乳腺癌BRCA1-mRNA 表達(dá)及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性

李曉鋒 汪園園 劉希

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科（西安710061）

乳腺癌是指發(fā)生于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，隨著近些年居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，乳腺的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢。臨床數(shù)據(jù)顯示，全球乳腺癌年新增例數(shù)由1980年的64.1 萬增長到2010年的164.3 萬，年均增長率高達(dá)3.1%。我國乳腺癌發(fā)病率也處于持續(xù)增長狀態(tài)，過去30年內(nèi)幾乎增長1 倍，且城市女性乳腺癌病死率升幅高于農(nóng)村女性。隨著乳腺癌患病率不斷攀升，臨床研究者們加強(qiáng)了對病理機(jī)理的研究，以往的研究主要集中在雌激素、孕激素和原癌基因?qū)θ橄侔┎±硖卣鞯挠绊懛矫?。近年來，人們發(fā)現(xiàn)乳腺癌BRCA1是一種能夠?qū)p壞的DNA 進(jìn)行修復(fù)的基因片段，在調(diào)控細(xì)胞周期、DNA 修復(fù)中發(fā)揮重要作用。甲基化是調(diào)節(jié)機(jī)體基因表達(dá)與關(guān)閉的重要過程，目前已經(jīng)證實啟動子甲基化與乳腺癌的發(fā)生存在密切聯(lián)系。而本文則主要研究BRCA1 及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)對乳腺癌患者病理特征間的關(guān)系［1-2］，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2018年2月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理活檢確診為乳腺癌的350例患者為實驗組，另選取50例同期于我院進(jìn)行體檢的健康女性為對照組，實驗組350 例患者中年齡35～59 歲，平均年齡（46.21±2.68）歲，59 例為小管癌，64 例為鱗狀細(xì)胞癌，49 例為浸潤性小葉癌，82 例為浸潤性導(dǎo)管癌，51 例為髓樣癌，45 例為腺癌，組織學(xué)分級Ⅰ級80 例，Ⅱ期90 例，Ⅲ期90 例，Ⅳ期90 例，對照組50 例患者中年齡35～60 歲，平均（45.26±3.08）歲，兩組研究對象一般資料如年齡、體質(zhì)量、是否停經(jīng)等資料對比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）實驗組患者均經(jīng)病理學(xué)活檢確診為乳腺癌；（2）患者意識清晰能夠配合進(jìn)行調(diào)研；（3）病歷資料齊全；（4）患者對本次調(diào)研過程方法、原理、過程清楚明白并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神疾患者；（2）合并其他器質(zhì)性疾病如冠心病、腎衰竭等；（3）合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者；（4）合并其他惡性腫瘤者；（5）依從性差者。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌易感基因1-mRNA（BRCA1-mRNA）水平測定 采取所有入選對象空腹靜脈血5 mL，加入抗凝劑混勻后，置于離心機(jī)上，3 000 r∕min 速率進(jìn)行離心，取上層清液，加入TRIzol LS 試劑，混勻后放于-80 ℃環(huán)境中儲存，待所有入選對象血樣采集齊全后統(tǒng)一進(jìn)行BRCA1-mRNA 水平測定；取1 mL 含有TRIzol LS 的血清，加入200 μL 氯仿，混勻后冰水浴，于4 ℃條件下高速離心9 min，取上層清液，加入異丙醇、醋酸鈉及糖原，于-20 ℃條件下靜置60 min，而后取出高速離心，去除上層清液，加入75%乙醇充分混勻，高速離心，去除上層清液，60 ℃條件下靜置晾干，加入純水混勻，高速離心，而后于60 ℃條件下靜置10 min，加入適量緩沖液及酶，微微振蕩，離心，于37 ℃條件下靜置30 min，加入DNA酶抑制劑，高速離心后，吸取上層清液，而后采取熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測BRCA1-mRNA水平。

1.2.2 啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)測定 采取所有入選對象空腹靜脈血5 mL，加入抗凝劑混勻后，置于離心機(jī)上，3 000 r∕min 速率進(jìn)行離心，取上層清液，加入DNA 抽提緩沖液，混勻后于50 ℃條件下水浴1 h，而后加入蛋白酶K，于50 ℃條件下水浴12 h，加入等體積飽和酚，充分混勻，高速離心10 min，取上層清液，使用氯仿-異戊醇溶液抽提1 次，而后加入2 倍體積的無水冰乙醇進(jìn)行DNA沉淀，濾出沉淀DNA，使用70%乙醇清洗3 次，室溫干燥，加入適量TE 溶液，于-20 ℃條件下保存；取2～5 μg DNA 加入雙蒸水至50 μL，而后加入氫氧化鈉，于50 ℃條件下反應(yīng)20 min，加入30 μL 10 mmol∕L 的對苯二酚與520 μL 3.6 mol∕L 亞硫酸氫鈉，于54 ℃條件下反應(yīng)16 h，而后進(jìn)行DNA 純化，純化后的DNA 加入50 μL 80 ℃的雙蒸水，加入3 μL 的氫氧化鈉對DNA 進(jìn)行修飾，經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾的DNA 使用無水乙醇和糖原進(jìn)行沉淀處理，而后干燥置于-40 ℃條件下保存；取處理得到的修飾DNA 使用甲基化特異性PCR 法檢測啟動子區(qū)甲基化陽性狀態(tài)；

1.3 觀察指標(biāo)及評測標(biāo)準(zhǔn) 觀察指標(biāo)即為實驗組與對照組BRCA1-mRNA 水平與其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，記錄后進(jìn)行對比分析；

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0對采集的數(shù)據(jù)實施分析，計量資料以的形式表示，數(shù)據(jù)使用正態(tài)分布進(jìn)行檢驗，示符合正態(tài)分布，組間差異使用單因素方差進(jìn)行分析統(tǒng)計，相關(guān)性分析采用雙變量直線相關(guān)分析，取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組BRCA1-mRNA 水平與啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)對比 經(jīng)評測記錄，發(fā)現(xiàn)實驗組患者BRCA1-mRNA 水平低于對照組，啟動子區(qū)甲基化陽性狀態(tài)比率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組BRCA1-mRNA 水平與啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)對比Tab.1 Two groups of brca1-mrna level compared with the promoter region methylation status±s

表1 兩組BRCA1-mRNA 水平與啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)對比Tab.1 Two groups of brca1-mrna level compared with the promoter region methylation status±s

組別實驗組對照組t 值P 值例數(shù)350 50--BRCA1-mRNA 水平（102 copy∕mL）1.69±0.05 5.26±0.16 3.264＜0.05啟動子區(qū)甲基化陽性［例（%）］261（74.57）7（14.00）2.514＜0.05

2.2 BRCA1-mRNA 水平與臨床病理相關(guān)性 經(jīng)測量分析，實驗組患者BRCA1-mRNA 水平與其年齡、TNM 分期、組織學(xué)分級不存在相關(guān)性，但與腫瘤大小存在相關(guān)性（r=-0.016，P＜0.05），見表2。

2.3 啟動子區(qū)甲基化與臨床病理相關(guān)性 經(jīng)測量對比，啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者年齡、TNM 分期、腫瘤大小無顯著相關(guān)性，但與組織學(xué)分級存在相關(guān)性（r=0.681，P＜0.05），見表3。

表2 BRCA1-mRNA 水平與臨床病理相關(guān)性Tab.2 BRCA1-mRNA level and clinical pathologic correlation ±s

表2 BRCA1-mRNA 水平與臨床病理相關(guān)性Tab.2 BRCA1-mRNA level and clinical pathologic correlation ±s

病歷資料年齡≥50 歲＜50 歲組織學(xué)分級例數(shù)BRCA1-mRNA 水平（102 copy∕mL）P 值210 140 1.33±0.15 1.64±0.06 0.681ⅠⅡⅢⅣ80 90 90 90 1.93±0.16 1.89±0.08 1.69±0.18 1.53±0.28 0.721 TNMⅠⅡⅢ129 150 71 1.86±0.15 1.78±0.28 1.54±0.18 0.985腫瘤大小≥5 cm＜5 cm 200 150 1.21±0.06 1.68±0.38 0.051

表3 啟動子區(qū)甲基化與臨床病理相關(guān)性Tab.3 The promoter region methylation and clinical pathologic correlation

3 討論

乳腺癌是女性較為常見的惡性腫瘤之一［3］，其發(fā)病機(jī)制為乳腺上皮細(xì)胞在內(nèi)外界因素刺激下，發(fā)生基因突變進(jìn)而出現(xiàn)異常增殖，發(fā)生無序、無限制惡性增生［4］，其主要表現(xiàn)形式為癌細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，進(jìn)而破壞周圍正常組織，改變?nèi)橄僬＝Y(jié)構(gòu)。乳腺癌好發(fā)于40～60 歲之間，絕經(jīng)期前后女性乳腺癌發(fā)病率較高，臨床研究顯示，乳腺癌的發(fā)病原因包括遺傳、電離輻射、不健康飲食等，隨著近些年我國工業(yè)化的推進(jìn)和居民生活方式的改變，乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢，乳腺癌的主要臨床表現(xiàn)包括乳房腫塊、乳腺疼痛、腋窩淋巴結(jié)腫大等，由于該癥發(fā)病初期癥狀并不明顯，導(dǎo)致女性患者額對病情不甚重視，因而其病死率較高［5-8］。早期診斷和治療對乳腺癌預(yù)后具有極為重要的意義，近些年，隨著對乳腺癌分子生物學(xué)研究的深入，基因?qū)哟螌嶒炇以\斷方式成為判斷乳腺癌病情的重要手段之一。

BRCA1 是于1990年被發(fā)現(xiàn)的、與乳腺癌遺傳性直接相關(guān)聯(lián)的基因片段，該基因位于人體第17號染色體上，臨床研究證實，該基因能夠表達(dá)出抑制惡性腫瘤發(fā)生的效果，其主要功效為修復(fù)損壞的DNA、調(diào)節(jié)人體細(xì)胞復(fù)制、參與人體細(xì)胞生長等，如果機(jī)體BRCA1 基因片段出現(xiàn)損壞，其表現(xiàn)的抑癌功效就會減弱。學(xué)者解云濤通過研究指出，BRCA1 基因突變與家族性乳腺癌關(guān)系較為密切，該學(xué)者指出，白種人患有家族性乳腺癌患者中，約有15%～20%出現(xiàn)BRCA1 基因突變，而年齡高于70 歲人群如出現(xiàn)BRCA1 基因突變，則其發(fā)生乳腺癌的概率高達(dá)60%～80%；有學(xué)者的研究指出，國內(nèi)家族性乳腺癌患者中約有12.9%出現(xiàn)了BRCA1 基因突變，而北京大學(xué)通過對409 例患有家族性乳腺癌患者進(jìn)行檢測的方式也發(fā)現(xiàn)，有10.5%的患者出現(xiàn)了BRCA1 基因突變，以上研究均提示，BRCA1 基因突變是乳腺癌發(fā)生的重要危險因素。

甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要修飾手段，其主要作用為調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、關(guān)閉，近些年的研究指出，基因片段的甲基化與癌癥、老年癡呆等癥的發(fā)生具有密切聯(lián)系［9-11］，機(jī)體中甲基化最常見的修飾類型分為DNA 甲基化與組蛋白甲基化，其中DNA 甲基化的作用為關(guān)閉基因表達(dá)，多項臨床研究證實，BRCA1 啟動子甲基化與乳腺癌的發(fā)生及病情發(fā)展存在較為密切的聯(lián)。學(xué)者劉韜等通過對198 例散發(fā)行乳腺癌患者與27 例乳腺纖維腺瘤進(jìn)行對比分析的方式發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)明顯高于乳腺良性病變患者，同時分析可發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3A 表達(dá)成正相關(guān)，該學(xué)者分析認(rèn)為，啟動子區(qū)甲基化使BRCA1 蛋白表達(dá)水平降低，減弱了機(jī)體抑癌功能，從而增加了乳腺癌的發(fā)病率；有學(xué)者也通過研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織標(biāo)本中BRCA1甲基化頻率明顯高于癌旁組織（24.5%vs. 7.5%），該學(xué)者認(rèn)為通過對BRCA1 甲基化的檢測，能夠?qū)θ橄侔┑牟∏榘l(fā)展及預(yù)后進(jìn)行判斷。

通過設(shè)立實驗組與對照組的方式，就乳腺癌BRCA1-mRNA 表達(dá)及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與乳腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行了探究［12-14］。從表1可以看出，乳腺癌患者BRCA1-mRNA 表達(dá)顯著低于對照組，甲基化陽性狀態(tài)比率顯著高于對照組；同時經(jīng)相關(guān)性分析顯示，BRCA1-mRNA 水平與其年齡、TNM 分期、組織學(xué)分級不存在相關(guān)性，但與腫瘤大小存在相關(guān)性。而從表3的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與患者年齡、TNM 分期、腫瘤大小無顯著相關(guān)性，但與組織學(xué)分級存在相關(guān)性。由此推測，BRCA1-mRNA 的低表達(dá)與啟動子區(qū)甲基化之間存在一定關(guān)聯(lián)性，隨著乳腺癌患者病情的加重，其BRCA1-mRNA 的表達(dá)程度并未出現(xiàn)明顯波動，提示BRCA1-mRNA 在檢測乳腺癌中具有較高的準(zhǔn)確率，而多項臨床研究均指出，BRCA2 基因與乳腺癌的發(fā)病也存在較為密切聯(lián)系，且BRCA2-mRNA 水平與組織學(xué)分期存在相關(guān)性，提示BRCA2-mRNA 可以作為乳腺癌分期的參考指標(biāo)；本文的研究發(fā)現(xiàn)，即使健康女性中也存在部分啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，且隨著乳腺癌患者組織學(xué)分期的加重，甲基化狀態(tài)比率逐漸上升，這提示一方面啟動子甲基化參與了乳腺癌早期病變，另一方面啟動子甲基化狀態(tài)也與乳腺癌的病情發(fā)展存在關(guān)聯(lián)，有學(xué)者通過單中心、大樣本研究指出，BRCA1 基因甲基化與其臨床病理之間存在正相關(guān)聯(lián)系［15］，同時通過對BRCA1 基因甲基化狀態(tài)的測定能夠?qū)θ橄侔┗颊哳A(yù)后進(jìn)行判斷。本次實驗的特點是將BRCAI 水平和該基因甲基化作為兩個獨立的影響因素進(jìn)行分析，探究其對乳腺癌患者病理特征的影響，能夠為以后臨床乳腺癌的診斷治療提供指導(dǎo)［16-17］。

總之，乳腺癌BRCA1-mRNA 表達(dá)與乳腺癌患者病灶大小存在相關(guān)性，啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與乳腺癌患者組織學(xué)分期存在相關(guān)性，可以通過對這兩項數(shù)據(jù)的檢測來達(dá)到判斷乳腺癌患者病情的效果。