浙江地區(qū)新建新型冠狀病毒核酸檢測實驗室質(zhì)量現(xiàn)狀分析

陳 倩， 單志明， 宋 超， 康鳳鳳， 金 靜， 酈衛(wèi)星

（浙江省臨床檢驗中心 浙江省人民醫(yī)院 杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014）

目前，核酸檢測仍是發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒感染者的關(guān)鍵技術(shù)手段，對于及時發(fā)現(xiàn)傳染源、降低疫情擴散風險、落實“早發(fā)現(xiàn)”原則具有重要意義。按照國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機制《進一步推進新冠病毒核酸檢測能力建設(shè)工作方案》要求[1]，二級及以上綜合醫(yī)院、傳染病專科醫(yī)院、各級疾病預防控制中心均應(yīng)具備核酸檢測能力，并提供檢測服務(wù)。2020年1月以來，浙江省臨床檢驗中心驗收通過了230余家新型冠狀病毒核酸檢測實驗室，同時也培訓了20 000余名新上崗聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）操作人員。為了有效評估新上崗PCR檢測人員的專業(yè)技術(shù)能力和實驗室檢測能力，我們用組隊模式隨機抽查了450名檢測人員，發(fā)現(xiàn)新持證人員各項成績均低于原有持證人員，且差異明顯[2]，但2020年1月后新建的新型冠狀病毒核酸檢測實驗室（簡稱新建實驗室）與2020年1月前取得資質(zhì)的實驗室（簡稱原有實驗室）的檢測能力與質(zhì)量差異還有待評估。新建實驗室通過驗收后至少試運行了6個月，運行期間檢測了一定數(shù)量的樣本，并累積了一定的工作經(jīng)驗，因此我們認為對其展開調(diào)查的時機相對成熟。本研究基于現(xiàn)場督查不符合項分布和考核結(jié)果進行質(zhì)量現(xiàn)狀分析，比較新建實驗室與原有實驗室之間的質(zhì)量差異，尋找共性問題，以提升核酸檢測實驗室檢測能力。

1 材料和方法

1.1 督察對象

隨機抽選浙江地區(qū)179家開展新型冠狀病毒核酸檢測的實驗室，其中新建實驗室107家，原有實驗室72家。

1.2 督查人員

由浙江省臨床檢驗中心及專家委員所在單位的核酸檢測業(yè)務(wù)骨干組成15人督查組，所有人員督查前進行培訓，統(tǒng)一考核標準。

1.3 督察依據(jù)

依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）》[3]、《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增管理辦法》[4]、《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》[5]、《新型冠狀病毒核酸快速檢測臨床規(guī)范化應(yīng)用專家共識》[6]中的要求制定督查標準。

1.4 督察方案

（1）督查組成員攜帶考核樣本，分成不同路線同時到達某個地區(qū)，完成對該地區(qū)抽查實驗室的現(xiàn)場督查工作，并監(jiān)督實驗室上報定性結(jié)果與循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）。（2）定制2 000拷貝/mL假病毒顆粒質(zhì)控物（鄭州安圖公司，批號為300901100601，1.0 mL/支），要求實驗室用2種方案檢測：方案一為常規(guī)檢測，即將原始樣本（1 000拷貝/mL）和實驗所使用的病毒保存液混合稀釋成750拷貝/ mL，各檢測1次；方案二為快速檢測，即核酸提取、擴增檢測均在同一封閉、便攜式儀器上完成，樣本上機至結(jié)果報告無需任何手工操作，且全流程時間不超過90 min；用實驗所使用的病毒保存液將質(zhì)控物稀釋成500拷貝/mL，重復檢測2次。（3）考核實驗室對質(zhì)控物測定結(jié)果與預期結(jié)果的符合度（質(zhì)控物樣本和稀釋樣本均要求檢出，有1種樣本未檢出即判定為假陰性結(jié)果），定性結(jié)果根據(jù)實驗室陰、陽性結(jié)果與預期結(jié)果是否符合，計算符合率。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Excel 2010和SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 現(xiàn)場督察不符合條款分布

107家新建實驗室共發(fā)現(xiàn)不符合條款638條，平均每家實驗室發(fā)生6條；72家原有實驗室共發(fā)現(xiàn)不符合條款171條，平均每家實驗室發(fā)生3條。原有實驗室與新建實驗室不符合項條款分布情況見表1。進一步分析督查中原有實驗室與新建實驗室不符合項所占比例較高的“4.4室內(nèi)質(zhì)控”和“2.3性能驗證”內(nèi)的具體不符合項分布，以及新建實驗室不符合項所占比例較高的“4.2快速檢測”內(nèi)的具體不符合項分布，結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

圖1 室內(nèi)質(zhì)控條款內(nèi)具體不符合項分布

圖2 性能驗證條款內(nèi)具體不符合項分布

圖3 快速檢測條款內(nèi)具體不符合項分布

表1 原有實驗室與新建實驗室現(xiàn)場質(zhì)量督察不符合條款分布情況

2.2 質(zhì)控物考核結(jié)果

2.2.1 不同品牌試劑檢測結(jié)果符合率 根據(jù)實驗室使用的試劑盒說明書中的結(jié)果判定標準，常規(guī)檢測假陰性結(jié)果均發(fā)生于新建實驗室。原倍樣本與稀釋樣本2個陽性結(jié)果符合情況見表2。

表2 不同品牌試劑盒結(jié)果符合情況

2.2.2 新建實驗室與原有實驗室常規(guī)檢測系統(tǒng)配套、非配套以及快速檢測結(jié)果符合率 根據(jù)實驗室是否使用試劑盒說明書推薦的核酸提取試劑、提取儀、擴增儀分為配套與非配套2種情況，原有實驗室檢測系統(tǒng)配套性優(yōu)于新建實驗室，開展快速檢測方法在新建實驗室中所占比例較高；在常規(guī)檢測系統(tǒng)配套與非配套、快速檢測結(jié)果中，原有實驗室ORF1ab基因和N基因結(jié)果符合率均為100%，高于新建實驗室。見表3。

表3 不同檢測系統(tǒng)配套情況原有實驗室與新建實驗室考核結(jié)果比較

2.2.3 常規(guī)檢測Ct值結(jié)果分布 常規(guī)檢測N基因的Ct值均值低于ORF1ab基因；1 000拷貝/mL和750拷貝/mLCt值均值變化<0.5；超過85%的實驗室Ct值結(jié)果與Ct值均值相差<±3個周期，僅有1.13%～2.82%的實驗室Ct值與Ct值均值相差>±5個周期。見表4、圖4。

圖4 常規(guī)檢測實驗室單個靶標Ct值范圍

表4 常規(guī)檢測Ct值結(jié)果分布

2.2.4 快速檢測Ct值結(jié)果分布 快速檢測同時有2個假陰性結(jié)果的情況均出現(xiàn)在新建實驗室?？焖贆z測2次檢測結(jié)果平均Ct值無明顯差異，見表5。

表5 不同品牌試劑盒快速檢測Ct值結(jié)果

3 討論

我國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[7]將實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測新型冠狀病毒陽性作為新型冠狀病毒肺炎的確診依據(jù)之一，而開展這項檢測無論是對實驗室硬件設(shè)施、操作人員資質(zhì)、標準操作規(guī)程、生物安全管理等都有較高的要求，實地督查和外部質(zhì)量評估可幫助實驗室發(fā)現(xiàn)問題，及時整改，提高實驗室檢測質(zhì)量。本研究結(jié)果顯示，新建實驗室發(fā)生不符合條款平均值（6條）多于原有實驗室（3條），新建實驗室檢測系統(tǒng)配套性情況（25.23%）弱于原有實驗室（75.00%），常規(guī)檢測與快速檢測的假陰性結(jié)果均發(fā)生于新建實驗室。在常規(guī)檢測中，原有實驗室與新建實驗室不符合項均集中于室內(nèi)質(zhì)控與性能驗證這2個條款內(nèi)，是共性問題。

基于先前的室間質(zhì)評數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果是存在的潛在和不可避免的問題。本研究質(zhì)控物考核結(jié)果顯示，假陰性結(jié)果均發(fā)生在3家使用非配套檢測系統(tǒng)的新建實驗室，表現(xiàn)為ORF1ab基因單靶標陰性，其中1家實驗室檢測系統(tǒng)雙靶標陰性，2家實驗室快速檢測報告假陰性結(jié)果。結(jié)合督查結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)新建實驗室主要以二級醫(yī)院為主，二級醫(yī)院實驗室工作人員平均為13人，較難有分子檢測學歷背景，包括分子檢測實驗室負責人，本次考核與先前室間質(zhì)評最大的區(qū)別是督查專家隨機抽選人員進行檢測，操作不熟練或操作失誤是造成假陰性結(jié)果的主要原因；另外，實驗室檢測系統(tǒng)的性能也同樣對檢測結(jié)果有重要影響，新建實驗室配套性與原有實驗室差異較大，且沒有能力獨立完成性能驗證，導致實驗室人員對在用非配套的檢測系統(tǒng)性能沒有及時了解與掌握，無法排除潛在的風險。

本次考核結(jié)果提示，原有實驗室與新建實驗室均應(yīng)加強室內(nèi)質(zhì)控管理，尤其是對弱陽性室內(nèi)質(zhì)控Ct值進行有效監(jiān)控。目前，實驗室所用第三方質(zhì)控物為均一假病毒顆粒物質(zhì)，Ct值具有一定可比性。將假病毒顆粒稀釋后制成濃度為檢出限1.5～3.0倍的弱陽性質(zhì)控物來進行室內(nèi)質(zhì)控，可以更好地反映基質(zhì)效應(yīng)，同時監(jiān)測核酸檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性[8]。有研究結(jié)果表明，繪制質(zhì)控圖能盡早發(fā)現(xiàn)擴增異常的實驗室批次或者設(shè)備的異常情況，避免漏檢與誤檢[9]。在督查中我們發(fā)現(xiàn)，有極小部分實驗室對每日多批次的弱陽性Ct值結(jié)果通過質(zhì)控圖趨勢監(jiān)控，小部分實驗室用記錄表抄寫監(jiān)測，大部分實驗室未進行有效監(jiān)測。除弱陽性質(zhì)控外，3個陰性室內(nèi)質(zhì)控同樣重要，對于實驗室環(huán)境防污染和實驗過程是否正確具有重大意義，但僅有個別實驗室對3個陰性室內(nèi)質(zhì)控進行隨機設(shè)置。

實驗室應(yīng)按預期用途評估性能參數(shù)，明確驗證方案，確保性能符合相關(guān)規(guī)定。本研究具體不符合項分布結(jié)果顯示，精密度方案驗證錯誤、性能驗證報告缺少必要信息和更換試劑耗材后未及時更新、未選擇適當?shù)尿炞C樣本等問題均有不同比例發(fā)生，本次調(diào)查的實驗室選用的檢測試劑盒均基于實時熒光PCR法，其原理是提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而獲得目的基因的表達，因此PCR試劑盒并不是保證結(jié)果準確的唯一決定因素，提取試劑盒、提取儀與擴增儀的選用也會影響分析性能[10]。浙江省臨床檢驗中心前期在室間質(zhì)評成績不合格的實驗室倒查中也發(fā)現(xiàn)不合格實驗室存在不同品牌提取儀、擴增儀及PCR試劑盒之間的隨機搭配使用的情況[11]，這會對檢測性能造成很大影響，建議新建實驗室在條件允許的情況下盡量選用配套檢測系統(tǒng)，如選用非配套系統(tǒng)，要做好一致性評價，確保檢測結(jié)果的準確性及一致性。MALECKI等[10]提出，實驗室不僅要立即和徹底地實施現(xiàn)有的試劑盒在當前提取方法和PCR儀器的效果，且要確定實施的性能驗證方案，以提高檢測結(jié)果的準確性。

快速檢測因無需進行反應(yīng)體系試劑配制，具有核酸快速釋放與擴增一體化特點，與常規(guī)檢測相比，具有檢測速度快和設(shè)備便攜等優(yōu)點[11]。由于方法學的限制，快速檢測重復性與常規(guī)檢測存在一定差異[12]。本研究不符合項分析結(jié)果顯示，較為嚴重的問題集中于“室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價”，新建實驗室相對于原有實驗室質(zhì)控意識較為薄弱，質(zhì)量控制體系有待完善。

綜上所述，新建實驗室在室內(nèi)質(zhì)控、性能驗證、快速檢測三方面的質(zhì)量管理上仍存在缺陷與不足，建議加強質(zhì)量控制，同時強化人員培訓，提高人員操作技能，增加室間質(zhì)評頻次，以最大程度避免假陰性結(jié)果。