一種鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置的設計及使用效果評價

賈彩霞，嚴辰媛，薛榮利，哈小琴，3*

（1.蘭州大學公共衛(wèi)生學院，蘭州730000；2.聯(lián)勤保障部隊第940 醫(yī)院檢驗科，蘭州730050；3.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，蘭州730050）

0 引言

骨性關節(jié)炎又稱退行性關節(jié)病，是一種以關節(jié)軟骨的變性、破壞和骨質增生為特征的慢性關節(jié)病[1-2]。目前，全球骨性關節(jié)炎患者超過2.5 億，且呈現年輕化趨勢[2]。世界衛(wèi)生組織將腫瘤、心腦血管疾病和骨性關節(jié)炎并稱為危害健康的三大殺手[3]。骨性關節(jié)炎對人類健康的危害不容忽視，它是造成中老年人群喪失勞動力的主要原因[4-5]，而目前并沒有能夠治愈骨性關節(jié)炎的有效手段。

探究骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制，或是尋找有效的治療手段，動物實驗都是不可或缺的部分，建立符合人類骨性關節(jié)炎病理特征的動物骨性關節(jié)炎模型，是動物實驗最基礎也是最重要的部分。目前，動物骨性關節(jié)炎模型的建立手段主要有手術法和非手術法[6-11]，手術法主要包括交叉韌帶切除和Hulth 法，非手術法主要包括冷應激、基因敲除、機械損傷和藥物誘發(fā)。在建立模型時，手術方式主要是使關節(jié)不穩(wěn)、應力改變，從而導致退行性病變，然而，手術通常伴隨感染等并發(fā)癥，使模型建立失去精準性，動物模型的病理進程特征與人類骨性關節(jié)炎會出現一定的偏差。而藥物造模是在短期內快速破壞軟骨等關節(jié)組織，病理特征更類似于人類的急性損傷[12-15]。相較于其他方式，冷應激建立模型是通過長時間的低溫刺激，持續(xù)緩慢地破壞軟骨細胞和滑膜細胞的生存環(huán)境，引起細胞外基質降解以及軟骨細胞的凋亡等，從而導致關節(jié)軟骨變性及退化，引起關節(jié)慢性病變[16]，動物模型的病理過程更加符合人類骨性關節(jié)炎的退行性病變。

然而，在使用冷應激建立動物骨性關節(jié)炎模型時，因固定動物花費時間長、動物掙扎劇烈、單人操作困難、低溫裝置控溫難，使得動物的固定和溫度的控制始終是一個難題?，F有研究中，冷應激建立動物骨性關節(jié)炎模型多是借助鼠常規(guī)固定器，將小鼠放入冰水混合槽中，需要人工密切關注溫度變化，存在諸多問題，比如在同一條件及同一時間段下較難大量建立模型、低溫無法穩(wěn)定可控、鼠的劇烈掙扎常常導致操作者被抓傷或咬傷等[17]?；诖?，本文設計一種鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置，并對其使用效果進行評價。

1 鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置設計

鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置由控溫箱和鼠固定器組成（如圖1 所示），其制作材料主要為有機玻璃和金屬。本裝置的作用原理為穩(wěn)定的關節(jié)低溫局部刺激導致軟骨細胞和滑膜細胞的正常生存環(huán)境發(fā)生改變，從而使細胞變性、凋亡。

1.1 控溫箱外觀結構設計

鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置的外形是長方體，呈敞口結構，中間橫向并列卡位條，其上有多個卡位槽。卡位條呈細長的長方形，兩端可固定在控溫箱體上?？販叵鋬瓤煞胖妙A凍過的冰袋，加入水可形成冰水混合物，進而調控溫度。箱體一側有溫度顯示屏，內置扁圓形溫度計，可實時顯示溫度變化，并可根據溫度顯示屏上的數字變化在箱體內加入冰袋或水，以維持低溫的穩(wěn)定。

1.2 鼠固定器

鼠固定器主要由固定底板、防護罩、第一擋板和第二擋板組成。固定底板上有2 個固定條，每個固定條上有前后2 個固定孔。固定條內部還有2 個可移動的卡固板，卡固板的一端是半圓形，2 個卡固板可將伸出固定孔的鼠的四肢固定，卡固板的移動由螺桿控制。第二擋板上設有透氣網，可流通空氣，防止鼠在長時間的固定下發(fā)生窒息。第一、二擋板和拱形防護罩的設計可減少鼠的掙扎，防止操作者被抓傷、咬傷。鼠固定器結構示意圖如圖2 所示。

2 鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置使用方法

第1 步，在控溫箱中加入已在-80 ℃預凍過的冰袋，冰袋大小可根據實驗需要進行調節(jié)；將自來水注入控溫箱，調節(jié)溫度顯示屏上的溫度至5～6 ℃；當溫度上升或下降時，可加入預凍過的裝有水的小型離心管或自來水，調節(jié)至適宜溫度。第2 步，將小鼠放入鼠固定器中，用纏了紗布的鑷子將小鼠的右后肢從固定孔穿過，調節(jié)螺桿，固定至適宜位置，露出小鼠的踝關節(jié)。第3 步，將鼠固定器固定于卡位槽上，使小鼠的右后肢浸沒在冰水中，記錄此刻的時間。第4 步，1 h 40 min 后，取下鼠固定器，放出小鼠，對裝置進行清洗、消毒，冷凍冰袋，待下次實驗繼續(xù)使用。實驗持續(xù)30 d，第30 天時取材觀察。

3 鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置使用效果評價

3.1 方法

3.1.1 材料

選擇20 只3 月齡BALB/c 雄性小鼠[由聯(lián)勤保障部隊第940 醫(yī)院動物實驗中心提供，SPF 級，實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2017-0047；實驗動物生產許可證號：SCXK（軍）2017-0023；實驗動物批號：20210506]，平均體質量29.4 g。適應性飼養(yǎng)1 周后，根據隨機數字表法完全隨機分成陰性對照組和低溫處理組2 組，每組10 只。陰性對照組的小鼠正常飲食、飲水，低溫處理組小鼠的右后肢使用鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置每天在5～6 ℃條件下低溫處理1 h 40 min，持續(xù)30 d。實驗方案經聯(lián)勤保障部隊第940 醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準（2020KYLL042）。

實驗中使用的主要儀器和試劑：全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)（TECAN，瑞士）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（江蘇酶標生物，中國）；小鼠白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（江蘇酶標生物，中國）；小鼠透明質酸（HA）ELISA 試劑盒（江蘇酶標生物，中國）；小鼠免疫球蛋白M（IgM）ELISA 試劑盒（江蘇酶標生物，中國）；EDTA 脫鈣液（博士德，中國）。

3.1.2 操作者使用反饋記錄

單人操作，記錄完成整個實驗、單只鼠固定和鼠的右后肢浸沒在冰水中的時間；觀察低溫穩(wěn)定的持續(xù)時間；記錄操作者被小鼠抓傷或咬傷情況。

3.1.3 小鼠后肢形態(tài)觀察

為陰性對照組和低溫處理組小鼠的后肢拍照，觀察低溫處理組小鼠的右后肢相比陰性對照組小鼠的后肢是否出現了紅腫或變形。

3.1.4 關節(jié)腫脹度測量

用游標卡尺測量陰性對照組和低溫處理組小鼠的右后肢踝關節(jié)周長，比較2 組數據的均值，判斷低溫處理組小鼠的右后肢踝關節(jié)是否出現了明顯腫脹。

3.1.5 血清學指標檢測

用10%的水合氯醛麻醉小鼠，自眼眶采血，以3 000 r/min 離心15 min 后取血清，按照相應試劑盒說明書測量TNF-α、IL-1β、HA 和IgM 的吸光度（optical density，OD）值。比較低溫處理組與陰性對照組小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、HA 含量，可說明小鼠踝關節(jié)是否出現炎癥以及關節(jié)組織的正常功能是否發(fā)生改變，比較IgM 含量可排除類風濕性關節(jié)炎。

3.1.6病理觀察

采血后，用剪刀剪去踝關節(jié)上下3 mm 外的組織，保留完整踝關節(jié)；用生理鹽水清洗踝關節(jié)上的血液；用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定關節(jié)組織24 h后，使用格氏平衡鹽溶液洗去多聚甲醛；用EDTA 脫鈣液常溫脫鈣，4 d 換一次脫鈣液，換液3 次后，每天一換，16 d 后脫水包埋，用HE 染色，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

3.1.7 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行數據分析和統(tǒng)計圖繪制，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3.2 結果

3.2.1 操作者使用反饋結果

單人操作，1 min 內可完成單只小鼠的固定和時間記錄，30 min 內可完成10 只小鼠所有實驗步驟，操作簡單快速，省時省力；裝置組裝簡單，溫度調節(jié)快速穩(wěn)定，5～6 ℃低溫可穩(wěn)定保持3 h；小鼠掙扎程度小，在持續(xù)30 d 的實驗過程中，操作者未出現任何抓傷或咬傷。

3.2.2 小鼠后肢形態(tài)

陰性對照組小鼠右后肢正常，無任何紅腫，如圖3 所示；低溫處理組小鼠右后肢踝關節(jié)腫脹明顯，與陰性對照組小鼠的右后肢形成明顯對比，如圖4 所示。

圖3 陰性對照組后肢

圖4 低溫處理組后肢

3.2.3 關節(jié)腫脹度測量結果

2 組小鼠右后肢踝關節(jié)周長比較如圖5 所示。陰性對照組小鼠的右后肢踝關節(jié)周長平均為9.83 mm，低溫處理組為16.05 mm，顯著長于陰性對照組（P＜0.001），差異有統(tǒng)計學意義。

圖5 2 組小鼠右后肢踝關節(jié)周長比較

3.2.4 血清學指標檢測結果

2 組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、HA 和IgM 的含量比較如圖6 所示。低溫處理組血清中TNF-α、IL-1β 和HA 的含量均高于陰性對照組（P 均＜0.05），2 組小鼠血清中IgM 的含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 2 組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、HA 和IgM 的含量比較

3.2.5 病理結果

陰性對照組小鼠踝關節(jié)軟骨面光滑，軟骨細胞和滑膜細胞排列有序，未見增生、變性和退化，如圖7 所示；低溫處理組小鼠踝關節(jié)的關節(jié)腔變大，軟骨面破損退化，軟骨細胞增生、變性，滑膜組織變性粘連，如圖8 所示。

圖7 陰性對照組小鼠踝關節(jié)病理切片（HE 染色）

圖8 低溫處理組小鼠踝關節(jié)病理切片（HE 染色）

4 討論

本文設計的鼠骨性關節(jié)炎低溫造模裝置結構簡單、經濟環(huán)保、單人可操作，操作過程快速簡單，可在同一條件、同一時間段內大量建立小鼠骨性關節(jié)炎模型。操作者在整個實驗過程中，未出現任何抓傷或咬傷。小鼠在固定時，情緒穩(wěn)定、掙扎幅度小，整個操作過程對小鼠身體的傷害和精神上的刺激很小。且低溫調節(jié)快速，低溫穩(wěn)定維持的時間長，可滿足實驗要求。低溫刺激結束后，低溫處理組小鼠只有穿過固定孔的右后肢出現了關節(jié)腫脹，而未穿過固定孔的左后肢無任何紅腫，與陰性對照組小鼠的后肢無差別，表明本裝置只會對處于低溫環(huán)境的小鼠右后肢造成低溫刺激，造模部位明確、精準。低溫處理組小鼠完整踝關節(jié)脫鈣后的病理染色結果符合骨性關節(jié)炎的病理特征。低溫處理組小鼠血清學指標中TNF-α、IL-1β、HA 含量均升高，但2 組小鼠血清中IgM 含量差異無統(tǒng)計學意義。以上結果說明本裝置使用簡單、省時省力、成本低、安全可靠，能夠成功建立小鼠骨性關節(jié)炎模型，使用效果好。

本研究只對本裝置的小鼠固定及模型建立效果進行了評價，但本裝置并不局限于小鼠，大鼠、小型兔子或其他小型動物都可以使用本裝置進行固定及建立骨性關節(jié)炎模型；而且，本研究中鼠固定器的卡固板可通過螺桿進行調節(jié)，可將不同動物的四肢根據實驗需要固定住不同的部位，因此該固定器也不局限于固定小鼠進行骨性關節(jié)炎模型的建立，它還可以固定其他動物，使動物的四肢穿過固定孔進行一些其他腿部操作，例如針灸、藥物注射、局部手術、局部刺激、局部拍照測量[18]等，可減少動物的掙扎，降低操作者被抓傷或咬傷的概率，有效保護操作者。

綜上所述，本裝置為尋找骨性關節(jié)炎的治愈手段、探索病理進程機制的實驗研究提供了一個動物模型建立方法的參考和依據。不過，本裝置的溫度調節(jié)依靠的是人工添加冰袋或冰管、自來水，過程較為煩瑣，在以后的研究中，可考慮設計溫度自動調節(jié)裝置，實現溫度的快速控制，從而節(jié)省人力、物力。