不同產(chǎn)地的當(dāng)歸中苯酞類成分的含量測定及聚類分析

龔 韜 楊 薇 王 夏 周德勇 拱健婷 李 莉 宋京美 胡銀燕

北京市臨床藥學(xué)研究所，北京 100035

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸的干燥根，性甘、辛、溫；歸肝、心、脾經(jīng)。具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便之功效[1]。主要分布在甘肅、云南、四川等地?，F(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸中的化合物主要包括揮發(fā)油、有機酸、多糖和黃酮等成分，其中揮發(fā)油為當(dāng)歸的有效成分之一，具有改善學(xué)習(xí)記憶能力、抗氧化損傷等多重藥理作用，按化學(xué)結(jié)構(gòu)其主要成分可分為苯酞類和苯酞二聚體類化合物，其中藁本內(nèi)酯的含量最高[2-9]。2020 年版《中華人民共和國藥典》[1]中當(dāng)歸含量測定項下僅收載了揮發(fā)油總量和阿魏酸含量，但對揮發(fā)油中的具體成分并未規(guī)定其含量測定項?；诖?，為更系統(tǒng)、更全面地進(jìn)行當(dāng)歸的質(zhì)量評價，本研究建立了多波長高效液相色譜法（high performance liquid chromatograph，HPLC）測定當(dāng)歸中洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞4 種苯酞類成分的含量，并對不同產(chǎn)地當(dāng)歸的頭和身兩個部位的洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞3 種成分進(jìn)行聚類分析，以期為當(dāng)歸的質(zhì)量評價、標(biāo)準(zhǔn)完善以及合理的開發(fā)利用提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo UltiMate3000 型超高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Mettler Toledo XP105 型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.2 材料

對照品：洋川芎內(nèi)酯I（貨號：P10OBF45372）、洋川芎內(nèi)酯A（貨號：P03N8F47409）、丁烯基苯酞（貨號：T04N8Z47410）均購自上海源葉生物科技有限公司；藁本內(nèi)酯（貨號：C10106732）購自上海麥克林生化科技有限公司。乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。不同產(chǎn)地當(dāng)歸樣品來源信息見表1，經(jīng)北京市臨床藥學(xué)研究所中藥資源室李莉研究員鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Diels 的干燥根。

表1 不同產(chǎn)地當(dāng)歸樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取4 種對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml 含洋川芎內(nèi)酯I 2.34 μg、洋川芎內(nèi)酯A 4.46 μg、藁本內(nèi)酯166.4 μg、丁烯基苯酞2.08 μg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取當(dāng)歸粉末（B-2-頭）（過三號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（Agilent Eclipse Plus C18，4.6 mm×150 mm，3.5 μm）為色譜柱；流動相為乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～20 min，92%→74%B；20～25 min，74%→60%B；25～60 min，60%B）；柱溫35℃；檢測波長：洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A 為284 nm，藁本內(nèi)酯為326 nm，丁烯基苯酞為260 nm；流速1 ml/min。此條件下4 種成分與其他組分均能達(dá)到基線分離，色譜圖見圖1。

圖1 當(dāng)歸4 種苯酞類成分高效液相色譜圖譜

2.4 線性關(guān)系考察

取洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成一系列混合對照品溶液，濃度分別為5.85×10-4～2.34×10-2、1.12×10-3～4.46×10-2、4.16×10-2～1.664、5.20×10-4～2.08×10-2mg/ml。按“2.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣10 μl，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。見表2。

表2 4 種苯酞類成分的線性關(guān)系

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 穩(wěn)定性考察 精密吸取“2.2”項下同一份供試品溶液10 μl，于0、4、8、12、16、20、24 h 按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計算得洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞4 種成分峰面積的RSD 值分別為4.07%、1.92%、0.68%、4.23%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5.2 重復(fù)性考察 精密稱取同一批次當(dāng)歸樣品（B-2-頭）6 份，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，按“2.3”項下色譜條件測定，計算得到洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞4 種成分含量分別為0.0346%、0.0181%、1.0410%、0.0203%，RSD 分別為2.86%、3.24%、1.10%、1.59%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 準(zhǔn)確度（回收率）考察 采用加樣回收法。精密稱取已知含量的同一批當(dāng)歸樣品（B-2-頭）0.15 g，共9 份，精密加入已知含量的對照品溶液25 ml，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，按“2.3”項下色譜條件測定，計算含量及加樣回收率。見表3。

表3 當(dāng)歸四種苯酞類成分加樣回收試驗結(jié)果

2.6 不同產(chǎn)地當(dāng)歸樣品測定

不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品充分干燥后，按當(dāng)歸頭、當(dāng)歸身不同部位進(jìn)行取樣，粉碎，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下色譜條件測定，得到洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞4 種成分含量。

2.7 數(shù)據(jù)處理結(jié)果

采用Graphpad Prism 8.0 軟件對10 個產(chǎn)地的89 批樣品做雨點分布圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品中4 種苯酞類成分含量相差較大，部分產(chǎn)地樣品中無洋川芎內(nèi)酯A；洋川芎內(nèi)酯I 和丁烯基苯酞的含量數(shù)據(jù)比藁本內(nèi)酯要分散，同一產(chǎn)地的不同批次間數(shù)據(jù)波動較大。

圖2 不同產(chǎn)地當(dāng)歸中苯酞類成分雨點圖

2.8 聚類分析

以所測洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞3 種成分的含量作為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 26.0 軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)，以Ward 接法結(jié)合Squared Euclidean Distance 距離計算方法對10 個產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品按不同部位進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。對于當(dāng)歸頭，當(dāng)判定距離＜25 時，樣品可聚為2 類，產(chǎn)地編碼H、I、J 為一類，其余產(chǎn)地為一類；當(dāng)判定距離<5 時，樣品則可聚為4 類，分別是產(chǎn)地編碼B、G、K 為一類，A、C、D 為一類，E 單獨為一類；H、I、J 為一類。對于當(dāng)歸身，當(dāng)判定距離＜25 時，樣品可聚為2 類，產(chǎn)地編碼G、H、I、J為一類，其余產(chǎn)地的為一類；當(dāng)判定距離<5 時，樣品則聚為3 類，分別是產(chǎn)地編碼G、H、I、J 為一類，A、B、C、E 為一類，D、K 為一類。

圖3 不同產(chǎn)地當(dāng)歸的聚類分析

3 討論

3.1 流動相的選擇

參考了已有的關(guān)于當(dāng)歸有效成分的含量測定及指紋圖譜、特征圖譜的報道[10-20]，考察對比了不同色譜系統(tǒng)對樣品分離的影響，最終選用乙腈-水系統(tǒng)作為色譜系統(tǒng)，并采用梯度洗脫。

3.2 檢測波長的選擇

由于樣品中4 種成分的含量相差懸殊，藁苯內(nèi)酯的含量是另3 種成分的10～100 倍，因此采用了各個成分的最佳檢測波長，以期收到較好的檢出結(jié)果。

3.3 供試品溶液制備條件的優(yōu)化

由于苯酞類成分穩(wěn)定性差，故選取超聲處理作為提取方式，以甲醇作為提取溶媒。根據(jù)提取溶媒體積和提取時間的考察結(jié)果，確定樣品的提取方式為甲醇超聲處理30 min，溶媒體積為25 ml。

3.4 小結(jié)

本研究建立了當(dāng)歸中4 種苯酞類成分的含量測定方法，該方法操作簡單，專屬性強，準(zhǔn)確性高。不同產(chǎn)地當(dāng)歸中苯酞類成分的含量差異顯著，可為有關(guān)當(dāng)歸藥材開發(fā)產(chǎn)地選擇提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。聚類分析根據(jù)不同閾值范圍可把10 個產(chǎn)地89 批當(dāng)歸樣品分為2 大類或3～4 小類，總體來看，云南曲靖1、云南怒江2 和云南白藥基地1 三個產(chǎn)地的可歸屬為一類，提示以藁本內(nèi)酯等苯酞類化學(xué)成分為指標(biāo)的當(dāng)歸藥材在地理環(huán)境方面的差異是客觀存在的。本研究由于采集的各個產(chǎn)地的當(dāng)歸樣品數(shù)量一致性欠佳，樣本數(shù)不齊，可能會造成數(shù)據(jù)統(tǒng)計上的偏差。當(dāng)歸在臨床上應(yīng)用非常廣泛，因此有必要進(jìn)一步擴大樣本量以掌握各個產(chǎn)地當(dāng)歸藥材的總體情況，更全面、系統(tǒng)地進(jìn)行質(zhì)量評價[21-25]。