Rs1047214位點(diǎn)基因多態(tài)性與成年漢族人群肥胖相關(guān)性研究

劉衛(wèi)剛，楊少清,2，鈕曉敏，楊直堂，劉志軍,2*,王 宇，蘇偉超，何維紅，陸 云

(1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲056002；2.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲056002； 3.秦皇島市疾病控制中心；4.武安市第一人民醫(yī)院)

肥胖是一種由多因素引起的慢性代謝性疾病，已成為全球性的重要公共衛(wèi)生問題，超重和肥胖常與高脂血癥、糖尿病、高血壓等疾病在同一個(gè)體中聚集，進(jìn)而導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生或加重，稱為“代謝綜合征(MS)”[1-2]。PYY(peptide YY)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種由消化道遠(yuǎn)端黏膜L細(xì)胞分泌的食欲調(diào)節(jié)激素，主要調(diào)節(jié)食物的攝入，與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)[3]，為了解我國漢族人群PYY受體基因rs1047214位點(diǎn)多態(tài)性與肥胖相關(guān)性，對華中地區(qū)成年漢族人群進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇華中地區(qū)成年漢族肥胖病例400名，同時(shí)選取生活在同一地區(qū)按性別、年齡(±3)為匹配條件的非肥胖400名作為對照。肥胖判定標(biāo)準(zhǔn)[4]：體質(zhì)量過低：BMI<18.5 kg/m2，體質(zhì)量正常：18.5 kg/m2

1.2 PYY基因rs2880412 A/C多態(tài)性檢測從Genebank 下載PYY受體基因rs1047214位點(diǎn)的基因序列，采用PPrimer 5.0進(jìn)行該位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)，上游5′-CTTCCTGATTATTGGCTTGGC-3′，下游5′-CTGATGGTAGTGGTCATTTGC-3′，PCR擴(kuò)增條件：94℃條件下預(yù)變性5 min，94℃條件下變形30 s，60℃條件下退火40 s，72℃條件下延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃條件下延伸8 min，4℃保存。反應(yīng)體系是15 μl，包括10 μl PCR產(chǎn)物、0.5 μl酶和1 μl 10 × Buffer的混合產(chǎn)物，最后加入脫離子水補(bǔ)充體積至15 μl，置37℃水浴8-16 h。酶切過程：PCR產(chǎn)物中加入常規(guī)限制性內(nèi)切酶Nci1(bcn1)，37℃水浴過夜，在80 V電壓下、4.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)60 min，經(jīng)酶切反應(yīng)后基因型(T/T)片段為66 bp和223 bp，雜合基因(T/C)片段：66 bp、27 bp、196 bp和223 bp；純合子基因(C/C)片段：66 bp、27 bp和196 bp，由于本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳，靈敏度較低，故在凝膠中只能識別部分片段T/T：223 bp；T/C：196 bp和223 bp；C/C：196 bp。

1.3 DNA測序?yàn)楸ＷC測序結(jié)果PCR-RFLP分析的正確性，隨機(jī)抽取研究對象10%樣本進(jìn)行PCR產(chǎn)物基因型測定，符合率100%，對應(yīng)的PCR序列為：CTTCCTGATTATTGGCTTGGCCTGGGGC-ATCAGTGCCCTGCTGGCAAGTCCCCTGGCCA-TCTTCCGGGAGTATTCGCTGATTGAGATCA-TYCCGGACTTTGAGATTGTGGCCTGTACTG-AAAAGTGGCCTGGCGAGGAGAAGAGCATCT-ATGGCACTGTCTATAGTCTTTCTTCCTTGT-TGATCTTGTATGTTTTGCCTCTGGGCATTA-TATCATTTTCCTACACTCGCATTTGGAGTA-AATTGAAGAACCATGTCAGTCCTGGAGCTGCAAATGACCACTACCATCAG。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用EpiData軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)雙遍錄入，保證數(shù)據(jù)一致性。采用SPSS18.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，其中計(jì)量資料以表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)(%)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，基因型分布的Hardy-Weinberg平衡差異檢驗(yàn)采用haploview軟件分析。采用logistic回歸分析調(diào)整混雜因素分析不同模型基因位點(diǎn)多態(tài)性與肥胖的關(guān)聯(lián)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本情況肥胖組和對照組的基因型頻率均符合哈溫平衡(肥胖組：χ2=0.141,P=0.702；對照組：χ2=1.623,P=0.201)；肥胖組和對照組的年齡分別為(51.37±12.55)歲和(50.22±13.24)歲，兩組均值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.266，P=0.206)，通過對兩組婚姻狀況、文化程度、年人均收入指標(biāo)比較，肥胖組和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，說明研究人群具有較好的人群代表性。見表1。

表1 研究人群的基本情況

2.2 PYY受體基因rs1047214位點(diǎn)等位基因和基因型頻率分布

2.2.1Rs1047214位點(diǎn)等位基因(T/C)頻率分布 肥胖組中等位基因T、C的頻率分布為：82.75%和17.25%，對照組中等位基因T、C的頻率分布為：84.50%和15.50%，該等位基因在兩組中的頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.895，P=0.344)，較等位基因T，等位基因C與肥胖的發(fā)生無關(guān)聯(lián)(OR=1.14，95%CI:0.87-1.48)。

2.2.2Rs1047214位點(diǎn)基因型(TT/TC/CC)頻率分布 肥胖組中基因型TT、TC和CC的頻率分布為70.25%、25.00%和4.75%，對照組中基因型TT、TC和CC的頻率分布為70.75%、27.50%和1.75%，三種基因型在兩組中的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.022,P=0.049)。較基因型TT，基因型CC頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.378,P=0.020)，調(diào)整混雜因素體力活動后，基因型CC的OR(95%CI)為2.73(1.13-6.61)，見表2,圖1。

表2 肥胖組和對照組rs1047214位點(diǎn)等位基因和基因型頻率分布[n(%)]

圖1 PYY受體基因rs1047214位點(diǎn)的基因型電泳圖

2.3 PYY受體基因rs1047214位點(diǎn)多態(tài)性與肥胖的關(guān)聯(lián)性

以等位基因C為突變基因，調(diào)整部分混雜因素(體力活動、體重、TC、TG、HDL-C、SBP、DBP)，采用相加、顯性和隱性模型進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析(肥胖=1，非肥胖=0)。三種模型中，隱形模型顯示基因型CC與肥胖的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)(OR=2.80，95%CI:1.16-6.74)，見表3，圖2。

表3 Rs1047214位點(diǎn)多態(tài)性與肥胖的關(guān)聯(lián)性[n(%)]

圖2 PYY受體基因rs1047214位點(diǎn)基因多態(tài)性測序圖譜

2.4 不同基因型間生化指標(biāo)比較

不同基因型間生化指標(biāo)對比，其中基因型TT和TC+TT間血糖指標(biāo)均值在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；基因型TC+TT中膽固醇指標(biāo)均值在兩組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4種基因型間TG指標(biāo)均值在兩組中的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；4種基因型間LDL-C指標(biāo)均值在兩組中的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；四種基因型間HDL-C指標(biāo)均值在兩組中的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表4。

表4 不同基因型間各生化指標(biāo)比較

3 討論

目前，肥胖的發(fā)病率不僅在以高熱飲食為主的發(fā)達(dá)國家保持著上升趨勢，在發(fā)展中國家也成為影響國民健康的焦點(diǎn)，肥胖對患者的身心均造成一定程度的傷害，還可能導(dǎo)致生活質(zhì)量下降繼而加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-7]。本研究的基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的選擇主要是采用參考文獻(xiàn)法和標(biāo)簽SNP法，選擇其他人群中與疾病存在陽性關(guān)聯(lián)的PYY受體rs1047214位點(diǎn)，有研究顯示rs1047214位點(diǎn)多態(tài)性突變率與男性兒童青少年肥胖的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)[8]，本研究針對成年(≥18周歲)人群進(jìn)行該位點(diǎn)的病例對照研究，從遺傳學(xué)角度探討肥胖發(fā)生的可能機(jī)制[9]。

本研究抽取華中地區(qū)成年漢族人群進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，肥胖組的血糖、TC、TG、HDL-C、SBP、DBP等指標(biāo)均顯著高于對照組，但LDL-C在兩組中的頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示LDL-C指標(biāo)變化不受肥胖發(fā)生的影響[10]。由結(jié)果可以得出，肥胖的發(fā)生對血糖、血脂異常影響較大，進(jìn)而對機(jī)體產(chǎn)生不利影響。本研究的rs1047214位點(diǎn)等位基因T、C在肥胖組合對照組中的頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但病例組中基因型CC的頻率4.75%，顯著高于對照組的1.75%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示基因型CC與肥胖的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)，本研究進(jìn)一步調(diào)整混雜因素：體力活動、TC、TG等指標(biāo)采用相加、顯性和隱形模型進(jìn)行回歸分析[11]，提示基因型CC與肥胖的發(fā)生仍存在關(guān)聯(lián)(OR=2.80，95%CI:1.16-6.74)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，肥胖組的TC+CC、TC、TT、TC+TT基因型的TG指標(biāo)均值明顯高于對照組(P均<0.05)，而肥胖組的TC+CC、TC、TT、TC+TT基因型的HDL-C指標(biāo)均值明顯低于對照組(P均<0.05)，提示說明rs1047214位點(diǎn)4種基因型與高TG、低HDL-C的發(fā)生可能存在關(guān)聯(lián)；肥胖組的TT、TC+TT基因型的血糖指標(biāo)均值明顯高于對照組(P均<0.05)，提示rs1047214位點(diǎn)基因型TT、TC+TT與血糖升高可能存在關(guān)聯(lián)；肥胖組的TC+TT基因型的膽固醇(TC)明顯高于對照組(P<0.05)，提示rs1047214位點(diǎn)基因型TC+TT與膽固醇(TC)升高可能存在關(guān)聯(lián)。本研究僅僅從遺傳角度考慮四種基因型與相關(guān)生化指標(biāo)是否存在關(guān)聯(lián)，有一定的局限性，事實(shí)上肥胖的發(fā)生不僅受環(huán)境因素影響，而且受多種基因共同影響[12-13]，從多角度分析更為可靠。

本研究僅僅從某一位點(diǎn)進(jìn)行分析，未考慮環(huán)境因素及基因間的聯(lián)合作用，且樣本量較小，仍需要提高樣本量進(jìn)一步研究，驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。總之，肥胖是由多因素引起的慢性代謝性疾病[14]，希望本研究能夠?yàn)榉逝值陌l(fā)生及預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)，找到更好的治療途徑或方案[15]。

作者簡介：劉衛(wèi)剛(1985-)，男，碩士研究生，高級統(tǒng)計(jì)師，研究方向：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)。