BCHE基因復(fù)合雜合變異致丁酰膽堿酯酶缺乏癥臨床特征和遺傳分析

王 娟， 余 靜， 陳 珺， 鄭 洪， 戴立英

（安徽省兒童醫(yī)院新生兒科，安徽 合肥 230051）

丁酰膽堿酯酶（butyrylcholine eterase，BChE）和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是人類膽堿酯酶的2種類型，AChE主要分布于神經(jīng)組織，BChE主要由肝臟產(chǎn)生并分布于所有組織[1]。BChE的生理功能尚不明確，但對(duì)含酯藥物，包括某些短效神經(jīng)肌肉阻斷劑、普魯卡因、丁卡因及海洛因等分解代謝具有重要的藥理學(xué)意義[2-3]。丁酰膽堿酯酶缺乏癥（butyrylcholinesterase deficiency，BCHED）患者通常沒有生命危險(xiǎn)，但由于其對(duì)肌肉松弛劑等藥物敏感性較高，可能會(huì)在應(yīng)用類似藥物后長期昏迷，甚至死亡[4]。BCHE基因變異導(dǎo)致的BCHED（OMIM#617936）可引起人體血清膽堿酯酶異常降低，多數(shù)情況下無臨床表現(xiàn)，但近年來偶有報(bào)道BCHED患兒存在智力障礙[4-5]。本研究對(duì)2例由BCHE基因復(fù)合雜合變異導(dǎo)致的BCHED患兒進(jìn)行報(bào)道，并分析其遺傳學(xué)特征。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

患兒1，女，漢族，出生26 d，系其母第2胎第2產(chǎn)，孕周39+4周剖宮娩出，Apgar評(píng)分為9～10分，患兒于出生20 d起無明顯誘因出現(xiàn)“腹脹伴腹瀉”，就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院，黃色水樣便，頻次7～8次/d，給予地衣芽孢桿菌活菌膠囊和醒脾養(yǎng)兒顆粒治療后，大便呈綠色伴奶瓣，頻次較前稍減，但仍未能控制，后因“新生兒腹瀉、新生兒肺炎”轉(zhuǎn)院至安徽省兒童醫(yī)院新生兒科。

患兒2，女，漢族，出生23 d，系其母第1胎第1產(chǎn)，孕周38+2周順產(chǎn)，Apgar評(píng)分為9～10分，患兒因皮膚黃染半月就診于安徽省兒童醫(yī)院新生兒科。

2例患兒父母及患兒1的哥哥（3歲）身體健康，否認(rèn)近親結(jié)婚及家族遺傳史。

1.2 方法

1.2.1 基因測(cè)序 患兒父母均簽署知情同意書，經(jīng)安徽省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，對(duì)患兒及父母行全外顯子家系檢測(cè)（trio-based wholeexome sequencing，trio-WES）。采集核心家系成員外周血各3 mL，乙二胺四乙酸抗凝。根據(jù)基因組提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）說明書提取白細(xì)胞DNA，構(gòu)建文庫后用Illumina Miseq高通量測(cè)序儀（美國Illumina公司）對(duì)設(shè)計(jì)序列進(jìn)行捕獲，設(shè)計(jì)序列可覆蓋基因全外顯子區(qū)域及部分內(nèi)含子區(qū)，參考序列為美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫人類基因組參考序列19版，利用GATK軟件（美國Broad研究院）分析得出單核苷酸變異及插入、缺失等變異，過濾無效變異后，對(duì)可靠變異譜進(jìn)行危害性預(yù)測(cè)分析。參考Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：//grch37.ensembl.org）設(shè)計(jì)可疑變異引物，采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)儀器為ABI 3130XL分析儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.2.2 變異注釋與蛋白結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)分析 首先搜索公共數(shù)據(jù)庫（SNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫），統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)在正常人群中的發(fā)生頻率。在ClinVar數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlh.gov/clinvar/）和HGMD數(shù)據(jù)庫（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）中檢索變異位點(diǎn)的報(bào)道情況。采用SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）、Polyphen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及Mutation Taster（https：//www.mutationtaster.org/）在線平臺(tái)分析變異位點(diǎn)的生物危害性，最后根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南[6]進(jìn)行基因致病性分析。另外，本研究通過Uniprot數(shù)據(jù)庫下載多物種BCHE蛋白序列文件，采用Mega軟件（新西蘭Mega公司）對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行同源性保守分析，采用Deepview軟件（瑞士生物信息研究院）對(duì)錯(cuò)義變異進(jìn)行模型分析。

2 結(jié)果

2.1 患兒臨床資料

患兒1入院體格檢查：神志清、反應(yīng)可，全身皮膚無黃染?；純?入院體格檢查：面部及全身黃染，神志清、反應(yīng)一般，皮膚彈性可。實(shí)驗(yàn)室檢查提示2例患兒均出現(xiàn)膽堿酯酶異常降低，總膽紅素（total bilirubin，TB）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBil）升高。2例患兒丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）均正常，甲型肝炎病毒IgM抗體、丙型肝炎病毒抗體及乙型肝炎5項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)均為陰性，糞便鏡檢未見真菌菌絲、真菌孢子、寄生蟲卵，糞便輪狀病毒及腺病毒檢測(cè)均為陰性；入院前期未進(jìn)行藥物干預(yù)，且肝、膽、脾、胰超聲檢查未見明顯占位性病變。因此，臨床排除藥源性膽堿酯酶降低。2例患兒各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 2例患兒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)

2.2 BCHE基因檢測(cè)結(jié)果

2例患兒BCHE基因均發(fā)生復(fù)合雜合變異?；純?為c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24和c.221delC/p.Pro74Hisfs*4，父親攜帶雜合變異c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24，母親攜帶雜合變異c.221delC/p.Pro74Hisfs*4。患兒2為c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24與c.127G>A/p.Gly43Arg，父親攜帶雜合變異c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24，母親攜帶雜合變異c.127G>A/p.Gly43Arg。Sanger測(cè)序證實(shí)存在變異位點(diǎn)。見圖1。

圖1 BCHE基因檢測(cè)結(jié)果

2.3 變異位點(diǎn)分析

對(duì)照正常人群變異分布，患兒1攜帶的變異位點(diǎn)c.401_c.402insA在Genome AD數(shù)據(jù)庫中次要等位基因頻率為0.000 9，另一個(gè)變異位點(diǎn)c.221delC在SNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫及ExAC數(shù)據(jù)庫中均未被收錄，ClinVar及HGMD數(shù)據(jù)庫也未見相關(guān)報(bào)道，屬BCHE基因新的變異。患兒2攜帶錯(cuò)義變異c.127G>A，該變異位點(diǎn)經(jīng)SIFT、Polyphen-2及MutationTaster在線分析，結(jié)果分別為0.009（有害的）、1.0（可能有害的）及1（致病的），預(yù)測(cè)該變異位點(diǎn)對(duì)蛋白功能可能存在危害性。依據(jù)ACMG指南，變異位點(diǎn)c.401_c.402insA/p.Asn134Lysfs*24為“致病性（PVS1+PS3）”、變異位點(diǎn)c.221delC/p.Pro74Hisfs*4為“可能致病性（PVS1+PM2）”，變異位點(diǎn)c.127G>A/p.Gly43Arg為“不確定性（PM1+PM2+PP3）”。

蛋白同源分析結(jié)果顯示，p.Gly43在不同物種間高度保守，且位于BCHE蛋白活性區(qū)域。當(dāng)發(fā)生p.Gly43Arg變異時(shí)，可導(dǎo)致其在空間結(jié)構(gòu)上與p.Thr54殘基發(fā)生碰撞，影響局部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)而可能產(chǎn)生危害性。見圖2。

圖2 變異蛋白空間結(jié)構(gòu)分析

3 討論

BChE是一種具有復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)的代謝酶，可對(duì)部分肌肉松弛劑（如琥珀酰膽堿）或普魯卡因等進(jìn)行高效水解[2，7]。缺乏BChE的患者因?qū)Σ糠炙幬锎x速度減緩，敏感性增強(qiáng)，較少出現(xiàn)疾病表型[5]。導(dǎo)致人體血清BChE降低的主要因素為肝臟疾病、腎臟疾病、營養(yǎng)不良、燒傷、體溫過低和懷孕，次要因素為包括毒品在內(nèi)的化學(xué)品及部分藥物，如單胺氧化酶抑制劑[8-10]。BCHED是由BCHE基因變異導(dǎo)致的，目前至少已報(bào)道了70種以上的BCHE基因變異，此類出現(xiàn)遺傳變異的患者通常無臨床表現(xiàn)，但若在術(shù)前使用琥珀酰膽堿等藥物，則易導(dǎo)致神經(jīng)肌肉阻滯延長，進(jìn)而引起呼吸暫?；蚧杳訹11]。本研究中的2例患兒均出現(xiàn)血清膽堿酯酶異常降低，其中患兒1首發(fā)癥狀為不明原因新生兒腹瀉，而患兒2表現(xiàn)為新生兒黃疸，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確認(rèn)無肝功能損傷，且無藥物中毒可能。BCHED患兒出現(xiàn)腹瀉表現(xiàn)的發(fā)病機(jī)制雖尚不明確，但已有的研究結(jié)果或能解釋其關(guān)聯(lián)性。與AChE在調(diào)節(jié)膽堿能信號(hào)方面的明確機(jī)制不同，BChE生理功能至今仍不清楚[10]。在正常生理環(huán)境下，BChE既可水解乙酰膽堿，也可水解丁酰膽堿，而乙酰膽堿水平降低可阻斷神經(jīng)傳導(dǎo)；當(dāng)BChE嚴(yán)重缺乏時(shí)，乙酰膽堿水平會(huì)異常升高，并激活膽堿能受體，使得肌肉收縮、胃腸道功能紊亂、尿失禁、副交感神經(jīng)張力增大，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)升高[2，12]。

BCHE基因位于3號(hào)染色體q26.1-q26.2區(qū)間，由4個(gè)外顯子組成，其編碼的BChE呈中心富集脯氨酸的四聚體結(jié)構(gòu)，可分布于全身組織，尤其高表達(dá)于肝臟、肺、大腦及心臟等器官，其表達(dá)量高于AChE，因此肝臟等器官損傷會(huì)引起B(yǎng)ChE水平降低[13-15]。本研究2例患兒BCHE基因發(fā)生復(fù)合雜合變異，且均攜帶c.401_c.402insA雜合變異。有研究報(bào)道，1例具有輕度智力障礙的14歲中國男孩存在該變異位點(diǎn)，由于BChE與AChE共同調(diào)控神經(jīng)節(jié)、軸突、神經(jīng)末梢及椎體生長等生理過程，因此當(dāng)BChE水平嚴(yán)重缺乏時(shí)，可能會(huì)下調(diào)相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)功能，進(jìn)而出現(xiàn)智力障礙的臨床表現(xiàn)[5]。BCHE基因變異導(dǎo)致BCHED的報(bào)道較少，因此需更多樣本以確定c.401_c.402insA雜合變異是否為我國人群的熱點(diǎn)變異。另外，患兒1攜帶的c.221delC雜合變異和患兒2攜帶的c.127G>A雜合變異在GlinVar等數(shù)據(jù)庫中尚未查到相關(guān)數(shù)據(jù)，屬BCHE基因新變異，這也進(jìn)一步拓展了BCHE基因變異譜-表型譜。

BCHED發(fā)病率在不同人群中有較大差別。BChE水平在正常水平10%以下的類型稱為沉默型BCHED，在歐美人群中極為罕見，BCHE基因純合變異發(fā)生率約為1/100 000[2]；但在印度Vysya社區(qū)高頻發(fā)生，有研究隨機(jī)檢測(cè)了該地區(qū)221名居民，有9例為BCHE基因純合變異[15-16]。BCHED的另一種類型為K-型，BChE常低于正常水平的30%，該型在歐美人群及日本人群中最常見，約有1/70的患者BCHE蛋白第539號(hào)丙氨酸變異為蘇氨酸（p.Ala539Thr），而在K-型純合變異人群中至今尚未見肌肉松弛劑不良反應(yīng)的報(bào)道[17]。我國尚無BCHED相關(guān)大規(guī)模隊(duì)列研究，因此尚不清楚中國人群特異性變異類型及發(fā)病率。

綜上所述，本研究分析了2例因BCHE基因復(fù)合雜合變異導(dǎo)致的BCHED患兒臨床特征和遺傳信息，發(fā)現(xiàn)2個(gè)BCHE基因新變異（c.221delC與c.127G>A）。c.221delC為功能丟失型變異，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白功能降低；變異位點(diǎn)c.127G>A位于N-聯(lián)糖基化區(qū)域，可能影響局部酶結(jié)合功能。BCHED通常無臨床表型，但應(yīng)用琥珀酰膽堿等肌肉松弛劑時(shí)會(huì)增加呼吸抑制及昏迷等風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)避免對(duì)患兒使用這類藥物。本研究患兒1出現(xiàn)新生兒腹瀉癥狀是否與BCHE基因變異相關(guān)，仍需更多病例報(bào)道來進(jìn)行綜合分析，因此確定BCHE基因型與表型的關(guān)聯(lián)性非常重要。