不同位置動脈超灌注與靜脈超引流對大鼠三跨區(qū)皮瓣成活的影響

肖棟超，竺楓，李俊杰，李斯宏，王欣，章偉文

跨區(qū)穿支皮瓣面積較大，利用跨區(qū)皮瓣覆蓋創(chuàng)面是目前臨床上治療大面積皮膚缺損的主要手術方案?？鐓^(qū)皮瓣包含多個血管體區(qū)，“血管體（angiosomes）”由Taylor 等[1]于1987 年首先提出，指某一源動脈呈樹形分布的所有解剖學區(qū)域，包括皮膚、淺筋膜、深筋膜及其深層各種組織的一個三維立體結構。各血管體區(qū)之間連接的是管徑逐漸減小而互相吻合的血管網(wǎng)，稱之為“choke 區(qū)”血管[2]，choke 區(qū)血管在跨區(qū)皮瓣成活過程中扮演著重要角色[3]。以一側(cè)的主血管蒂單方向供血，跨區(qū)皮瓣往往僅能存活兩個多血管體區(qū)，與主血管體區(qū)相隔兩個choke區(qū)的血管體區(qū)會發(fā)生部分壞死，因此三跨區(qū)皮瓣是目前研究跨區(qū)皮瓣成活率的基本單元。Cormack 等[4]將三跨區(qū)皮瓣上主血管蒂直接分布的血管供區(qū)稱之為解剖學供區(qū)，與其相鄰一到兩個choke 區(qū)的血管供區(qū)分別稱為動力學供區(qū)與潛在供區(qū)，潛在供區(qū)容易發(fā)生部分壞死。

跨區(qū)皮瓣面積較大，超過了單血管蒂的供血范圍，因此需要在遠端進行額外的血管吻合來提高皮瓣成活率。目前已有大量研究表明動脈超灌注及靜脈超引流能明顯提高皮瓣成活率[5]，但是究竟哪種技術效果更好，目前國內(nèi)外尚存在不同報道。因此有必要進一步探索并比較在各個供區(qū)進行動脈超灌注及靜脈超引流對于三跨區(qū)皮瓣成活的重要性，以便更好的利用該技術提高跨區(qū)皮瓣的成活率。

本研究擬通過建立大鼠背側(cè)三跨區(qū)皮瓣模型，對不同位置動脈超灌注與靜脈超引流在大鼠三跨區(qū)皮瓣存活影響進行研究，探索如何更好地利用這兩種技術，提高跨區(qū)皮瓣的成活率，為臨床上跨區(qū)皮瓣術中吻合血管的策略上提供借鑒指導，報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性300～400 g 的SD大鼠50 只，購自浙江省醫(yī)學動物中心，由寧波大學動物中心飼養(yǎng)。

1.2 方法 隨機平均分成5 組，每組10 只。用5%的水合氯醛按6 mg/kg 的劑量進行腹腔注射麻醉，剃毛機剔除大鼠背側(cè)后正中線右側(cè)的毛，大鼠手術臺固定。用標記筆在大鼠背部右側(cè)描繪出三跨區(qū)皮瓣的輪廓，皮瓣上緣為肩胛下角水平，下緣為髂后上棘水平，后正中線為內(nèi)側(cè)緣，外側(cè)緣平行于內(nèi)側(cè)緣，呈一個約3 cm×13 cm 大小的矩形[6]。消毒、鋪巾，沿后正中線向外側(cè)掀起皮瓣，鈍性分離三穿支周圍的筋膜，使其只剩下三穿支血管。然后，構建均以旋髂深動靜脈為主血管蒂的5 組不同類型超引流或超灌注的三跨區(qū)皮瓣（封二彩圖1～3）：實驗組A，遠端僅保留動力學供區(qū)的肋間后動脈；實驗組B，遠端僅保留動力學供區(qū)的肋間后靜脈；實驗組C，遠端僅保留潛在供區(qū)的胸背動脈；實驗組D，遠端僅保留潛在供區(qū)的胸背靜脈；對照組E，遠端不保留任何血管。經(jīng)上述處理后，所有皮瓣原位縫合。上述操作均需符合無菌原則，術后單籠飼養(yǎng)，抗生素維持3 d。

圖1 實驗分組情況

圖2 大鼠背側(cè)三跨區(qū)解剖示意圖

圖3 左圖為顯微鏡下結扎動脈，右圖為結扎靜脈

1.3 觀察指標

1.3.1 皮瓣存活面積統(tǒng)計 術后7 d，將所有大鼠腹腔麻醉后，用佳能相機拍攝大鼠三跨區(qū)皮瓣，圖片導入ImageJ 軟件分析皮瓣成活率，其中皮瓣的成活面積按照皮瓣壞死標準[7]（皮瓣結痂發(fā)黑，干性壞死、組織回縮、彈性差，質(zhì)地堅硬，切割不出血）來測算，皮瓣成活率=皮瓣成活表面積/皮瓣總表面積×100%。

1.3.2 皮瓣術后造影 每組選取3 只大鼠，腹腔麻醉后，頸胸部進行剃毛處理，仰臥位，四肢固定于鼠板上，分離出一側(cè)的頸動脈，22-規(guī)格容量留置針穿入頸動脈，放血排盡大鼠體內(nèi)血液，同時注入1%肝素1.5 ml，采用20 ml注射器將配置好的明膠氧化鉛混合物以一定壓力緩慢注入頸動脈，邊灌注邊觀察，觀察到大鼠角膜及四肢末梢顯現(xiàn)出點狀、斑片狀灌注液顏色時，即停止灌注。然后將標本置于4 ℃冰箱冷藏過夜，以便明膠凝結。第二天將大鼠跨區(qū)皮瓣取下，拍攝X 線片，觀察各組皮瓣微血管形態(tài)。

1.3.3 免疫組化CD31 染色 術后7 d，將多聚甲醛固定的choke II 樣本切分為5m。在二甲苯脫羧后，用乙醇分級復水。然后，切片浸入3%的H2O2中，孵育至非特異性位點飽和，最后用CD31 抗體孵育。切片在低倍鏡下找到微血管密集區(qū)，然后在X100 倍光鏡下隨意選取5 個視野，每個視野對微血管的數(shù)量進行計數(shù)，計算出單位面積微血管密度（/mm2）。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析和t 檢驗。P ＜0.05 位差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組皮瓣成活率的比較 術后7 d，A～E 組皮瓣成活率分別為為（95.9±2.2）%、（84.4±3.5）%、（98.3±0.8）%、（85.5±3.3）%、（70.0±3.9）%。對照組E皮瓣存活率均低于其他各組（均P ＜0.05）。同一位置的超引流及超灌注組（A與B、C與D）皮瓣成活率差異有統(tǒng)計學意義（t=8.72、12.04，均P ＜0.05）；不同位置的同一種技術（A與C、B與D）皮瓣存活率差異無統(tǒng)計學意義（t=3.12、0.70，均P ＞0.05）。見封二彩圖4。

圖4 術后各組皮瓣成活對比

2.2 各組皮瓣造影比較 在進行明膠氧化鉛造影之后，發(fā)現(xiàn)各組進行動脈超灌注或是靜脈超引流后在微血管的透亮區(qū)面積上均大于對照組E，對照組跨區(qū)皮瓣的潛在供區(qū)有相當一部分已無血管分布。兩組靜脈超引流組的choke II 區(qū)以遠的微血管分布相對于同一位置的動脈超灌注組，均存在結構更紊亂、微血管更稀疏的特點。見封二彩圖5。

圖5 各組術后造影

2.3 各組choke II 微血管密度的比較 術后7 d，對照組E 微血管密度（2.6±1.1）mm2均低于其他各組（均P ＜0.05），同一位置的動脈超灌注組與靜脈超引流組中，肋間動脈超灌注組A（14.0±2.2）mm2與肋間靜脈超引流組B（6.8±1.3）mm2相比差異有統(tǒng)計學意義（t=6.22，P ＜0.05），胸背動脈超灌注組C 組（13.8±1.5）mm2與胸背靜脈超引流組D組（7.6±1.5）mm2相比差異有統(tǒng)計學意義（t=6.53，P ＜0.05）。不同位置的同一種技術進行比較（A 組與C 組、B 組與D組）差異均無統(tǒng)計學意義（t=0.16、0.89，均P＞0.05）。見封二彩圖6。

圖6 各組CD31 免疫組化圖（CD31 染色，比例尺為100 m）

3 討論

跨區(qū)皮瓣目前在修復大面積皮膚缺損上發(fā)揮了重要作用。然而，跨區(qū)皮瓣因面積較大而壞死率高的問題仍無法得到充分解決。目前關于提高跨區(qū)皮瓣成活率的研究有很多[8]，動脈超灌注及靜脈超引流是提高跨區(qū)皮瓣成活率的有效措施，1994 年Ueda 等[9]通過在大鼠下腹部環(huán)形四跨區(qū)皮瓣的動力學供區(qū)分別進行吻合動脈及靜脈，發(fā)現(xiàn)動脈超灌注比靜脈超引流更能提高皮瓣成活率；而2016 年Zheng 等[10]通過在大鼠背側(cè)兩個半跨區(qū)皮瓣的動力學供區(qū)分別吻合動脈及靜脈，得出靜脈超引流效果更佳。但是如何更好的利用這兩種技術仍有待進一步探索。本研究旨在研究在不同位置進行靜脈超引流及動脈超灌注對皮瓣成活的影響，尋找一種相對有效的降低皮瓣壞死率的措施。

本實驗所利用的大鼠背側(cè)三跨區(qū)皮瓣模型是目前國內(nèi)外比較成熟且常用的動物模型，該模型最早于1992 年由Taylor 等報道提出[11]。Cormack 等[4]曾按蒂部穿支血管遠近將跨區(qū)皮瓣血管體分為解剖學、血流動力學、潛在供區(qū)，因此該三血管體跨區(qū)皮瓣中肋間后動脈及胸背動脈所分布的血管體區(qū)域分別是旋髂深動脈的血流動力學供區(qū)與潛在供區(qū)。Syed等[12]總結出該跨區(qū)皮瓣模型具有以下優(yōu)點：（1）該模型皮瓣為單側(cè)，因此1 只大鼠可以兩側(cè)同時利用，減少了樣本量；（2）皮瓣位于大鼠背側(cè)，便于手術操作、觀察及拍照記錄；（3）皮瓣解剖特點決定該皮瓣模型可以用于軸型及隨意兩種皮瓣的研究。

本實驗發(fā)現(xiàn)不同位置進行靜脈超引流及動脈超灌注這兩種技術對三跨區(qū)皮瓣成活的影響是不盡相同的，三跨區(qū)皮瓣中，主血管蒂旋髂深血管能跨越一個choke 區(qū)完全供應到動力學供區(qū)，且能跨越第二個choke 區(qū)供養(yǎng)到部分潛在供區(qū)，但遠端仍然會出現(xiàn)一定壞死[13]，因此不同位置進行超引流及超灌注來提高三跨區(qū)皮瓣存活率具備差異區(qū)分度。術后7d，無論是動脈超灌注組（A與C）還是靜脈引流組（B與D），相對于對照組E跨區(qū)皮瓣的存活率均明顯增加，證明這兩種技術均有利于提高跨區(qū)皮瓣的成活率，這與先前對這兩種技術所做的研究得出的結論是一致的[14-15]。在血管造影及組織學上，對照組E在choke II 區(qū)的遠端有相當一部分已無微血管分布，choke II區(qū)的微血管密度相對于其他組明顯較小，這均造成了皮瓣遠端的壞死。同一位置的動脈超灌注與靜脈超引流進行比較（A 與B，C 與D 之間），不論是在動力學供區(qū)還是潛在供區(qū)，動脈超灌注均較靜脈超引流更能提高皮瓣成活率，choke II 區(qū)的微血管密度更高，這充分說明了動脈超灌注較靜脈超引流更能提高跨區(qū)皮瓣成活率。兩組動脈超灌注組（A 與C）的皮瓣動脈供血都是充足的，但這兩組均只保留了解剖學供區(qū)的單靜脈進行引流，最終皮瓣基本都完全存活，說明皮瓣靠單根靜脈的跨區(qū)引流是足夠皮瓣成活的。兩組靜脈超引流組（B 與D）的皮瓣成活率雖然大于對照組E，但均出現(xiàn)了一定壞死，額外吻合的靜脈以及解剖學供區(qū)的靜脈保證了整塊跨區(qū)皮瓣的引流，但皮瓣的超引流不足以促進解剖學供區(qū)的動脈供應到整塊皮瓣，以致于跨區(qū)皮瓣出現(xiàn)動脈供血不足，在遠端出現(xiàn)壞死。不同位置的同一種技術進行比較（A 與C、B 與D），兩組動脈超灌注組的跨區(qū)皮瓣均基本成活，而另兩組靜脈超引流組的皮瓣均有一定壞死。而Chang 等[16-17]利用大鼠環(huán)形四跨區(qū)皮瓣研究在不同遠近位置進行動脈超灌注或靜脈超引流對跨區(qū)皮瓣成活的影響，發(fā)現(xiàn)動脈超灌注或靜脈超引流距離主血管蒂越遠跨區(qū)皮瓣成活率越好，這與本實驗同一技術在三跨區(qū)皮瓣上遠近效果對比有一定差距。原因可能是本實驗所做的是三跨區(qū)皮瓣，在比較動脈超灌注時，額外吻合的動脈不論是處于動力學供區(qū)還是潛在供區(qū)，加上主血管動脈后對于三跨區(qū)皮瓣的供血肯定是充分的，靜脈引流均是靠主血管靜脈，因此成活率無明顯差異，而四跨區(qū)皮瓣較本實驗的三跨區(qū)皮瓣遠端多了一個跨區(qū)，在動力學供區(qū)進行超灌注時最遠端的血管體區(qū)還會出現(xiàn)供血不足，導致其不同位置超灌注時具有明顯的差距。

本研究存在不足之處，在經(jīng)過術后7d的解剖及造影后，發(fā)現(xiàn)皮瓣在原位縫合后，7d內(nèi)大鼠的血管重建能力比人強，與受區(qū)之間有大量新生血管的再生，會影響實驗結果。choke 區(qū)血管沒有與術前進行比較，只進行了橫向比較，SD 大鼠的個體性會影響實驗結果。本實驗只是根據(jù)結果來判斷，需要在分子機制以及血流動力學上對動脈超灌注及靜脈超引流進行進一步探索。

綜上所述，不同位置進行超引流及超灌注這兩種技術對三跨區(qū)皮瓣成活的影響是不近相同的，不論是在動力學供區(qū)還是潛在供區(qū)，動脈超灌注均較靜脈超引流更能提高皮瓣成活率。