草本觀賞植物組織培養(yǎng)中常見問題分析

劉曉紅,張瑩杰

(太原學院 藝術設計系,山西 太原 030032)

0 引言

植物組織培養(yǎng)是以植物細胞具有全能性這一原理為基礎,在人為創(chuàng)造的無菌環(huán)境下，將從植物體中分離得到的各種器官、組織、細胞等外植體材料，接種到人為提供適合其生長的培養(yǎng)基中，從而獲得新的組織、細胞或個體的技術[1]。在100多年的發(fā)展歷史中,已經有100余科1 000余種植物可以通過植物組織培養(yǎng)技術進行離體快繁[2]。此外,植物組織培養(yǎng)技術在良種快繁、作物改良、種質保存等領域發(fā)揮著很大的作用。草本觀賞植物如石竹、蘭花等[3]通過組織培養(yǎng)進行快速繁殖或脫毒培育而達到商品化生產;吊蘭、菊花等[4]通過單倍體育種獲得新型品種。然而在快速發(fā)展的同時,組織培養(yǎng)過程中也存在著一些一直無法忽略和攻克的技術難題,即褐化、玻璃化和菌類污染。三大難題的出現導致外植體材料生長異常甚至死亡,嚴重限制了繁殖速度,使其無法進行規(guī)?；a,甚至直接決定了一些植物組織培養(yǎng)的成功與否[5]。

1 褐化現象

褐化指的是外植體材料在離體組織培養(yǎng)的過程中,從組織切口釋放使培養(yǎng)基變成褐色物質,導致外植體也隨之失綠變褐直至死亡的現象[6]。

學者們普遍認為組織培養(yǎng)過程中外植體褐變主要是由于酶促褐變引起的[7]。由于切割外植體等造成分布在液泡內的酚類物質與分布在各種質體內或細胞質內酶的這種區(qū)域性分布遭到破壞,從而使氧化酶和底物在氧氣的作用下發(fā)生氧化反應,產生有毒的褐色醌類物質。酶、底物和氧化物是酶促褐化必須具備的3個條件,其中最主要的酶是多酚氧化酶(PPO),最主要的底物是酚類化合物。

酚類物質和酶的活性是影響褐化現象的主要原因,因此,降低褐化現象的主要途徑是采取一系列有效抑制酚類物質合成和控制酶的活性的措施[8]。

1.1 引起褐化現象的因素

1.1.1外植體

1)植物種類和基因型。植物體內含有較高木質素、單寧、色素、黃酮等酚類化合物，容易發(fā)生褐變。木本植物比草本植物更易產生褐化[9]。

同種植物不同品種的外植體材料發(fā)生褐變的程度也不盡相同,如周俊輝等[10]通過對不同品種觀賞鳳梨的吸芽進行防褐研究,結果表明粉菠蘿褐變程度最嚴重,然后是水塔花、紅星鳳梨,七彩鳳梨褐變程度最輕。

2)外植體生理狀態(tài)。取幼齡植物的幼嫩部位為外植體材料,其褐變程度遠低于成齡植物的成熟部位。因為幼嫩材料中所含酚類化合物含量比成熟材料中的少,特別是木質素的含量,研究表明剛剛木質化或半木質化為最佳取材部位[11]。此外,冬春季取材會比夏秋季取材褐化程度低,如蝴蝶蘭[12]組培夏季取材褐變較重。

1.1.2培養(yǎng)基

1)無機鹽種類和濃度。培養(yǎng)基中無機鹽的種類和濃度影響褐化,其一是因為培養(yǎng)基中一些無機物是合成某些氧化酶及其進行生理生化的必需元素[13],研究表明Ca2+、Mn2+、Mg2+等金屬離子可能是PPO的激活劑;其二是因為高濃度的無機鹽會造成外植體材料中的酚類物質溢出從而發(fā)生氧化反應,增加褐化率。如尚旭嵐[14]、馮寧[15]等研究發(fā)現鶴望蘭在1/2MS培養(yǎng)基的褐化率明顯低于MS培養(yǎng)基。

2)培養(yǎng)基硬度。一部分學者認為,液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基更容易解決褐變問題,因為當外植體材料從切口處產生酚類物質的時候,在液體培養(yǎng)基中可以快速擴散從而減少對外植體材料的傷害。如鶴望蘭在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時褐變率較固體培養(yǎng)基低[14]。

3)培養(yǎng)基的pH值。培養(yǎng)基的pH值對愈傷組織褐變的抑制作用可通過改變植物體褐變過程中的酶活性完成。當培養(yǎng)基偏堿性時,PPO中的酶蛋白和Cu2+脫離析出,使PPO失去活性,從而減少褐變發(fā)生[6]。低 pH水培并不能抑制朱頂紅鱗莖的褐化,且不利于朱頂紅的生長與增殖[16]。

4)植物生長調節(jié)劑。培養(yǎng)基中激素種類、濃度和組合配比都會影響褐化。BA、ZT、KT等細胞分裂素會加速酚類化合物的產生,提高褐化率,而2,4-D、IAA等生長素會延緩酚類化合物的產生,降低褐化率[17]。但細胞分裂素和生長素在合適濃度的配比下不僅可以降低褐化率,還會促進外植體材料的生長分化,郝捷[18]在卡特蘭愈傷組織繼代培養(yǎng)中發(fā)現,培養(yǎng)基中添加3 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA增殖倍數和褐化率綜合效果最好。

1.1.3抗褐化劑

抗褐化劑可以分為吸附劑、抗氧化劑和螯合劑三大類,三類抗褐化劑的種類和作用機理如表1所示。

表1 三類抗褐化劑Tab.1 Three kinds of antioxidants

不同草本觀賞植物在組織培養(yǎng)過程中適合的抗褐化劑種類和防止褐化的效果存在很大差異,抗褐化劑的使用還會不同程度地影響外植體分化與生長,如廖煥琴[16]研究發(fā)現朱頂紅鱗莖培養(yǎng)基中添加AC 表現出良好的抗褐化作用,且不影響增殖。

1.1.4其他影響因素

適當減少培養(yǎng)時間和增加轉瓶時間會明顯降低褐變程度,如陳菲等[19]通過對蝴蝶蘭15 d,25 d,30 d繼代轉瓶培養(yǎng)的研究發(fā)現,隨著轉瓶周期的延長,外植體材料由正常生長到生長緩慢,色澤從綠色變成暗灰色,培養(yǎng)基也逐漸渾濁。培養(yǎng)溫度過高或光照過強會增強PPO活性,從而加速褐變產生。因此,適當的低溫處理或進行一段時間的暗培養(yǎng)有助于抑制外植體材料的褐化現象[12,20]。

1.2 防治褐化措施

1)選擇半木質化或剛木質化的植物材料做外植體,如一年生植物莖段,莖尖等。

2)在植物休眠期或生長緩慢的季節(jié)進行取材,如早春或者冬季。

3)提前對外植體材料或者母苗進行低溫處理、暗處理或熱激處理。

4)選擇適宜的培養(yǎng)基。

5)在不影響外植體材料正常生長的前提下,添加適宜種類和濃度的防褐劑。

6)低溫處理或進行一段時間暗培養(yǎng)。

7)適當增加外植體轉移的周期。

2 玻璃化

玻璃化是指在離體培養(yǎng)過程中,一些試管苗葉部甚至整個植株呈現出半透明甚至透明的水漬狀,植株腫大失綠,葉片皺縮翻卷的現象,此類植株也被稱為“玻璃苗”[21]。

2.1 玻璃化產生因素

研究發(fā)現,自然界中并不存在玻璃化現象,玻璃化只在組織培養(yǎng)的過程中發(fā)生[22]。有關玻璃化形成的原因,普遍認為是由于組培苗不適應培養(yǎng)環(huán)境,造成外植體體內水勢、激素或以NH4+為主的礦質元素供應失衡而引起玻璃化發(fā)生[23]。

2.1.1外植體材料

外植體種類會影響玻璃化的發(fā)生。據統(tǒng)計,在目前已知的200多種出現過玻璃化的植物中[24],草本植物比木本植物更容易出現玻璃化現象。此外,外植體大小、生理年齡及取材部位也會影響玻璃化的發(fā)生,外植體材料生理年齡越小,體積越小,越容易產生玻璃化,通常幼葉>老葉、頂芽>莖中段>莖基部,這可能是由于木質化程度稍高的外植體材料里存在某種抗玻璃化物質[25]。

2.1.2培養(yǎng)基成分

1)瓊脂和蔗糖濃度。固體培養(yǎng)基可以緩解玻璃化的產生,液體培養(yǎng)基容易造成玻璃化發(fā)生。一方面可能是由于瓊脂中含有K+、Mg2+、Fe2+等物質,影響著外植體體內離子平衡;另一方面是瓊脂和蔗糖維持著培養(yǎng)基的滲透壓,決定著培養(yǎng)基的水勢差。

2)NH4+。降低NH4+濃度會明顯預防外植體材料玻璃化的產生,主要原因是高濃度NH4+會抑制木質素合成的酶,使植株木質化程度降低,從而產生玻璃苗。如黃花花[26]等在大花萱草‘黃繡客’的培養(yǎng)中發(fā)現,隨著NH4NO3含量的減少,玻璃化率降低。

2.1.3培養(yǎng)環(huán)境

研究表明在植物離體培養(yǎng)期間,溫度、光照、透氣性等都間接影響外植體材料玻璃化。

1)光照。增加光照強度和光照時間有利于減少玻璃苗的發(fā)生,且越接近自然光的光照條件不僅可以明顯降低玻璃化現象,還有利于外植體材料生長,甚至可以通過自然光照射恢復一些玻璃苗?？赡苁亲匀还庵械淖贤饩€有利于促進外植體材料木質化的形成[24]。

2)溫度。研究發(fā)現24～26 ℃是組培最佳培養(yǎng)溫度[27],當培養(yǎng)溫度長時間超出或低于草本觀賞植物正常生長的溫度范圍會引起植物體代謝發(fā)生紊亂,從而造成玻璃化。但也有研究表明適當的低溫處理或在晝夜溫差較大的環(huán)境中培養(yǎng)有利于緩解玻璃化現象[28]。

3)透氣性。增加封口材料透氣性主要是為了使培養(yǎng)器皿中的O2、CO2、乙烯達到動態(tài)平衡、降低培養(yǎng)環(huán)境的相對濕度從而減少玻璃化現象?！八芰掀?棉塞”[27]是增加透氣性的最佳搭配。

2.2 玻璃化防治措施

玻璃化現象的發(fā)生是適應性的生理問題,具有逆向生長的特點[23]。近些年來對于玻璃化的防控措施主要是前期預防與后期恢復相結合,具體可以采取以下措施:

1)采用NH4+的濃度較低的培養(yǎng)基,如B5、NH4+較低的MS 等基本培養(yǎng)基。

2)適當降低細胞分裂素6-BA的用量,增加干物質的積累。

3)降低培養(yǎng)基中的水勢,如采用固體培養(yǎng)基,控制蔗糖濃度。

4)改善培養(yǎng)基的通氣狀況,采用透氣性好的材料做培養(yǎng)容器[29]。

5)在培養(yǎng)基中添加抗玻璃化的物質,如AgNO3、青霉素、多效唑等。

6)增加自然光照射時間,最好是在自然光下進行培養(yǎng)。

7)熱激處理。

3 菌類污染

污染是指在植物離體培養(yǎng)期間,外植體材料在適宜的環(huán)境中受到細菌、真菌等微生物的侵染,導致培養(yǎng)基被污染,外植體死亡的一種現象[30]。

3.1 植物組織培養(yǎng)中污染來源

植物組織培養(yǎng)中的污染按病原可分為細菌污染和真菌污染兩大類,其特點如表2所示。

表2 細菌污染和真菌污染Tab.2 Bacterial contamination and fungal contamination

3.2 污染防治

由于細菌通過分裂進行繁殖,所以當培養(yǎng)基受到細菌污染的時候,可以通過采取切除感染部分來挽救外植體材料;而真菌是靠孢子繁殖,傳播性比較快,所以一旦外植體材料受到真菌污染,需對污染的種苗進行高溫高壓滅菌處理,以防對環(huán)境造成污染。通常可以采取以下措施來預防污染發(fā)生。

3.2.1外植體材料

成年植株生長環(huán)境越復雜,帶菌越多,可以將一些易被污染的植物種植在溫室或進行水培,采取較幼嫩的部分作為外植體材料;其次最好是在晴朗的中午進行取材,強烈的陽光可以殺死部分真菌和細菌。如王安石等[34]在文心蘭組織培養(yǎng)中發(fā)現晴天上午11:00采摘外植體成活率高,在高溫多雨季節(jié)采摘外植體極易受到污染。另外不同外植體材料所選用的滅菌工序、滅菌試劑和滅菌時間存在差異,具體植物需要具體分析。

3.2.2無菌防控

建立無菌環(huán)境的接種室和培養(yǎng)室,定期用75%(體積分數)酒精噴霧或2%(體積分數)的新潔爾滅溶液等對操作室、培養(yǎng)室等進行消毒,也可以用紫外線燈照射或甲醛熏蒸消毒,要求操作人員在操作過程達到無菌操作,如在接種時雙手切勿觸碰外植體材料;進入超凈工作臺前用酒精擦拭雙手;操作人員的著裝進行滅菌處理,如戴口罩、無菌帽,穿無菌服等。

3.2.3添加抑菌劑

在培養(yǎng)基中添加抗生素可以有效防止污染的發(fā)生,如在鐵皮石斛的組織培養(yǎng)中添加鏈霉素[35],在竹芋組織培養(yǎng)中添加慶大霉素[36]能夠有效抑制細菌的產生?？股氐氖褂么龠M了組培技術的新發(fā)展,開放式組織培養(yǎng)不僅放寬了對培養(yǎng)環(huán)境的要求,還有效減少污染發(fā)生[37]。然而抗生素是一種極其不穩(wěn)定的物質,遇高溫易分解[32],所以在組培過程中不可直接與培養(yǎng)基進行高溫滅菌,需進行過濾滅菌,加大了工作流程,增加了生產成本。此外,長期使用抗生素不但無法減輕污染,還會對植物產生毒害作用[37]。

3.2.4新型消毒方法

經過科學家不斷大膽探索,得到一些新型消毒劑和消毒方法來進一步減少污染的產生。如真空減壓方法滅菌、臭氧消毒、磁力攪拌、超聲振動、多次滅菌、多種滅菌劑混合滅菌等方法[38]。

4 結語

縱觀影響褐變和玻璃化的因素,可以明顯看出褐變和玻璃化的影響因素大同小異,但對褐變和玻璃化影響程度卻大相徑庭,如木質化程度越高的外植體材料越容易發(fā)生褐變卻不易發(fā)生玻璃化;固體培養(yǎng)基比液體培養(yǎng)基更有利于減輕玻璃化的發(fā)生,對褐變的影響卻不相同。這可能是由于褐變和玻璃化發(fā)生機理不同,引起外植體材料體內相關基因、酶、蛋白質等發(fā)生相互作用。

采取增加自然光照射、進行熱激處理和加大晝夜溫差等措施可以使玻璃苗恢復成正常苗,今后可以加大對恢復玻璃苗的研究,減少玻璃苗的浪費。

相對于褐變和玻璃化,菌類污染主要是由于外界環(huán)境和人員操作不當造成的,然而,一旦外植體材料發(fā)生污染現象,外植體材料死亡幾率最大,且遭受真菌污染的外植體材料將無法再次使用。通過對操作環(huán)境進行不斷消毒滅菌、提高操作人員組培技術來盡可能減少污染,將污染控制在低水平。除此之外,可以通過添加抑菌劑或改進消毒滅菌的方法來減少污染發(fā)生,但目前所使用的抑菌劑大都成本較高,長期使用還可能對外植體產生毒害作用,所以尋找更加高效無毒的方法來代替抑菌劑是非常值得探索的問題。

目前有關對褐化、玻璃化及菌類污染發(fā)生機理研究還處在淺層次的分析階段,相信未來對造成褐化、玻璃化及菌類污染相關基因、蛋白、酶及其他分子領域的不斷深入研究,會從根源上解決三大難題。