基于高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法SWATH采集模式快速篩查草莓中農(nóng)藥殘留的方法研究

李 芳 李獻(xiàn)剛 李雪梅 沈致淳 王 穎 劉 棟

（東港海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心， 國家級(jí)農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧東港 118300）

為了達(dá)到提高農(nóng)作物產(chǎn)量的目的， 目前有超過1 100 種農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中， 這些農(nóng)藥的殘留物通過食物鏈的富集作用， 會(huì)在動(dòng)物和人類機(jī)體內(nèi)積累并導(dǎo)致急性或慢性中毒， 給食品安全帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1～2]。 為此， 許多國家和國際組織制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥最大殘留限量。 我國于2021 年頒布了GB 2763－2021 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》， 該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中涉及農(nóng)藥548 種， 相較 GB 2763－2019 增加了 81 種， 其中有 176 種農(nóng)藥被規(guī)定了在草莓中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)， 可見草莓中的農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)受到各方面關(guān)注。

常規(guī)農(nóng)藥殘留分析仍較為廣泛地采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS/MS）技術(shù)[3～5]， 但是由于其掃描速度和駐留時(shí)間的限制， 對(duì)于幾百種農(nóng)藥的多殘留檢測往往需要分組建立多個(gè)檢測方法， 并且分辨率較低， 在分析復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)也容易出現(xiàn)假陽性的情況， 造成結(jié)果誤判[6]。 針對(duì)蔬菜基質(zhì)的農(nóng)藥殘留檢測， 我國已經(jīng)逐步建立起國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法， 但這些標(biāo)準(zhǔn)方法檢測農(nóng)藥范圍有限， 很多標(biāo)準(zhǔn)只是針對(duì)某一種或一類農(nóng)藥的檢測， 無法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同種類農(nóng)藥的全覆蓋、 高通量檢測。 因此， 針對(duì)現(xiàn)有檢測技術(shù)僅能夠?qū)κ孪却_定的目標(biāo)物進(jìn)行檢測，無法達(dá)到“全面搜尋、 提前監(jiān)控”目的的情況， 急需開發(fā)一種全覆蓋、 高通量的檢測技術(shù)予以解決[7～9]。

基于以上國內(nèi)現(xiàn)狀， 本研究采用農(nóng)藥提取凈化的基礎(chǔ)方法QuEChERS 結(jié)合高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的非靶向篩查方法， 發(fā)揮二者高效、 便捷、 靈敏、 準(zhǔn)確的特點(diǎn)， 完成草莓中多種農(nóng)藥殘留的篩查[10～13]。 本研究利用二級(jí)子離子與譜庫比對(duì)進(jìn)行定性分析， 利用一級(jí)母離子進(jìn)行定量分析， 研究建立高通量、 快速、 準(zhǔn)確測定草莓中多種農(nóng)藥殘留的方法， 旨在為草莓中農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供方法支撐。

一、 材料與方法

（一） 主要儀器與試劑QTOF 5600 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 （美國 AB SCIEX 公司）； 1200 高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）； 超純水機(jī) （mini plus UV， 德國賽多利斯集團(tuán)）； 離心機(jī) （TGL－16M，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； 乙腈 （色譜純，美國默克公司）； 甲酸 （色譜純， 美國默克公司）；無水硫酸鎂 （分析純， 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）； 氯化鈉 （分析純， 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

（二） 試驗(yàn)方法

1. 樣品前處理。 稱取10 g 攪碎的草莓樣品于50 mL 聚四氟乙烯離心管中， 加入10 mL 乙腈提取液及1 顆陶瓷均質(zhì)子， 劇烈振蕩 2 min， 加入4 g無水硫酸鎂、 1 g 氯化鈉劇烈振蕩1 min， 以4 000 r/min 離心5 min。 移取4 min 上清液于另一玻璃試管中， 向試管中加入0.6 g 無水硫酸鎂、 0.1 g 乙二胺－N－丙基硅烷 （PSA） 粉， 渦旋混勻 1 min， 以3 000r/min 離心 5 min， 吸取上清液過 0.45 μm 濾膜， 待上機(jī)測定。

2. 色譜條件。 色譜柱為 Agilent SB－C18（2.1 mm×100 mm， 2.7 μm）； 流動(dòng)相 A 為 0.1%甲酸水， 流動(dòng)相B 為乙腈， 洗脫梯度見表 1； 流速為0.4 mL/min； 柱溫為 30℃； 進(jìn)樣量為 10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

3. 質(zhì)譜條件。 質(zhì)譜分析條件為采用ESI 離子源， 正離子模式掃描； 噴霧電壓 （IS） 為 5500V （正極）； 離子源溫度為 550℃； 氣簾氣壓力 （CUR）為206.85 kPa； 碰撞氣壓力（CAD）為 48.265 kPa； 霧化氣壓力（GS1）為 379.225 kPa； 輔助氣壓力 （GS2）為 379.225 kPa； 碰撞能量 （CE±CES） 為（35±15）V。

4. 數(shù)據(jù)采集。 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜具有超快的采集速率、 智能化的 TOF MS－IDA－MS/MS 采集模式以及穩(wěn)定耐用的離子源， 非常適合于大量復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析； 可真正實(shí)現(xiàn)一針進(jìn)樣即可采集到全面的和高質(zhì)量的一級(jí)與二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。 因此可通過一級(jí)質(zhì)量化合物及同位素峰、 保留時(shí)間和高質(zhì)量精度的二級(jí)譜進(jìn)行目標(biāo)化合物篩查， 快速高效地提供最準(zhǔn)確的定性篩查結(jié)果。 本研究對(duì)草莓中的20 種農(nóng)藥殘留進(jìn)行定性定量分析， 20 種農(nóng)藥化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)信息見表2。

表2 20 種農(nóng)藥化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)

5. 定性篩查。 采用儀器自帶分析軟件對(duì)采集的譜圖進(jìn)行分析， 在軟件中調(diào)用數(shù)據(jù)庫， 并設(shè)置Mass Error、 Retention Time、 Isotope、 Library Hit、Fonmula、 Finder 的相關(guān)權(quán)重。 軟件給出各檢索參數(shù)的實(shí)測值和理論值的偏差， 通過匹配結(jié)果來確定篩查結(jié)果。

6. 定量分析。 本研究利用基質(zhì)液為溶劑配置系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 將系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定。20 種農(nóng)藥化合物以提取離子色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)， 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為0.5～100 μg/mL。 由于各種農(nóng)藥化合物在儀器上的響應(yīng)有差別， 所以每種農(nóng)藥化合物的線性范圍不一致， 針對(duì)篩查結(jié)果為陽性的樣品要選用合適的曲線濃度范圍， 確保計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確。

二、 結(jié)果與討論

（一） 色譜條件的優(yōu)化本研究比較了甲醇－水和乙腈－水兩種流動(dòng)相體系對(duì)20 種農(nóng)藥化合物分離效果的影響。 甲醇－水流動(dòng)相體系下， 只有個(gè)別農(nóng)藥化合物的分離效果相對(duì)較好， 和乙腈－水體系差別不大， 但是由于甲醇－水作為流動(dòng)相體系時(shí)色譜柱柱壓相對(duì)較高， 所以本研究選用乙腈－水作為流動(dòng)相體系。 之后， 進(jìn)一步考察了水相中添加0.1%甲酸和不添加甲酸對(duì)20 種農(nóng)藥化合物分離效果的影響。 結(jié)果顯示， 水相中添加0.1%甲酸時(shí)可以使個(gè)別農(nóng)藥化合物響應(yīng)較高， 因此本研究選用乙腈－0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

（二） 質(zhì)譜篩查模式的選擇本研究嘗試了信息依賴 （IDA） 采集模式和 SWATH 采集模式。SWATH 采集模式基于高分辨系統(tǒng)， 又綜合了IDA采集模式和多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM） 采集模式的優(yōu)勢，將母離子的質(zhì)量范圍分成多個(gè)質(zhì)量窗口， 每個(gè)窗口內(nèi)的所有離子一起碰撞碎裂， 從而得到整個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)的所有離子的碎片信息。 SWATH 采集模式不同于IDA 采集模式， IDA 采集模式僅對(duì)被選中的離子進(jìn)行二級(jí)譜圖采集， 而SWATH 采集模式是對(duì)所有二級(jí)碎片離子進(jìn)行全范圍掃描， 從而保證了所有碎片離子的連續(xù)性、 掃描的完整性， 使樣品信息被更加完整地保留， 真正實(shí)現(xiàn)非靶向篩查。 所以，本研究選擇用SWATH 采集模式。 在對(duì)同一組數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析時(shí)， 比較了選用二級(jí)離子定量和選用一級(jí)離子定量的響應(yīng)情況， 發(fā)現(xiàn)選用二級(jí)離子定量時(shí)響應(yīng)較低且穩(wěn)定性較弱， 用一級(jí)離子定量則相對(duì)穩(wěn)定且響應(yīng)較高。 究其原因主要是由于SWATH 采集模式下對(duì)母離子打碎所用的碰撞能不同于MRM采集模式， MRM 采集模式所用碰撞能為固定值，而SWATH 采集模式所用碰撞能為一定區(qū)間范圍，且對(duì)母離子的打碎程度也不同， 所以所得的二級(jí)離子響應(yīng)有一定波動(dòng)。 綜上考慮， 本研究選用一級(jí)母離子作為定量離子。

（三） 添加回收率本研究選用QuEChERS 方法作為前處理方法是因?yàn)樵摲椒ň哂锌焖佟?簡便和高效的特點(diǎn)， 現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測中。本研究直接用乙腈提取， 采用無水硫酸鎂、 氯化鈉除去水分， 防止影響定容體積， 再用PSA 粉凈化，除去草莓樣品中的色素、 糖類和有機(jī)酸等多種組分[14]。 結(jié)果顯示， 對(duì)草莓中20 種農(nóng)藥做不同濃度的添加回收試驗(yàn)， 平行6 次得到的平行回收率為62.8%～106.3%， 變異系數(shù)均小于11.6%。 每種農(nóng)藥所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、 相關(guān)系數(shù)等數(shù)據(jù)結(jié)果見表 3。 由表 3 可見， 20 種農(nóng)藥的檢出限可達(dá)0.000 2～0.01 mg/kg， 在 0.000 5～0.1 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好 （R2≥0.995）， 20 種農(nóng)藥的檢出限均低于GB 2763－2021 規(guī)定的其在草莓上的最大殘留限量值， 說明本方法可滿足國內(nèi)市場檢測的要求。

表3 20 種農(nóng)藥的最大殘留限量值、 線性范圍、 線性相關(guān)系數(shù)、 回收率和檢出限

三、 結(jié)論

本探究采用乙腈作為提取試劑， 應(yīng)用QuECh-ERS 方法對(duì)草莓中色素雜質(zhì)等進(jìn)行凈化， 在此基礎(chǔ)上利用 HPLC－QTOF－MS 的 SWATH 采集模式對(duì)草莓樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行了非靶向篩查， 同時(shí)完成了20 種常用農(nóng)藥的殘留定量分析。 本研究建立的方法準(zhǔn)確、 高效、 簡便、 快捷， 具有一定的實(shí)際應(yīng)用性， 可用于草莓質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中農(nóng)藥殘留的快速篩查分析， 有助于實(shí)現(xiàn)草莓農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)的及時(shí)監(jiān)測。