果蔬中氟吡菌酰胺殘留檢測方法研究進展

楊藝玥 楊 明 鄭鷺飛

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室， 北京 100081）

氟吡菌酰胺是琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，通過作用于真菌線粒體呼吸鏈內(nèi)的琥珀酸脫氫酶（復合物 II）而阻止真菌生長[1]。 2012 年， 氟吡菌酰胺在我國已獲得登記， 目前登記作物包括15 種水果、8 種蔬菜、 2 種藥用作物和 1 種經(jīng)濟作物[2]， 具有很大的應用潛力。 氟吡菌酰胺具有高效、 廣譜、 持效性強和選擇性強等特點。 同時， 氟吡菌酰胺還具有優(yōu)異的內(nèi)吸傳導性， 通過葉或根吸收后在植物體內(nèi)傳導達到抑菌效果， 并產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物， 鑒于這種特殊的作用機制， 氟吡菌酰胺易殘留于果蔬的可食用部分[3]。 因此， 開展果蔬中氟吡菌酰胺殘留的檢測方法研究， 對科學監(jiān)測和評估氟吡菌酰胺的殘留風險具有重要的意義。 目前， 氟吡菌酰胺的檢測方法主要有氣相色譜法[4～7]、 氣相色譜－質(zhì)譜法[8～13]和液相色譜－質(zhì)譜法[3，14～22]等。 但是 GB 2763－2021 《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[23]中缺少氟吡菌酰胺殘留檢測的標準方法。 本文綜述了果蔬中氟吡菌酰胺殘留檢測方法的研究現(xiàn)狀， 系統(tǒng)比較了各種方法的優(yōu)缺點， 旨在為今后果蔬中氟吡菌酰胺的檢測標準方法開發(fā)提供參考。

一、 氟吡菌酰胺毒性和理化性質(zhì)

氟吡菌酰胺是一種穩(wěn)定且非揮發(fā)性的農(nóng)藥[24]，其外觀為白色粉末， 無明顯氣味， 熔點117.5℃，沸點318～321℃。 氟吡菌酰胺水溶性較低， 20℃時， 其在水中的溶解度為15～16 mg/L， 蒸氣壓為1.2×10－6Pa， 其在甲醇、 丙酮、 二氯甲烷、 乙酸乙酯和二甲基亞砜中的溶解度大于250 g/L， 土壤有機質(zhì)－水分配系數(shù) （KOC） 值為 266～460[25]， 土壤對其的吸附能力強[3]， 正辛醇/ 水分配系數(shù) （Kow）值為 3.3 （pH 6.5）。

根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留專家聯(lián)席會議（JMPR） 氟吡菌酰胺毒理學評估報告， 氟吡菌酰胺具有急性毒性， 大鼠經(jīng)口半數(shù)致死量 （LD50）＞2 000 mg/kg bw， 大鼠經(jīng)皮 LD50＞2 000 mg/kg bw， 大鼠鼻吸入半數(shù)致死濃度 （LC50）＞5.11 mg/L air （暴露 4 h）， 對皮膚和眼睛無刺激性， 能造成小鼠甲狀腺瘤和大鼠肝腫瘤； 每日允許攝入量 （ADI） 為 0～0.1 mg/kg bw， 急性參考劑量（ARfD） 為 0.5 mg/kg bw[21～22]。

二、 氟吡菌酰胺的登記情況與殘留現(xiàn)狀

根據(jù)中國農(nóng)業(yè)信息網(wǎng)， 截至 2022 年5 月 23日， 氟吡菌酰胺已登記用于26 種作物， 包括水果15 種 （草莓、 柑橘、 桃、 梨、 荔枝、 芒果、 蘋果、葡萄、 甜瓜、 西瓜、 香蕉、 楊梅、 櫻桃、 獼猴桃、枇杷）， 蔬菜 8 種 （番茄、 黃瓜、 苦瓜、 辣椒、 馬鈴薯、 茄子、 洋蔥、 豇豆）， 藥用作物 2 種 （人參、三七）， 經(jīng)濟作物1 種 （煙草）。 氟吡菌酰胺可以防治黃瓜、 番茄、 辣椒等蔬菜易感染的灰霉病、 白粉病、 霜霉病[6，13，26～29]等， 還可防治多種線蟲[30～31]， 用作農(nóng)產(chǎn)品保鮮劑、 種子處理劑[32]。 在氟吡菌酰胺可防治的病蟲害中， 如胡蘿卜、 山藥等小宗作物容易遭受白粉病、 根結(jié)線蟲病的侵害， 但氟吡菌酰胺尚未在這些作物上進行登記使用。

根據(jù)文獻報道， 目前氟吡菌酰胺在不同作物中進行的農(nóng)藥殘留田間試驗， 其最終殘留量均小于最大殘留限量 （見表1）。 聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織于2010年開展食品中農(nóng)藥殘留評估[24]時使用同位素示蹤技術(shù)在植物中共鑒定出氟吡菌酰胺的17 種代謝物，并指明在田間良好農(nóng)業(yè)規(guī)范試驗中， 氟吡菌酰胺殘留主要以母體 （見圖1 A） 及其代謝物2－（三氟甲基）苯甲酰胺（見圖1 B）的形式分布于作物與土壤中。 歐洲食品安全局[36]根據(jù)代謝研究結(jié)果， 將氟吡菌酰胺風險評估定義確定為 “氟吡菌酰胺與2－（三氟甲基） 苯甲酰胺之和， 以氟吡菌酰胺表示”。 目前， 我國GB 2763－2021 標準對作物中氟吡菌酰胺殘留物的定義規(guī)定為 “氟吡菌酰胺母體”， 但為滿足風險評估的要求并與國際標準接軌， 果蔬中氟吡菌酰胺殘留檢測對象應包括其代謝物2－（三氟甲基） 苯甲酰胺。 因此， 要加快氟吡菌酰胺及其代謝物標準檢測方法的制定， 從而推動氟吡菌酰胺在多種果蔬上的登記和其最高殘留限量的制定， 以滿足實際生產(chǎn)和安全用藥需求。

表1 氟吡菌酰胺田間試驗最終殘留量情況

圖1 氟吡菌酰胺 （A） 及其代謝物2- （三氟甲基）苯甲酰胺 （B） 結(jié)構(gòu)式

三、 氟吡菌酰胺殘留檢測方法研究進展

（一） 氣相色譜法氣相色譜法靈敏度高、 應用范圍廣、 檢測限低， 能夠用于檢測熱穩(wěn)定性強、易氣化、 不易分解的物質(zhì)。 氟吡菌酰胺易氣化， 在高溫下不易分解[37]， 因而無須衍生化即可通過氣相色譜進行分析。

近年來利用氣相色譜分析不同果蔬中氟吡菌酰胺殘留的檢測方法匯總見表2， 其中胡琴等[38]使用氣相色譜－氫火焰離子化檢測器 （GC－FID）， 以鄰苯二甲酸二環(huán)己酯為內(nèi)標物， 首次對氟吡菌酰胺進行定性定量分析， 方法平均回收率為99.75%，但該方法未在實際樣品上應用。 于福利等[4]、 鄧曼等[5]和GUAN 等[7]應用氣相色譜－電子捕獲檢測器（GC－ECD）， 對蔬菜和環(huán)境樣品 （黃瓜、 番茄和土壤） 以及 6 種水果樣品 （西瓜、 葡萄、 草莓、 柑橘、 蘋果和梨） 中的氟吡菌酰胺殘留進行了測定。MAGDALENA 等[6]使用配備氮磷檢測器 （NPD）和微電子捕獲檢測器 （μECD） 的氣相色譜儀， 結(jié)合丙酮提取、 二氯甲烷萃取的前處理方法， 檢測蘋果果實和葉片中的氟吡菌酰胺殘留， 方法平均添加回收率在70%～120%的范圍內(nèi)。

表2 氣相色譜檢測果蔬中氟吡菌酰胺殘留的方法匯總

采用氣相色譜法能夠較好地分離氟吡菌酰胺，且該方法操作簡單， 成本較低， 定量能力強， 但其定性及結(jié)構(gòu)分析能力弱， 需與其他檢測器結(jié)合使用。

（二） 色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[39]結(jié)合了色譜的分離能力與質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)分析能力， 能夠?qū)碗s基質(zhì)中的氟吡菌酰胺及其代謝物進行準確定性、 定量及結(jié)構(gòu)分析， 具有高效分離、 高靈敏度的特點， 目前廣泛應用于植物源食品中氟吡菌酰胺殘留分析。

1. 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）法。 與氣相色譜法相比較， 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法能夠采用保留時間以及特征離子進行雙重定性， 在定量步驟中沒有干擾， 具有分辨率高、 靈敏度高且重現(xiàn)性好的特點， 可以彌補氣相色譜法分析氟吡菌酰胺過程中存在的檢測靈敏度相對較低等不足[8]， 被逐漸應用于不同果蔬中氟吡菌酰胺殘留分析研究。

DONG 和 HU[9]使用 GC－MS 結(jié)合 QuEChERS前處理方法， 首次同時分析了西瓜和土壤中氟吡菌酰胺的殘留情況， 檢出限分別為 0.002 mg/kg 和0.003 mg/kg， 定量限為 0.01 mg/kg。 李文卓等[8]則首次使用氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜 （GC－MS/MS） 結(jié)合QuEChERS 前處理方法， 建立了一種同時檢測7 種蔬菜樣品 （洋蔥、 青花菜、 萵苣、 番茄、 黃瓜、 扁豆和馬鈴薯） 中氟吡菌酰胺殘留的分析方法。 此外， NAGAPOOJA 等[10]、 PENG 等[11]、 孫雪梅 等[40]、 SAPNA 等[12]和 ZHOU 等[13]都 使 用 GCMS/MS 結(jié)合QuEChERS 前處理方法分別建立了石榴、 番茄、 黃瓜、 辣椒、 白菜、 豇豆、 西葫蘆、 豆莢、 香蕉和土壤中氟吡菌酰胺殘留的分析方法。PENG 等[11]通過 GC－MS/MS 全掃描模式研究了大棚作物番茄、 黃瓜、 辣椒中氟吡菌酰胺的殘留情況， 同時根據(jù)特征碎片和數(shù)據(jù)庫檢索鑒定出3 種氟吡菌酰胺代謝物 （見圖2）， 推測氟吡菌酰胺在這些果蔬內(nèi)首先裂解為TMB［2－（三氟甲基）苯甲酰胺］和 TPE ［2－（3－chloro－5－（trifluoromethyl）pyridin－2－yl）ethanol］， TPE 隨后經(jīng)系列反應形成TPA ［3－chloro－5－（trifluoromethyl）picolinic acid］和 TPAA ［3－chloro－5－（trifluoromethyl）pyridine－2－acetic acid］， 其中 TMB 是初級代謝產(chǎn)物， TPA和TPAA 是次級代謝產(chǎn)物。

圖2 氟吡菌酰胺在果蔬生態(tài)系統(tǒng)中的可能代謝途徑

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀的各種型號儀器之間數(shù)據(jù)庫通用， 且氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀分離效率高，靈敏度高， 適用于定性定量分析， 但對用于分析的樣品狀態(tài)要求高， 前處理步驟復雜。

2. 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用 （LC－MS） 法。 應用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測果蔬中氟吡菌酰胺殘留的研究要晚于氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法， 采用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測果蔬中氟吡菌酰胺殘留的色譜和質(zhì)譜條件見表3。

表3 采用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法檢測果蔬中氟吡菌酰胺殘留的儀器條件參數(shù)

2016 年， PATEL 等[18]建立了一種 UPLC－MS/MS檢測洋蔥和土壤中氟吡菌酰胺殘留的分析方法， 該方法檢出限為0.017 mg/kg， 定量限為0.05 mg/kg。SAHA 等[19]利用 HPLC－MS/MS 建立了辣椒中氟吡菌酰胺殘留的分析方法， 結(jié)果表明， 在0.01～0.25 mg/kg 添加水平下氟吡菌酰胺的平均回收率為83.5%～91.4%， 相對標準偏差低于6.5%， 檢出限為0.003 mg/kg， 定量限為 0.01 mg/kg。 SUCHI 等[3]依托UPLC－MS/MS 對黃瓜中的氟吡菌酰胺進行殘留持久性評估， 方法回收率和精確度良好。 MAHDAVI等[16]使用UPLC－MS/MS 分析了開心果、 椰棗和土壤中氟吡菌酰胺的殘留量， 方法的回收率為80.6%～93.5%， 相對標準偏差低于10.8%。 除使用 UPLC－MS/MS 和 HPLC－MS/MS 外， 學者們利用LC－MS/MS 也開發(fā)了可靠的分析方法， 例如MATADHA 等[20]使用 LC－MS/MS 探究了氟吡菌酰胺在番茄和甜椒中的吸收和分布情況， 開發(fā)的方法的檢出限和定量限分別為0.001 5 mg/kg 和0.005 mg/kg。 近兩年， 我國科研人員范金平等[17]、 陳麗

霞等[14]、 賈春虹等[15]和FENG 等[21]依托 UPLC－MS/MS 或 LC－MS/MS 先后建立了芒果、 黃瓜、 番茄、茄子、 草莓和甜瓜中氟吡菌酰胺殘留的分析方法。

此外， VARGAS-PéREZ 等[37]采用超高效液相色譜（UPLC）與高分辨質(zhì)譜（HRMS）聯(lián)用技術(shù)， 對番茄和黃瓜中的氟吡菌酰胺及其代謝物2－（三氟甲基） 苯甲酰胺進行了檢測， 具體質(zhì)譜監(jiān)測參數(shù)見表4。LI 等[41]使用UPLC－HRMS 分析了氟吡菌酰胺在蘋果中的殘留情況， 并且推測氟吡菌酰胺在蘋果酶促水解過程中可能發(fā)生裂解、 脫氯、 羥基取代和氧化轉(zhuǎn)化等系列反應， 進而生成 P1、 P2、 P3 3 種代謝產(chǎn)物（見圖 3）。 LAMFALUSY 和 SOROS[42]使用 LCMS/MS 分析了櫻桃中氟吡菌酰胺的殘留情況并鑒定出兩種氟吡菌酰胺代謝物， 即單羥基－氟吡菌酰胺（M08 或 M18）和去氯－氟吡菌酰胺（見圖 4）。

表4 氟吡菌酰胺及其代謝物MRM 多反應監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

圖3 氟吡菌酰胺在多聚半乳糖醛酸酶解中的可能轉(zhuǎn)化途徑

圖4 氟吡菌酰胺在櫻桃中的殘留代謝物

液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高， 可準確定量及定性分析氟吡菌酰胺及其多種代謝物， 是歐洲食品安全局和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織測定氟吡菌酰胺及其代謝物的推薦分析方法。

四、 結(jié)論與展望

綜上所述， 目前氟吡菌酰胺殘留檢測技術(shù)中，最為成熟與可靠的是氣相色譜技術(shù)與色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)， 這兩種技術(shù)在氟吡菌酰胺定量檢測和氟吡菌酰胺代謝物結(jié)構(gòu)分析方面具有不可取代的地位，已經(jīng)成功用于多種果蔬中氟吡菌酰胺及其代謝物的殘留分析。

但是儀器方法存在耗時長、 成本高、 需要專業(yè)人員進行操作的問題。 近年來， 果蔬中農(nóng)藥殘留快速檢測方法發(fā)展迅速， 西班牙研究團隊的CEBALLOS-ALCANTARILLA 等[43]首次制備了氟吡菌酰胺的特異性、 高親和力單克隆抗體， 從而實現(xiàn)了運用酶聯(lián)免疫吸附 （ELISA） 法檢測氟吡菌酰胺殘留，該方法成功應用于李子、 葡萄、 葡萄汁、 葡萄酒4種實際樣品中氟吡菌酰胺的殘留分析。 但目前我國關(guān)于快速檢測技術(shù)應用于果蔬中氟吡菌酰胺殘留分析的研究鮮有報道， 因此開發(fā)建立準確、 靈敏、 簡單和快捷的果蔬中氟吡菌酰胺檢測標準方法是亟待解決的問題。 氟吡菌酰胺施用于不同農(nóng)作物后， 其代謝產(chǎn)物和代謝途徑存在差異， 但內(nèi)在的機制尚不明確。 因此， 開發(fā)果蔬中的氟吡菌酰胺代謝產(chǎn)物的鑒定與檢測方法， 也是今后的重點工作之一。