普伐他汀與普伐他汀聯(lián)合參麥注射液預(yù)處理對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷的療效比較*

凌美蓉 潘 飛 張冬青 程德山

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是造成不可逆心肌損害的主要原因，發(fā)病率和死亡率較高，及時(shí)再灌注是臨床上限制梗死范圍和挽救缺血心肌的常用重要方法。然而，再灌注可能導(dǎo)致心肌缺血-再灌注損傷(Myocardial Ischemia-reperfusion Injury，MIRI)。如何干預(yù)MIRI是臨床熱點(diǎn)課題之一。MIRI由多種因素參與，氧自由基的產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞活化釋放的炎性因子即為MIRI重要因素；炎癥反應(yīng)和炎性因子高水平與缺血后心臟功能損傷及細(xì)胞壞死數(shù)量直接相關(guān)[1]。他汀類藥物具有減少炎性介質(zhì)產(chǎn)生、抑制中性粒細(xì)胞活化等作用[1, 2]。參麥注射液是一種中藥復(fù)方制劑，能有效清除各種氧自由基[3-5]。這兩種藥物靶點(diǎn)各有側(cè)重，理論上沒有配伍禁忌，或?qū)IRI治療有良好的互補(bǔ)、促進(jìn)作用。本研究通過MIRI家兔模型，對(duì)比觀察普伐他汀與普伐他汀聯(lián)合參麥注射液預(yù)處理MIRI兔對(duì)其血液常規(guī)指標(biāo)、心肌間隙面積及心肌組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)水平的影響，為MIRI的干預(yù)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及藥物、試劑

全自動(dòng)凝膠圖像處理系統(tǒng) (Pharmacia公司, ImagemasterVDS)；紫外分光光度計(jì) (日本 Shimadzu公司, UV-2201)；XE-2100型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及實(shí)驗(yàn)試劑、質(zhì)控品(日本Sysmex公司)；動(dòng)物呼吸機(jī)(HX-100E，成都泰盟科技有限公司)；動(dòng)物電生理記錄儀(PowerLab15T，ADInstrument，澳大利亞)；光學(xué)顯微鏡(SWZ-168，O-lympus，日本)；電泳儀(BIO-RAD，Model250/2.5，瑞典)；Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀、GelDocEZ凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；普伐他汀片(10mg/片，中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20033215，批號(hào)：H10950315)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配制成9.7mg/ml溶液；參麥注射液為正大青春寶藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(國藥準(zhǔn)字Z20093648，批號(hào)：010873，10ml/支)。 抗家兔TNF-α，IL-6一抗以及山羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司(批號(hào)：ab183218、ab271042、ab97051)；GAPDH、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光底物均購自中國賽默飛世爾科技有限公司(批號(hào)：MA5-31976、A53225、A38554)；PVDF膜購自Millipore；HE染色試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司(批號(hào)：S20202-2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理

健康雄性新西蘭大白兔24只(復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量2.0-2.5kg，根據(jù)體質(zhì)量編號(hào)，隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(N組)、MIRI模型組(M組)、普伐他汀干預(yù)組(P組)、普伐他汀聯(lián)合參麥注射液干預(yù)組(PS組)，每組6只。N組和M組于建模前3h以100ml/kg生理鹽水灌胃一次， P組和PS組于建模前3h，用普伐他汀實(shí)驗(yàn)溶液按10mg/kg灌胃，PS組還于模前30min耳緣靜脈注射參麥注射液3ml/kg[6]。

1.3 MIRI模型制備[6]

實(shí)驗(yàn)兔仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，腹腔注射20%烏拉坦(3ml/kg)麻醉，氣管插管，連接呼吸機(jī)，同時(shí)將針式電極插入四肢皮下及左側(cè)胸壁皮下，與電生理記錄儀連接，動(dòng)態(tài)觀察并記錄心電圖(ECG)。于胸骨左緣第3，4肋剪斷肋骨，開胸器撐開胸腔，充分暴露縱隔及心臟，剪開心包膜顯露冠狀動(dòng)脈左室支，于左心耳下2mm處用縫線穿繞冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)。N組僅穿線，不結(jié)扎LAD，曠置160min。M組、P組及PS組放置硅膠管后一起結(jié)扎LAD(活結(jié))，關(guān)胸，留置線頭于胸外。結(jié)扎LAD見左心室前壁顏色變灰白色，心搏減弱，ST段弓背上抬大于0.2mV、T波高聳，表示LAD完全結(jié)扎，持續(xù)40min后緩慢拉出結(jié)扎線，再灌注120min，以ST段下降≥1/2、左心室出現(xiàn)充血為再灌注成功。所有操作均在室溫25℃左右進(jìn)行。三組家兔均造模成功且實(shí)驗(yàn)過程中無死亡。

1.4 血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)

再灌注完成后，采集各組家兔頸內(nèi)靜脈血5ml，EDTA-K2抗凝，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀按常規(guī)方法檢測(cè)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞分類、中性粒細(xì)胞分類、血小板計(jì)數(shù)等指標(biāo)。

1.5 心肌間隙面積測(cè)定

取血完成后迅速取出心臟，切除心房及右心室，縱行切開左心室，生理鹽水沖洗干凈，取部分于10%福爾馬林中固定。按常規(guī)方法進(jìn)行組織透明、石蠟包埋，切片4μm，蘇木精伊紅(HE)染色。每只家兔取一張切片放在顯微鏡下觀察心肌形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化后，參照Tu等[7]方法，依據(jù)每張切片上的心肌間隙大小判斷心肌損傷程度，并依據(jù)Image J軟件測(cè)算心肌間隙灰度值進(jìn)行定量分析?；叶戎翟酱?，心肌間隙面積越大，心肌損傷越嚴(yán)重，反之亦然。

1.6 Western Blotting檢測(cè)各組TNF-α和IL-6水平

取其余左心室于液氮中研磨成粉，加入RIPA裂解液冰上裂解20min，12 000r/min離心5min，取上清，采用BCA蛋白含量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。上樣，SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜上，用5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜封閉2h，TNF-α(1∶500)、IL-6(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后用羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育2h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配制發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30s，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白灰度信號(hào)。以GAPDH為內(nèi)參，用目標(biāo)條帶與GAPDH條帶的灰度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，比值越大，TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)水平越高，反之亦然。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組血常規(guī)部分指標(biāo)比較

各組血液檢測(cè)部分指標(biāo)結(jié)果如表1所示。四組家兔在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞分類、中性粒細(xì)胞分類和血小板計(jì)數(shù)方面差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但四組間的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白濃度兩個(gè)指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)。M組白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞分類相較于N組顯著增多(t值分別為14.299、8.613，P<0.01),P組、PS組與M組相比，白細(xì)胞數(shù)量顯著降低(t值分別為3.197、5.656，P<0.01)，中性粒細(xì)胞分類明顯減少(t值分別為3.180、5.860，均P<0.01)，且PS組更低于P組(t值分別為3.199、3.078，P<0.01)。在淋巴細(xì)胞分類，M組明顯少于N組(t=4.263，P<0.01)，P組、PS組較M組顯著增加(t值分別為3.159、3.075，P<0.01)，但PS組與P組無明顯差異(t=1.331，P>0.05)。M組與N組相比，血小板數(shù)量明顯增加(t=5.039，P<0.01)，而P組、PS組、M組在血小板數(shù)量上均無顯著性差異(均P>0.05)。見表1。

表1 各組血常規(guī)部分指標(biāo)比較均=6)

2.2 各組心肌間隙面積比較

HE染色顯示，N組家兔左室心肌組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤；M組心肌組織出現(xiàn)不同程度的病變，主要為心肌纖維斷裂、排列紊亂，細(xì)胞腫脹、間隙變寬及炎性細(xì)胞浸潤；P組和PS組心肌較M組排列整齊，清晰，間隙變窄，炎性細(xì)胞浸潤減少；PS組上述變化較P組更為明顯。定量分析顯示，各組家兔心肌間隙灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相較于N組，M組灰度值顯著增加(t值為7.829，P<0.01)，而P組和PS組顯著低于M組(t值分別為4.855、7.457，P<0.01)，PS組較P組更低(t值為4.306，P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 各組家兔心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE，×400)

表2 各組家兔心肌間隙灰度值比較均=6)

2.3 各組心肌組織TNF-ɑ和IL-6蛋白水平及與心肌間隙面積的關(guān)系

Western Blotting結(jié)果顯示，四組家兔心肌組織中TNF-α、IL-6蛋白電泳灰度比值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。M組較N組顯著升高(t值分別為4.316、5.363，均P<0.01)，而P組和PS組較M組顯著降低(t值分別為2.568、3.107、2.954、4.616，P<0.05或P<0.01)，PS組較P組降低更明顯(t值分別為3.188、2.600，P<0.01或P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 各組家兔心肌組織TNF-α和IL-6蛋白電泳圖(Western Blotting)

表3 各組家兔心肌組織中TNF-α、IL-6水平變化(灰度比值，均=6)

相關(guān)性分析表明TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平與心肌間隙面積均呈顯著正相關(guān)(均P<0.01)。見圖3。

圖3 TNF-α和IL-6與心肌間隙面積相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3 討 論

MIRI是一個(gè)極其復(fù)雜的多因素、多途徑的病理生理過程[8]。心肌缺血再灌注后缺血心肌細(xì)胞和血管會(huì)發(fā)生明顯病變，MIRI過程中大量炎性因子的釋放，會(huì)進(jìn)一步加劇心肌損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重心律失常和心功能不全，甚至死亡[9-11]。因此，如何減少M(fèi)IRI成為臨床熱點(diǎn)問題。研究表明，在再灌注過程中或之后應(yīng)用藥物緩解或消除炎癥對(duì)改善MIRI是非常有效的方法[12]，臨床常用藥物包括他汀類和中藥參麥注射液等，他汀類藥物可通過提高磷酸化的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平，改善血管內(nèi)皮功能途徑減輕MIRI[13]，而參麥注射液主要通過減少氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用和心肌細(xì)胞Ca2+超負(fù)荷，減少細(xì)胞凋亡及炎癥等干預(yù)MIRI的發(fā)生[14]。本研究比較普伐他汀聯(lián)合參麥注射液與單獨(dú)使用普伐他汀預(yù)處理實(shí)驗(yàn)性MIRI動(dòng)物模型的療效，進(jìn)一步驗(yàn)證普伐他汀聯(lián)合參麥注射液優(yōu)于單用普伐他汀的治療結(jié)果，更為臨床應(yīng)用該中西醫(yī)治療方法干預(yù)MIRI提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量和分類是血常規(guī)檢查重要指標(biāo)，其水平異常與體內(nèi)炎癥有關(guān)。本文結(jié)果顯示，M組白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞分類明顯高于N組，淋巴細(xì)胞分類低于N組，P組上述指標(biāo)中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞分類顯著降低，PS組降低更明顯，P組、PS組血小板計(jì)數(shù)也有降低，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而淋巴細(xì)胞分類在P組和PS組均高于M組。這些數(shù)據(jù)反映的體內(nèi)炎癥變化與心肌組織中TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)水平的變化趨勢(shì)相一致。TNF-α作為一種自分泌因子，可促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和相互作用，使粒細(xì)胞向缺血再灌注區(qū)域的浸潤大大增加，從而導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，加重心肌損害[15, 16]。IL-6主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，亦可促進(jìn)多種炎癥因子的生成[17]，引起缺血再灌注心肌損傷的形成和發(fā)展。本研究顯示，M組TNF-α和IL-6水平顯著高于N組，而P組和PS組低于M組，PS組更低于P組，表明普伐他汀聯(lián)合參麥注射液治療MIRI炎癥效果優(yōu)于單獨(dú)使用普伐他汀，更有利于改善MIRI。

心肌排列整齊度及心肌間隙大小是評(píng)價(jià)心肌損傷程度的重要指標(biāo)[7]。本研究通過HE染色觀察各組心肌間隙大小(灰度值)，結(jié)果顯示，P組和PS組心肌間隙灰度值顯著小于M組，且PS組較P組更小，即普伐他汀聯(lián)合參麥注射液預(yù)處理可能明顯改善MIRI兔心肌損傷程度。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該作用與其TNF-α和IL-6蛋白水平變化存在明顯正相關(guān)關(guān)系，且與TNF-α相關(guān)程度更高。提示普伐他汀聯(lián)合參麥注射液可能通過降低TNF-α和IL-6等炎性因子表達(dá)，展現(xiàn)減輕心肌損傷程度的療效。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步表明普伐他汀聯(lián)合參麥注射液預(yù)處理MIRI可明顯降低實(shí)驗(yàn)兔血液炎性指標(biāo)及心肌炎性因子表達(dá)水平，有效改善心肌損傷，效果均優(yōu)于單用普伐他汀，對(duì)臨床應(yīng)用中西藥聯(lián)合防治MIRI有一定的參考作用。

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本文第一作者簡介：

凌美蓉(1981-)，女，漢族，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樾募∪毖俟嘧p傷