蒙特卡洛法對(duì)校準(zhǔn)曲線法測(cè)定總膽紅素濃度的不確定度評(píng)定

孟舒婷， 周衛(wèi)平， 戴繪芬， 董德平， 董業(yè)峰， 葛仁美， 王惠民

（1.南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226600；2.南通市通州區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 通州 226300；3.海安市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226600；4.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226601）

血清總膽紅素作為一項(xiàng)重要的臨床生化指標(biāo)，其檢測(cè)值的準(zhǔn)確性對(duì)臨床診斷肝臟疾病或膽道梗阻有重要意義[1]?；|(zhì)效應(yīng)、互換性和“單點(diǎn)濃度”正確度評(píng)價(jià)的局限性，易造成濕化學(xué)法總膽紅素檢測(cè)結(jié)果偏高，導(dǎo)致結(jié)果偏移。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外高度關(guān)注檢驗(yàn)結(jié)果的一致性，檢驗(yàn)結(jié)果一致性的關(guān)鍵是溯源，不確定度則是保證溯源可靠性的重要方法?？偰懠t素屬于化學(xué)定義明確的小分子化合物，按ISO 17511文件[2]要求，總膽紅素測(cè)量結(jié)果可通過(guò)參考方法或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接或間接溯源至國(guó)際單位制（international system of units，SI）單位。常規(guī)檢測(cè)結(jié)果可溯源至參考方法或參考物質(zhì)，才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)同級(jí)別不同實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的互認(rèn)[3-4]。

目前，國(guó)際上對(duì)不確定度評(píng)定方法的分類(lèi)尚無(wú)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，按照對(duì)輸入量分布類(lèi)型的處理方式可分為3種：以測(cè)量不確定度表達(dá)指南（the Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，GUM）為框架的不確定度評(píng)定方法（GUM uncertainty framework，GUF）、蒙特卡洛法（Monte Carlo method，MCM）和自助法（bootstrap method，BM）。用于評(píng)定測(cè)量不確定度采用的MCM是一種通過(guò)重復(fù)采樣實(shí)現(xiàn)分布傳播的數(shù)值方法。與GUF利用線性化模型傳播不確定度的解析方法不同，MCM通過(guò)對(duì)輸入量Xi的概率密度函數(shù)（probability density function，PDF）離散采樣，由測(cè)量模型傳播輸入量的分布，計(jì)算獲得輸出量Y的PDF的離散采樣值，進(jìn)而由輸出量的離散分布數(shù)值直接獲取輸出量的最佳估計(jì)值、標(biāo)準(zhǔn)不確定度和包含區(qū)間[5]。近年來(lái)，已有報(bào)道將MCM用于參考實(shí)驗(yàn)室測(cè)定酶催化活性的不確定度評(píng)定[6-7]，但對(duì)合理評(píng)定多水平標(biāo)準(zhǔn)液構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線所得到的測(cè)量結(jié)果及其不確定度仍在探索中。本研究嘗試通過(guò)建立對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)模型，結(jié)合人工智能軟件，應(yīng)用MCM評(píng)定血清總膽紅素濃度的測(cè)量不確定度，為合理評(píng)定類(lèi)似測(cè)量程序的不確定度提供新思路。

1 材料和方法

1.1 儀器

日本日立公司U-3310紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，配備半導(dǎo)體控溫、點(diǎn)溫計(jì)裝置和反應(yīng)分析軟件；美國(guó)Fluke公司Hart Scientific 1521型電子溫度計(jì)（精度0.001 ℃）；意大利Hanna公司H198183型pH計(jì)（精度0.002）；德國(guó)Sartorius 公司BT25S電子天平（精度0.01 mg）；美國(guó)Millipore公司Direct-Q 3UV純水儀；德國(guó)Eppendorf公司Reference移液器。分光光度計(jì)、天平、pH計(jì)、溫度計(jì)和移液器均由南通市計(jì)量局進(jìn)行檢定，分光光度計(jì)每天使用前自檢，天平、pH計(jì)每次使用前自校。

1.2 試劑

二甲亞砜（批號(hào)BCBN0845V）、碳酸鈉（批號(hào)MKAA0325V）、對(duì)氨基苯磺酸（批號(hào)BCBL5743V）、亞硝酸鈉（批號(hào)SCBJ4432V）、安息香酸鈉（批號(hào)SLHB7401V）、醋酸鈉（批號(hào)BCBN2082V），三羥甲基氨基甲烷[2-Amino-2-（hydroxymethyl）-1，3-propanediol Tris；批號(hào)SLBH9329V]，牛血清白蛋白（批號(hào)066K0708），乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA；批號(hào)WXBB34432），四水酒石酸鉀鈉（批號(hào)SLBC8354V）和氫氧化鈉（批號(hào)SZBE0140V）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；咖啡因（批號(hào)140703A）購(gòu)自北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司；膽紅素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（14061603）購(gòu)自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院。

1.3 樣品濃度測(cè)定

將國(guó)際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）2014年參考實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃國(guó)際比對(duì)樣本A、樣本B 2個(gè)濃度水平樣品用稱(chēng)重法復(fù)溶至5 mL。記錄室溫下蒸餾水的質(zhì)量及水溫，查《1990水溫國(guó)際溫標(biāo)純水密度表》，換算實(shí)際復(fù)溶的體積。嚴(yán)格按照國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列表推薦的總膽紅素參考測(cè)量程序[8]（Doumas法）進(jìn)行樣品濃度的測(cè)定，重復(fù)10次，計(jì)算樣本的濃度水平。

1.4 方法

基于MCM，利用MATLAB 2012a軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)總膽紅素測(cè)量結(jié)果不確定度的評(píng)定

1.4.1 建模 建立評(píng)定總膽紅素不確定度的5個(gè)數(shù)學(xué)模型。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的數(shù)學(xué)模型為：

式中b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，x為各標(biāo)準(zhǔn)管的濃度，y為各標(biāo)準(zhǔn)管的對(duì)應(yīng)的吸光度值（A），a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，n為標(biāo)準(zhǔn)管的數(shù)量。各輸入量均具有相應(yīng)的概率密度分布。

1.4.2 MCM評(píng)定總膽紅素測(cè)量結(jié)果的不確定度 （1）MCM輸入。①定義輸出量Y，即需測(cè)量的量（被測(cè)量）；②確定與Y相關(guān)的輸入量；③建立Y和X1…XN之間的數(shù)學(xué)模型；④利用可獲信息，為Xi設(shè)定PDF，如正態(tài)分布、矩形（均勻）分布等；⑤選擇MCM試驗(yàn)樣本量M。（2）MCM傳播。①?gòu)妮斎肓縓i的PDF中抽取M個(gè)樣本值；②根據(jù)測(cè)量模型計(jì)算每個(gè)隨機(jī)抽取樣本的相應(yīng)Y值。（3）MCM輸出。嚴(yán)格按照遞增次序?qū)個(gè)Y值進(jìn)行排序，基于排序的模型值得到輸出量Y的PDF。（4）報(bào)告結(jié)果。①根據(jù)Y的PDF計(jì)算Y的估計(jì)值y及y的標(biāo)準(zhǔn)不確定度（u）；②根據(jù)Y的PDF計(jì)算給定包含概率p時(shí)對(duì)應(yīng)Y的包含區(qū)間 [ylow，yhigh]。

2 結(jié)果

2.1 用于MCM模擬的試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2014年國(guó)際比對(duì)樣本總膽紅素A值和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液數(shù)據(jù)見(jiàn)表1、表2。

表1 2014年國(guó)際比對(duì)樣本A和樣本B總膽紅素A值和統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

2.2 MATLAB軟件運(yùn)行MCM程序及軟件模擬結(jié)果

2.2.1 MCM程序運(yùn)行

在MATLAB軟件File菜單下輸入對(duì)應(yīng)的function函數(shù)（圖1）。點(diǎn)擊綠色箭頭圖標(biāo)運(yùn)行，開(kāi)始運(yùn)算。為獲得95%置信概率下包含區(qū)間，將PDF采樣次數(shù)M設(shè)置為106次。MATLAB軟件對(duì)各輸入量進(jìn)行隨機(jī)采樣，“random”表示隨機(jī)采樣。對(duì)各個(gè)PDF進(jìn)行106次采樣后，通過(guò)軟件求得輸出量不確定度。根據(jù)建立的5個(gè)數(shù)學(xué)模型編寫(xiě)Matlab程序，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度均值及其不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度均值及其不確定度、測(cè)量結(jié)果及其不確定度。

圖1 軟件中輸入function函數(shù)

2.2.2 MATLAB軟件模擬結(jié)果

（1）MATLAB軟件模擬生成的5組參數(shù)見(jiàn)圖2～圖7。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（b）頻數(shù)直方圖

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度均值（）頻數(shù)直方圖

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度均值（ ）頻數(shù)直方圖

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線截距（a）頻數(shù)直方圖

圖6 國(guó)際比對(duì)樣本A、樣本B濃度頻數(shù)直方圖

圖7 軟件命令窗口輸出運(yùn)行數(shù)據(jù)

（2）MATLAB軟件模擬生成數(shù)據(jù)。參考實(shí)驗(yàn)室條件下總膽紅素國(guó)際比對(duì)樣本A測(cè)定結(jié)果為：b=0.007 531 6，s=0.000 025 51；=87.284 4 mg/L，s=0.196 5；=0.657 917，s=0.000 365 4；a=0.000 525 16，s=0.002 699；= 39.368 8 mg/L，u=0.603 2；95%可信區(qū)間為38.188 0～40.553 5。樣本B測(cè)定結(jié)果為：b=0.007 531 6，s=0.000 025 51；= 87.284 4 mg/L，s=0.196 5；=0.657 917，s=0.000 365 4；a=0.000 525 16，s=0.002 699；=18.703 1 mg/L，u=0.296 4；95%可信區(qū)間為18.122 5～19.284 4。用自適應(yīng)MCM[9]驗(yàn)證GUF包含區(qū)間，結(jié)果顯示，2組絕對(duì)偏差dlow和dhigh值均>數(shù)值容差0.05，GUF法的結(jié)果未通過(guò)MCM驗(yàn)證[10]。

3 討論

血清總膽紅素是評(píng)估肝功能的重要常規(guī)指標(biāo)之一，對(duì)于患者病情的判斷、鑒別診斷有著重要的指導(dǎo)作用?？偰懠t素測(cè)定是具備完整的參考系統(tǒng)的項(xiàng)目，理論上可溯源至SI單位，從而實(shí)現(xiàn)總膽紅素項(xiàng)目的量值溯源和標(biāo)準(zhǔn)化?？紤]到血清總膽紅素測(cè)定過(guò)程中存在明顯基質(zhì)效應(yīng)，且在常規(guī)測(cè)量條件下無(wú)法做到絕對(duì)避光，含測(cè)量不確定度信息的總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純品不可直接用于血清總膽紅素的校準(zhǔn)[8]。ISO/TS 25680規(guī)定：對(duì)于無(wú)適宜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/質(zhì)控物的檢測(cè)指標(biāo)，只能用方法學(xué)比對(duì)法進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]。因此，JCTLM列表推薦的參考方法（Doumas法）[12]成為總膽紅素參考測(cè)量系統(tǒng)解決臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題的關(guān)鍵，而測(cè)量不確定度的評(píng)定則是亟需解決的問(wèn)題。

血清總膽紅素參考測(cè)量程序采用校準(zhǔn)曲線法，該方法通過(guò)對(duì)一系列已知含量的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行最小二乘法回歸建模（partial least squares regression，PLS）繪制成校準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)得的樣品信號(hào)值從校準(zhǔn)曲線得出待測(cè)總膽紅素濃度[13]。該曲線并非通過(guò)所有測(cè)量點(diǎn)，而是無(wú)限接近所有點(diǎn)，需進(jìn)行精密度檢驗(yàn)，判斷檢驗(yàn)擬合有無(wú)異常。曲線擬合過(guò)程中的斜率與截距會(huì)間接影響曲線擬合的準(zhǔn)確性。本研究首次應(yīng)用MCM對(duì)總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線中的各個(gè)濃度的概率密度函數(shù)及吸光度的概率密度函數(shù)構(gòu)建測(cè)量模型，獲取了標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距的概率分布，直觀計(jì)算測(cè)量結(jié)果的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（不確定度）與相應(yīng)概率下的分布區(qū)間。

MCM作為GUF的一種替代和補(bǔ)充方法[9]，具備以下實(shí)際應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：（1）如數(shù)據(jù)呈偏正態(tài)分布，第二類(lèi)錯(cuò)誤的發(fā)生率必然升高，MCM無(wú)需考慮變量間的相互作用和輸出量分布類(lèi)型（如模型非線性）等局限認(rèn)識(shí)，且模擬過(guò)程不受輸入量分布類(lèi)型及相關(guān)性影響，避免了傳統(tǒng)GUF中k值偏于保守，擴(kuò)展不確定度可能偏大的情況；（2）結(jié)果表達(dá)中，在確定包含區(qū)間時(shí)，MCM無(wú)需考慮包含因子，以區(qū)間的形式代替擴(kuò)展不確定度，測(cè)量結(jié)果的不確定度更直觀，更易理解；（3）MCM借助計(jì)算機(jī)模擬過(guò)程，對(duì)相關(guān)輸入量的分布進(jìn)行處理，避免了傳統(tǒng)GUF的繁瑣計(jì)算，顯著提升了效率?；贛CM評(píng)定測(cè)量不確定度引入主觀因素少，對(duì)測(cè)量模型采用“海量”數(shù)據(jù)模擬，減少了第二類(lèi)誤差，可獲得更真實(shí)的測(cè)量結(jié)果均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差（不確定度）、一定概率下（95%）的分布區(qū)間，更為精準(zhǔn)、適用范圍更廣。但MCM本質(zhì)是基于隨機(jī)抽樣，因此每次輸出結(jié)果會(huì)有細(xì)微差異，但對(duì)比組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。目前，MATLAB軟件在影像學(xué)3D建模、心腦血管血流動(dòng)力學(xué)分析中的應(yīng)用較多，但在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用較少，將MATLAB軟件用于檢驗(yàn)領(lǐng)域具有一定的前瞻性，對(duì)于多濃度校準(zhǔn)曲線檢測(cè)有一定指導(dǎo)意義，可用于不同實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果的互認(rèn)?；贛CM原理，結(jié)合MATLAB軟件，本研究基于MCM對(duì)血清總膽紅素的不確定度進(jìn)行了評(píng)定，運(yùn)行結(jié)果與GUF結(jié)果比較，證明在經(jīng)典方式不適用的情況下，MCM是優(yōu)于GUF的不確定度評(píng)定方法。