雷帕霉素對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠的影響

譚麗萍 陳文慧 石安華 武俊紫 朱曉松 張 珊

1.云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)徐宏喜專家工作站，云南昆明 650500；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)云南省高校中醫(yī)證候微觀辨證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率逐年上升，已成為21 世紀(jì)全球排名第一的慢性肝病，現(xiàn)全球患病率約25%，嚴(yán)重影響人類健康[1-2]。細(xì)胞自噬參與NAFLD 發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善肝細(xì)胞損傷和胰島素抵抗、減少氧化應(yīng)激等環(huán)節(jié)有效治療NAFLD[3-4]，自噬調(diào)節(jié)已成為治療NAFLD 的潛在靶點(diǎn)[5]。雷帕霉素可抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白而激活自噬，為自噬研究中最常用的藥物[6]。雷帕霉素在動(dòng)脈粥樣硬化及機(jī)械通氣導(dǎo)致膈肌脂質(zhì)代謝異常中均有緩解局部病變的作用[7-8]，由此本研究希望通過(guò)雷帕霉素治療高糖高脂建立的NAFLD 大鼠模型，探討其治療NAFLD 的效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD 大鼠24 只，體重180～220 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，動(dòng)物合格證號(hào)：430047000 57203。本研究經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（R-06201926）。

1.2 主要儀器與試劑

CM 1860UV 冷凍切片機(jī)、RM235 石蠟切片機(jī)（德國(guó)LEICA 公司），Cobas C311 全自動(dòng)生化儀（瑞士羅氏公司），DNM-9602 全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠產(chǎn)品）。雷帕霉素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司（批號(hào)：R0395）。自噬相關(guān)蛋白Beclin1 抗體（批號(hào)：ab207612）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3B（light chain 3B，LC3B）抗體（批號(hào)：ab48394）購(gòu)自英國(guó)abcam 公司，泛素結(jié)合蛋白p62 抗體（批號(hào)：A11250）、自噬相關(guān)蛋白ATG5 抗體（批號(hào)：A0203）購(gòu)自ABclonal 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立、分組、給藥

隨機(jī)選取8 只大鼠作為正常組，普通飼料喂養(yǎng)。剩余16 只采用高糖高脂飼料（59.5%常規(guī)飼料、10.0%豬油、20.0%蔗糖、0.5%膽酸鈉、10.0%蛋黃粉）伴日常飲用5.0%紅糖水的飼養(yǎng)方法建立NAFLD 大鼠模型，持續(xù)造模6 周后，肝組織低倍鏡下可見脂肪變性肝細(xì)胞占肝小葉比例＞1/3，即出現(xiàn)NAFLD[9-10]，明確造模成功。將其按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和雷帕霉素組，每組各8 只。雷帕霉素組用2.8 mg/（kg·d）雷帕霉素灌胃[11]，正常組與模型組用0.9%NaCl 溶液灌胃，灌胃液體容積為每只大鼠2 ml/d，持續(xù)給藥4 周。

1.4 生化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠麻醉后心臟取血，用羅氏全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)三組血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。三組處死并解剖，取部分肝組織，制作肝勻漿，采用TC、TG 試劑盒以GPO-PAP 法檢測(cè)TC、TG。

1.5 肝臟病理檢測(cè)

另取部分肝組織于4%中性甲醛固定后，通過(guò)石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，通過(guò)冰凍切片進(jìn)行油紅O染色。

1.6 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色

三組肝組織石蠟切片后脫蠟至水，通過(guò)抗原修復(fù)、封閉、加一抗、加二抗、顯色等步驟，泛素結(jié)合蛋白p62 抗體稀釋比為1∶300，ATG5 抗體稀釋比為1∶50，待測(cè)蛋白與抗體結(jié)合顯色呈現(xiàn)棕黃色，統(tǒng)計(jì)分析光密度。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

取三組大鼠肝組織裂解勻漿，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白含量，待測(cè)蛋白通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜，最后進(jìn)行免疫反應(yīng)顯影。Beclin1 抗體稀釋比為1∶20 000，LC3B 抗體稀釋比為1∶500、β-actin 抗體稀釋比為1∶1000。用灰度比值進(jìn)行蛋白表達(dá)水平分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組生化指標(biāo)比較

模型組血清TC、TG、LDL-C、GOT、GPT 及肝組織TC、TG 高于正常組，血清HDL-C 低于正常組（P＜0.05或P＜0.01）。雷帕霉素組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C均高于模型組，血清GOT、GPT 及肝組織TC、TG 均低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

表1 三組生化指標(biāo)比較（mmol/L，）

表1 三組生化指標(biāo)比較（mmol/L，）

注 與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01。TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；GOT：谷草轉(zhuǎn)氨酶；GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶

2.2 三組肝組織病理變化

正常組肝細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常，模型組肝組織蘇木精-伊紅染色可見大多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)有大小不等的脂肪空泡，油紅O 染色可見大多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)含有脂質(zhì)被染成橘紅色。雷帕霉素組肝組織蘇木精-伊紅染色及油紅O 染色可見脂肪空泡和橘紅色較少。見圖1。

圖1 三組肝組織病理變化（200×）

2.3 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白、微管相關(guān)蛋白、泛素結(jié)合蛋白比較

模型組Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、ATG5 低于正常組，泛素結(jié)合蛋白p62 高于正常組（P＜0.05）。雷帕霉素組Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、ATG5 高于模型組，泛素結(jié)合蛋白p62 低于模型組（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2、圖2～3。

表2 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白、微管相關(guān)蛋白、泛素結(jié)合蛋白比較（）

表2 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白、微管相關(guān)蛋白、泛素結(jié)合蛋白比較（）

注 與正常組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01。LC3B：輕鏈3B

圖2 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1 及微管相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ條帶

3 討論

圖3 三組肝組織自噬相關(guān)蛋白ATG5 及泛素結(jié)合蛋白p62免疫組織化學(xué)染色（200×）

自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要生命活動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)異常物質(zhì)如衰老細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊蛋白、脂質(zhì)蓄積等增多時(shí)，自噬可通過(guò)吞噬、消化動(dòng)作，清除細(xì)胞內(nèi)冗余物質(zhì)[12]。在NAFLD 早期單純性脂肪肝階段，由于肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度蓄積，導(dǎo)致肝細(xì)胞自噬水平降低，所以增強(qiáng)肝細(xì)胞自噬，促進(jìn)脂質(zhì)的降解與利用是NAFLD的重要治療靶點(diǎn)[13-15]。自噬是動(dòng)態(tài)連續(xù)的過(guò)程[16]，通過(guò)對(duì)期過(guò)程中關(guān)鍵蛋白Beclin1（介導(dǎo)自噬起始，促進(jìn)自噬體成核及延伸）[17]、ATG5（促進(jìn)自噬泡膜延伸）[18]、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ（促進(jìn)LC3B-Ⅰ轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3B-Ⅱ）[19]、p62（可在自噬溶酶體內(nèi)降解）[20]的觀察，能有效掌握自噬狀態(tài)[21-23]。

雷帕霉素為自噬激動(dòng)劑，其可抑制mTORC1 活性，促使ULK1 激活，啟動(dòng)自噬[24]。本研究用雷帕霉素治療NAFLD 大鼠后，發(fā)現(xiàn)其會(huì)導(dǎo)致NAFLD 大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C 異常增高，但在肝組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少。有研究表明，一些使用雷帕霉素進(jìn)行研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都出現(xiàn)了其對(duì)機(jī)體脂代謝影響的雙面性[25-27]，綜合來(lái)看，使用雷帕霉素后可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全身反應(yīng)及血脂異常增高，對(duì)局部脂代謝異常臟器則有改善作用，機(jī)制可能與下調(diào)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體的表達(dá)、減少脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚、并抑制其瘦素分泌有關(guān)[26]。本研究中，雷帕霉素通過(guò)增強(qiáng)肝細(xì)胞自噬水平來(lái)治療NAFLD 大鼠效果顯著，但如何選擇更合適的雷帕霉素劑量及用藥時(shí)間，以達(dá)到較好的治療效果并降低其副作用是進(jìn)一步研究的重要方向。