清腸湯聯(lián)合美沙拉嗪治療熱盛血瘀型活動(dòng)期潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床效果及其作用機(jī)制

王曉瑜 繆志偉 張耀輝 張春雨 徐 艷

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院脾胃病科，江蘇張家港 215600

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是慢性、反復(fù)發(fā)作性的胃腸道炎癥性疾病，現(xiàn)已發(fā)展成為全球性疾病[1-2]。2015 年，全球的炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）患者達(dá)到500 萬(wàn)人，包含中國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家發(fā)病例數(shù)急劇上升，且增長(zhǎng)速度超過(guò)了西方國(guó)家[3-5]。據(jù)推測(cè)，到2025 年，僅在我國(guó)，將會(huì)有100 萬(wàn)例患者罹患UC[4]，屆時(shí)將會(huì)對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。

現(xiàn)階段，UC 的確切發(fā)病機(jī)制仍然不明，涉及多個(gè)細(xì)胞通路，Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）4/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）6/核因子（nuclear transcrip tion factor，NF）-κB 通路即是最為經(jīng)典的信號(hào)通路之一。UC 發(fā)病過(guò)程中，機(jī)體遇到致病因素侵襲時(shí)，先天性免疫應(yīng)答最先啟動(dòng)，腸黏膜細(xì)胞中的TLR4 過(guò)度表達(dá)，從而激活TRAF6，活化的TRAF6 合成K63 連接的泛素鏈介導(dǎo)了下游蛋白激酶復(fù)合體NF-κB 抑制蛋白激酶亞基α，從而引起IκBα 的磷酸化，并進(jìn)一步降解，釋放NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致機(jī)體中的多種致病因子如促炎因子、趨化因子及黏附因子的釋放，引起免疫系統(tǒng)的失衡與紊亂，從而引起炎癥損傷，誘發(fā)UC。由此可見(jiàn)，TRL4/TRAF6/NF-κB 這條信號(hào)通路在UC的發(fā)病過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，若能阻斷這條通路，可減弱UC 的炎癥反應(yīng)。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，中草藥能夠通過(guò)調(diào)控這一通路，達(dá)到改善UC 的治療作用[6-8]。

經(jīng)多年臨床實(shí)踐總結(jié)，活動(dòng)期UC 總離不開(kāi)“熱、瘀”兩大病理因素，從而總結(jié)出經(jīng)驗(yàn)方——清腸湯，其清熱祛濕、活血化瘀、涼血止血，能顯著提高UC 患者的治療有效率[9-10]。本研究通過(guò)采用清腸湯聯(lián)合美沙拉嗪治療熱盛血瘀型活動(dòng)期UC，觀察其臨床療效及對(duì)TRL4/TRAF6/NF-κB 的影響，評(píng)價(jià)清腸湯的治療效果，探討其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年10 至2019 年12 月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院就診（門(mén)診及住院）的熱盛血瘀型活動(dòng)期UC 患者60 例。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，對(duì)照組30 例，單用西藥治療；治療組30 例，在對(duì)照組的基礎(chǔ)上予清腸湯治療。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)（2018 年·北京）》[11]制定的UC 活動(dòng)期診斷標(biāo)準(zhǔn)，且為輕-中度患者（改良Mayo 評(píng)分為3～10 分）。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[12]及《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(jiàn)（2017）》[13]制定熱盛血瘀證UC 的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。主癥：①腹痛，腹瀉，膿血便，血色紫暗或黑；②里急后重；③腹痛灼熱；④舌質(zhì)暗紅，或有瘀斑瘀點(diǎn)，苔黃膩。次癥：①肛門(mén)灼熱；②溲赤；③脈弦滑或弦澀。符合主癥2 項(xiàng)及次證2 項(xiàng)即可診斷為熱盛血瘀證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合以上中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～65 歲；③簽署知情同意書(shū)；④經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，批準(zhǔn)文號(hào)為2017KY056。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①妊娠、哺乳期，或正準(zhǔn)備妊娠的婦女；②過(guò)敏體質(zhì)及對(duì)本研究藥物已知成分或其他成分過(guò)敏；③有原發(fā)性心、肝、肺、腎、血液或影響其生存的嚴(yán)重疾?。虎苣壳罢齾⒓悠渌R床試驗(yàn)。

1.5 研究方法

對(duì)照組：美沙拉嗪緩釋顆粒：1 g/次，4 次/d（上海愛(ài)德發(fā)制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：181005）。

治療組：在對(duì)照組方案的基礎(chǔ)上，服用清腸湯，方藥組成：白頭翁10 g、川黃柏10 g、生大黃6 g 后下、敗醬草15 g、仙鶴草15 g、地榆炭10 g、煨木香10 g、白及10 g、三七10 g、血竭沖服5 g、生甘草5 g。濃煎200 ml，口服，2 次/d。兩組療程均為3 個(gè)月。

1.6 觀察指標(biāo)

分別于治療前及治療后1 周各觀察記錄一次。（1）主要療效指標(biāo)：臨床療效。（2）次要療效指標(biāo)：①中醫(yī)證候積分；②Mayo 評(píng)分；③腸鏡黏膜愈合率；④相關(guān)理化指標(biāo)：腸鏡下黏膜組織的免疫熒光染色分析TLR4 表達(dá)量；免疫組織化學(xué)分析TRAF6、NF-κB 的表達(dá)量。

1.7 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

①參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(jiàn)（2017）》[13]：治療后1 周Mayo 總評(píng)分≤2 分，則判定為臨床緩解；治療后1 周Mayo 總評(píng)分下降≥30%或≥3 分，且便血評(píng)分下降≥1 分，則判定為臨床有效；治療后1 周Mayo 總評(píng)分無(wú)降低，則判定為臨床無(wú)效。②中醫(yī)證候療效標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[12]。見(jiàn)表2。③內(nèi)鏡下腸道黏膜愈合標(biāo)準(zhǔn)：參照《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(jiàn)（2017）》[13]，Mayo 內(nèi)鏡亞評(píng)分為0 分或1 分。內(nèi)鏡黏膜愈合率=黏膜愈合人數(shù)/總?cè)藬?shù)×100%。④免疫組化檢測(cè)結(jié)果的判定：結(jié)腸組織采用Roche 公司Ventena 全自動(dòng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)，兔單克隆抗體（抗TRAF6ab33915、抗NFκB p65 ab32536）均購(gòu)自Abcam 公司。使用Photoshop CS5 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞染色的積分光密度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以光密度（optical density，OD）值表示。⑤免疫熒光染色的測(cè)定：TLR4 抗體（ab22048）及熒光二抗山羊抗小鼠IgG H&L（ab150113）均購(gòu)自Abcam 公司。結(jié)腸組織石蠟切片脫蠟后在100℃檸檬酸鈉中加熱20 min，PBS 洗玻片，5 min 重復(fù)3 次，置于0.2% Triton 穿孔2 min，放入5%牛血清中封閉1 h，加入TLR4（1∶100），4℃過(guò)夜，PBS 洗玻片，5 min 重復(fù)3 次，黑暗中敷熒光二抗（1:500）50 min，PBS 洗5 min，漂洗3 次，加DAPI 封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。使用Photoshop CS5 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞染色進(jìn)行計(jì)算。

表2 癥狀積分標(biāo)準(zhǔn)

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布則以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較

治療組臨床療效優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組臨床療效比較（例）

2.2 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較

治療前，兩組中醫(yī)證候單項(xiàng)積分及總積分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組中醫(yī)證候單項(xiàng)積分及總積分均較治療前降低，且治療組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較（分，）

表4 兩組治療前后中醫(yī)證候積分比較（分，）

2.3 兩組治療前后Mayo 評(píng)分比較

治療前，兩組Mayo 評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組Mayo 評(píng)分均較治療前降低，且治療組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 兩組治療前后Mayo 評(píng)分比較（分，）

表5 兩組治療前后Mayo 評(píng)分比較（分，）

2.4 兩組內(nèi)鏡黏膜愈合率比較

治療組黏膜愈合率為86.67%（26 例），對(duì)照組為53.33%（16 例）。治療后治療組黏膜愈合率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.937，P＝0.005）。

2.5 兩組治療前后結(jié)腸黏膜TRAF6、NF-κB 表達(dá)情況比較

治療前，兩組TRAF6、NF-κB 表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組TRAF6、NF-κB 表達(dá)情況均較治療前降低，且治療組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表6。

表6 兩組治療前后結(jié)腸黏膜TRAF6、NF-κB 表達(dá)情況比較（OD，）

表6 兩組治療前后結(jié)腸黏膜TRAF6、NF-κB 表達(dá)情況比較（OD，）

注 TRAF：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子；NF-κB：核因子-κB

2.6 兩組治療前后免疫熒光TLR4 表達(dá)情況比較

治療前，兩組免疫熒光TLR4 表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組免疫熒光TLR4表達(dá)情況較治療前降低，且治療組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1～2。

圖1 兩組治療前后免疫熒光Toll 樣受體表達(dá)情況（n=30）

圖2 兩例患者治療前后TLR4 免疫熒光表達(dá)（免疫熒光，200×）

3 討論

目前UC 的患者已遍布全球各地，且發(fā)病率快速上升。在目前國(guó)內(nèi)醫(yī)療資源及社保基金如此緊缺的形勢(shì)下，UC 將愈發(fā)成為我國(guó)社會(huì)的一大醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

TLR4/TRAF6/NF-κB 通路是UC 致病過(guò)程中關(guān)鍵因素。外來(lái)致病因素對(duì)機(jī)體產(chǎn)生侵襲時(shí)，機(jī)體首先啟動(dòng)固有免疫，TLR4 的表達(dá)被激活，而獲得性免疫應(yīng)答可被活化的TLR4 啟動(dòng)，刺激TRAF6，憑借TRAF6依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF-κB。UC 患者腸黏膜受損，腸道中大量的致病菌群可直接接觸腸上皮細(xì)胞，同時(shí)TLR4 陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞在受損的腸黏膜聚集，從而觸發(fā)TLR4/TRAF6/NF-κB 信號(hào)通路，導(dǎo)致NF-κB 的磷酸化，引起免疫系統(tǒng)的失衡與紊亂而致病[14-15]。而這些細(xì)胞因子又可以反過(guò)來(lái)激活NF-κB，形成惡性循環(huán)，加劇UC 的炎癥損傷[16-18]。因此阻斷TLR4/TRAF6/NF-κB 這一信號(hào)通路，將減弱UC 的炎癥反應(yīng)，起到治療作用。

在歷代中醫(yī)人的不懈努力下，中醫(yī)藥治療UC 的臨床療效在國(guó)內(nèi)已得到廣泛認(rèn)可[19-20]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，UC 病位在大腸，與脾、肝、腎、肺諸臟功能失調(diào)有關(guān)[13,21-22]，其致病因素有濕熱、瘀毒、痰濁、氣滯、血瘀等，而活動(dòng)期總離不開(kāi)濕熱、瘀血。國(guó)醫(yī)大師徐景藩教授認(rèn)為，UC 發(fā)病關(guān)鍵為“脾虛濕熱夾瘀，寒熱錯(cuò)雜，肝、脾、腎同病”[23-24]。沈洪教授在此基礎(chǔ)上主張UC 活動(dòng)期為氣血瘀熱搏結(jié)，血敗肉腐，內(nèi)潰成瘍[25]。廣東省名中醫(yī)勞紹賢教授亦提出，活動(dòng)期UC 為血瘀化熱而成潰瘍[26]。張聲生教授也認(rèn)為UC 病變過(guò)程中始終貫穿寒熱錯(cuò)雜、氣血凝滯[27]?？梢?jiàn)，UC 活動(dòng)期以標(biāo)實(shí)為主，病理因素主要為濕熱、血瘀。本研究參考以上名醫(yī)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，提出從濕熱、血瘀論治，制定驗(yàn)方清腸湯，方以白頭翁湯化裁，共奏清熱化濕、活血化瘀、涼血止血之功。

本研究結(jié)果顯示，清腸湯能有效改善患者的相關(guān)臨床癥狀，降低Mayo 評(píng)分，抑制腸道的炎癥活動(dòng)，同時(shí)還能促進(jìn)結(jié)腸黏膜愈合，對(duì)改善患者的長(zhǎng)期預(yù)后有重要意義。清腸湯聯(lián)合美沙拉嗪能弱化TLR4 免疫熒光表達(dá)，降低TRAF6 和NF-κB 免疫組織化學(xué)的表達(dá)水平，且較單獨(dú)使用美沙拉嗪更為有效，說(shuō)明清腸湯能通過(guò)干預(yù)TLR4/TRAF6/NF-κB 信號(hào)通路，糾正UC患者的免疫系統(tǒng)失衡，促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)，這可能是其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制之一。