所差異,其中最優(yōu)組分為90%乙醇洗脫組,其次為60%乙醇洗脫組和全草組,30%乙醇洗脫組和水洗脫組效果最弱,甚至對(duì)某些指標(biāo)無(wú)效。尖葉假龍膽組分拮抗ALD機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝系統(tǒng),促SOD、GSH生成,降低MDA,促進(jìn)ADH、ALDH分泌,提高酒精代謝率,平衡氧化-抗氧化系統(tǒng),抑制IL-6、IL-8、TGF-β1等促炎細(xì)胞因子生成,促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的生成以及抑制TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)從而發(fā)揮作用。