跨膜蛋白16A 通過(guò)激活A(yù)KT1 信號(hào)通路對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖、侵襲影響

王 列， 申 健， 高 璐， 仲 莞， 李思思， 白 瑩，

張文竹北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110000

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性健康的一種惡性腫瘤，病死率較高[1-2]。 傳統(tǒng)的卵巢癌治療手段包括手術(shù)、化療及中西藥干預(yù)。 近年來(lái)，靶向治療成為臨床研究熱點(diǎn)，尋找新的卵巢癌生物分子標(biāo)記物及深入探討其病因和發(fā)病機(jī)制具有重要意義。 鈣激活氯通道跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)在多種腫瘤中高表達(dá)并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但有關(guān)TMEM16A 如何促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制，目前尚不清楚[3]。 本研究對(duì)癌癥基因組圖譜(THE CANCER GENOME ATLAS，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌患者的臨床數(shù)據(jù)和基因表達(dá)譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討TMEM16A 高低表達(dá)對(duì)卵巢癌患者生存期的影響，以及TMEM16A 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖侵襲的作用通路，為卵巢癌靶向治療提供理論基礎(chǔ)和研究數(shù)據(jù)。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。 TMEM16A 抗體(英國(guó)Abcam生物技術(shù)公司)；抗總AKT1 和磷酸化AKT1(p-AKT1，Ser473)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔二抗(英國(guó)Abcam 生物技術(shù)公司)；L-15 培養(yǎng)基(美國(guó)Gbico公司)；胎牛血清(美國(guó)Gbico 公司)；胰酶(美國(guó)Hyclone 公司)；Perifosine(Akt1 抑制劑)購(gòu)自上海MCE 公司；RIPA 緩沖液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)Beyotime Biotechnology 公司)；CCK-8 試劑盒(中國(guó)Biosharp 公司)；Lipofectamin 2000(美國(guó)Invitrogen 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 TCGA 數(shù)據(jù)收集 從TCGA 網(wǎng)站(http:/ /cancergenome.nih.gov/)下載卵巢癌患者的臨床數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。 臨床數(shù)據(jù)包括患者信息、腫瘤大小和存活時(shí)間等。 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包括患者編號(hào)、基因名稱和表達(dá)數(shù)值。 本研究按照TMEM16A 和AKT1 基因表達(dá)的中位值將患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，統(tǒng)計(jì)病灶>2 cm 的52 例卵巢癌患者的總生存曲線。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3 卵巢癌細(xì)胞解凍復(fù)蘇后接種于含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的L-15 培養(yǎng)液中，置入37℃、5% CO2的恒溫孵育箱中。 細(xì)胞傳代凍存采用胰酶消化并繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.3 轉(zhuǎn)染 TMEM16A 的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因公司。 采用Lipofectamin 2000 在SKOV3細(xì)胞中使用無(wú)血清的培養(yǎng)基瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的TMEM16A的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。 48 h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western blot 將轉(zhuǎn)染后的卵巢癌SKOV3細(xì)胞置于冰上，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液進(jìn)行勻漿。 將細(xì)胞裂解物以13 000 r/min 離心20 min，使用BCA 方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 目標(biāo)蛋白通過(guò)SDS-PAGE 分離，待蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上后用5%的脫脂牛奶封閉2 h，經(jīng)洗滌液清洗3 次，每次25 min 后，使用TMEM16A(1 ∶2 000)，AKT1(1∶2 000)和p-AKT1(1∶2 000)一抗孵育，4℃過(guò)夜。漂洗后將膜與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫下孵育1 h。 使用伯樂化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。

1.2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染TMEM16A 的SKOV3細(xì)胞(5 ×103個(gè)/孔)種植到96 孔板，24 h 后換成無(wú)血清培養(yǎng)，應(yīng)用10 μmol/L Perifosine(AKT1 抑制劑)刺激細(xì)胞24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液37℃一同溫育2 h。 采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值(optical density，OD)。

1.2.6 Transwell 細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染TMEM16A 的SKOV3 細(xì)胞150 μl(4 ×105個(gè)/ml)細(xì)胞懸液添加到已加入基質(zhì)膠的Transwell 小室上室中，下室加入含有20% 胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 24 h 后用4%多聚甲醛固定20 min，Giemsa 染液染色35 min，磷酸鹽緩(phosphate-buffered saline，PBS)清洗3 次，棄PBS 后于顯微鏡下隨機(jī)視野進(jìn)行拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。 計(jì)數(shù)資料用例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。 采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，并采用Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM16A、AKT1 基因高低表達(dá)的卵巢癌患者的生存期比較 統(tǒng)計(jì)TCGA 數(shù)據(jù)集中52 例卵巢癌患者的基因和臨床數(shù)據(jù)顯示，TMEM16A 基因高表達(dá)26 例，中位生存期(median survival，MS)為31.63 個(gè)月；TMEM16A 基因低表達(dá)26 例，MS 為54.00 個(gè)月；兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[風(fēng)險(xiǎn)比＝2.14(95%可信區(qū)間:1.09 ~4.36)，P <0.05]。AKT1 基因高表達(dá)26 例，MS 為40.43 個(gè)月；AKT1基因低表達(dá)26 例，MS 為73.93 個(gè)月；兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[風(fēng)險(xiǎn)比＝0.55(95%可信區(qū)間:0.25 ~1.19)，P<0.05]。 TMEM16A/AKT1 聯(lián)合高表達(dá)15 例，MS 為31.63 個(gè)月；TMEM16A/AKT1 聯(lián)合低表達(dá)15 例，MS 為58.20 個(gè)月；兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[風(fēng)險(xiǎn)比＝2.67(95% 可信區(qū)間:1.16 ~7.50)，P < 0.05]。 提示TMEM16A/AKT1高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后差，生存期顯著下降。見圖1。

圖1 卵巢癌患者中TMEM16A 與AKT1 基因表達(dá)的生存曲線圖(a.TMEM16A 基因高低表達(dá)患者生存曲線；b.AKT1 基因高低表達(dá)患者生存曲線；c.TMEM16A/AKT1 聯(lián)合高低表達(dá)患者生存曲線)

2.2 TMEM16A 對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中AKT1 蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與過(guò)表達(dá)TMEM16A 的卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中TMEM16A 蛋白表達(dá)分別為(0.59 ±0.05)、(0.98 ±0.08)，p-AKT1 蛋白表達(dá)分別為(0.54 ±0.03)、(1.10 ±0.08)，AKT1 蛋白表達(dá)分別為(1.21 ±0.13)、(1.20 ±0.09)。 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與過(guò)表達(dá)TMEM16A 的卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中TMEM16A 和p-AKT1 蛋白的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。 提示TMEM16A 高表達(dá)能夠激活卵巢癌細(xì)胞內(nèi)AKT1 信號(hào)通路。 見圖2。

圖2 TMEM16A 對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中AKT1 蛋白表達(dá)的影響

2.3 TMEM16A 對(duì)SKOV3 卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TMEM16A 過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)SKOV3 細(xì)胞的增殖能力，相對(duì)于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組的(100.00% ±0)，TMEM16A 過(guò)表達(dá)的增殖力為(139.20% ±7.36%)，TMEM16A 過(guò)表達(dá)＋Perifosine 的 增 殖 力 為(68.82% ± 7.80%)， 提 示TMEM16A 的促增殖作用可以被AKT1 抑制劑Perifosine 所逆轉(zhuǎn)，TMEM16A 通過(guò)AKT1 信號(hào)通路促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞增殖。 見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染TMEM16A 及應(yīng)用AKT1 抑制劑后對(duì)SKOV3 卵巢癌細(xì)胞增殖的影響(與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對(duì)照組比較，①P<0.01；與轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)TMEM16A 比較，②P <0.001)

2.4 TMEM16A 對(duì)SKOV3 卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響 在卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)TMEM16A 后侵襲能力增強(qiáng)，而在過(guò)表達(dá)TMEM16A 細(xì)胞中加入AKT1 抑制劑Perifosine 后其侵襲能力下降，提示TMEM16A 高表達(dá)促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞侵襲，AKT1 抑制劑可限制TMEM16A 高表達(dá)的侵襲能力。 見圖4。

3 討論

TMEM16A 又稱Anoctamin1，被證實(shí)為鈣激活氯通道，在包括頭頸癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、遷移等生物學(xué)行為[4-7]。 目前，TMEM16A 對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響方面的相關(guān)研究報(bào)道較少。深入研究TMEM16A 在腫瘤中的功能及作用機(jī)制具有一定的科研意義。

圖4 轉(zhuǎn)染TMEM16A 及應(yīng)用AKT1 抑制劑對(duì)SKOV3 卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響(200 倍)

TMEM16A 高表達(dá)對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增生、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的作用不同。 大量研究報(bào)道，TMEM16A 高表達(dá)促進(jìn)包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、頭頸癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞增生以及在體腫瘤生長(zhǎng)[8-13]。 然而，也有研究報(bào)道，TMEM16A高表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞及非腫瘤細(xì)胞(如肺內(nèi)皮細(xì)胞)的增生[6]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在TCGA 中，TMEM16A 高表達(dá)與低表達(dá)TMEM16A 的卵巢癌患者比較，高表達(dá)TMEM16A 患者的存活率顯著降低，提示TMEM16A 在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能成為卵巢癌治療的潛在靶向生物標(biāo)記物。因此，進(jìn)一步研究TMEM16A 鈣激活氯通道在卵巢癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用原因是深入了解其參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的前提。

腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移與其胞內(nèi)信號(hào)通路的活化密切相關(guān)，但TMEM16A 高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞開啟的信號(hào)通路種類目前尚不清楚。 2013 年，Britschgi 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，敲除TMEM16A 可通過(guò)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中AKT 磷酸化蛋白的表達(dá)抑制增殖。AKT 是細(xì)胞內(nèi)特異性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，AKT 的活化調(diào)控許多細(xì)胞的生理病理過(guò)程[15-17]。本研究進(jìn)一步通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中卵巢癌患者信息分析發(fā)現(xiàn)，AKT1 基因高表達(dá)組總存活率低于低表達(dá)組，TMEM16A/AKT1 聯(lián)合高表達(dá)組的總存活率明顯低于TMEM16A/AKT1 聯(lián)合低表達(dá)組。AKT 信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，例如腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及自噬等生物學(xué)行為[18-19]。 因此，探討TMEM16A的表達(dá)是否影響AKT1 蛋白水平對(duì)于卵巢癌預(yù)防、診斷和預(yù)后判斷具有臨床意義。

AKT 基因的異?；罨墒鼓[瘤細(xì)胞逃避凋亡，異常增殖分化，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤的發(fā)生[20-21]。 本研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)TMEM16A 的SKOV3 卵 巢 癌 細(xì) 胞 中， p-AKT1 顯 著 增 加， 轉(zhuǎn) 染TMEM16A 的SKOV3 卵巢癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，而應(yīng)用AKT1 抑制劑處理后能下調(diào)TMEM16A 高表達(dá)引起的增殖情況，說(shuō)明TMEM16A 對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控是通過(guò)對(duì)AKT1 基因的調(diào)節(jié)完成的。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)TMEM16A 的卵巢癌細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，加入AKT1 抑制劑后可影響TMEM16A 高表達(dá)的侵襲能力，提示靶向干預(yù)TMEM16A 表達(dá)可對(duì)卵巢癌的轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)TMEM16A 可以激活卵巢癌SKOV3 細(xì)胞中AKT1 蛋白。 TMEM16A 可能通過(guò)激活A(yù)KT1 促進(jìn)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞增殖和侵襲。 本研究為TMEM16A 靶向性的標(biāo)記、參與卵巢癌的治療及預(yù)后提供了新的理論依據(jù)。