煤層原位微生物群落結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測研究

牛 顯，牛 煜，索永錄

(1.西安科技大學(xué) 能源學(xué)院，陜西 西安 710054；2.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué) 礦業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051；3.山西大學(xué) 電力與建筑學(xué)院，山西 太原 030006)

煤炭是遠(yuǎn)古植物殘骸經(jīng)生物化學(xué)和地球化學(xué)復(fù)雜作用，逐漸形成的固體有機巖石[1]。在生物化學(xué)作用下，成煤的植物殘體受到微生物及自然因素的作用首先被分解，纖維素分解成單糖類，木質(zhì)素氧化成復(fù)雜的、結(jié)構(gòu)多變的腐殖酸及水能溶解的苯環(huán)衍生物，并逐漸轉(zhuǎn)化成為腐殖質(zhì)[2]，最終在覆蓋沉積物和自然條件下形成煤炭。在此演化過程中，微生物是重要參與者。當(dāng)下，學(xué)者們致力于探尋高效降解菌劑去模擬和放大該生物化學(xué)過程，以實現(xiàn)原位生物流態(tài)化采煤[2]。現(xiàn)有研究已證實微生物菌群與環(huán)境因素密切相關(guān)[3]，但它們在煤層環(huán)境中如何分布且參與煤炭降解仍然是未知的。因此，明確不同埋深環(huán)境中優(yōu)勢菌和一般菌種的豐度差異，對于理解、改進(jìn)并構(gòu)建原位降解的復(fù)合菌劑、實現(xiàn)高效原位生物轉(zhuǎn)化具有重要意義。

目前，煤層原位微生物群落研究主要集中于生物成因煤層氣方向，研究樣本取自煤礦煤樣和水樣，實驗手段主要有16S rRNA基因文庫、高通量測序、功能基因克隆文庫、PCR-DGGE指紋圖譜分析、實時定量PCR等分子生態(tài)學(xué)方法。其中，高通量測序以其測序量大、精準(zhǔn)度高、成本低廉等優(yōu)勢，已經(jīng)成為了微生物多樣研究普遍適用的測序方法[4]。2007年，Shimizu等[5]首次報道了日本北部煤層中的微生物多樣性，并利用16S rRNA基因文庫技術(shù)對埋深843～907m煤層水樣的細(xì)菌和古細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究，得到了產(chǎn)甲烷菌屬。Rathi等[6]利用16S rRNA基因擴增方法研究了印度煤層水中微生物群落的組成；其中，細(xì)菌群落以變形菌門和厚壁菌門類群為主，古細(xì)菌群落以廣古細(xì)菌門類群為主。郭紅光等[7]采用高通量測序技術(shù)研究了中國柳林煤層水及儲層煤巖中微生物群落多樣性，發(fā)現(xiàn)不同采樣位置的菌群存在較大差異，甲烷葉菌屬是主要產(chǎn)甲烷菌。蘇現(xiàn)波等[8]利用高通量測序技術(shù)全面的研究了不同地區(qū)煤樣中微生物的多樣性，結(jié)果表明細(xì)菌群落主要以厚壁菌門、變形菌門為主，古細(xì)菌群落主要以廣古細(xì)菌門為主；同時，發(fā)現(xiàn)隨煤階升高細(xì)菌和古細(xì)菌群落的多樣性與豐富度呈下降趨勢，產(chǎn)甲烷菌屬主要為甲烷囊菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷葉菌屬。

煤儲層微生物菌群研究的樣本主要是煤礦開采后的煤樣和水樣，而地質(zhì)鉆孔原位取樣卻很少。煤礦開采后采集的煤樣和水樣不可避免的受到人為因素影響，不能代表真實的原位煤儲層菌群組成。地質(zhì)鉆孔取樣相對保障了煤層的原位環(huán)境，是探研原位煤層微生物菌群組成的有效方式。同時，煤層微生物菌群功能預(yù)測和真菌群落組成方面的研究也較少?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)象，本文以高通量測序法對不同埋深近原位煤樣的微生物群落(細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌)多樣性，菌群組成與差異，以及菌群功能預(yù)測三方面進(jìn)行了研究，為煤炭原位微生物降解和生物成因煤層氣方面的研究提供有價值的生物信息。

1 材料與方法

1.1 煤樣采集與理化性質(zhì)

2021年4月，煤樣采集于內(nèi)蒙古色連二號煤礦東翼K3地質(zhì)鉆孔。煤樣屬不粘煤，其顯微煤巖組分以鏡質(zhì)組為主，含量47.9%～92.4%，最大反射率Rmax為0.445%～0.5216%。K3鉆孔勘深431.94m，在可見煤層-254m、-262.5m和-317m處，選擇三組完整度較好的柱狀煤樣，依次編號為NF1-1，NF1-2，NF1-3。通過乙醇沖洗和再次取芯以減少地質(zhì)鉆孔水的干擾。采出樣先用75%乙醇噴洗外表面，然后迅速裝入無菌袋封口，低溫箱運回實驗室。在無菌超凈臺中，分別將三組樣品沿中心破碎，取樣品內(nèi)芯，視為近原位煤樣。然后，分別取內(nèi)芯樣品32.8g裝入50mL無菌離心管，進(jìn)行后續(xù)測試分析。依據(jù)國標(biāo)GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015進(jìn)行煤炭工業(yè)指標(biāo)和元素分析。

1.2 DNA提取和PCR擴增

按照DNA提取試劑盒說明書抽提樣本DNA，并用超微量紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢DNA。在PCR儀上，細(xì)菌利用292F(5’-ACTCCTACGGGAGGCA GCA-3’)和480R(5’-CGGACTACHVGGGTWTCT AAT-3’)引物對V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴增；古細(xì)菌利用387F(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)和480R(5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)引物對V4-V5區(qū)進(jìn)行PCR擴增；真菌利用296F(5’- CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3’)和480R(5’- ACTTTCGTTCTTGATYRA -3’)引物對18SV4區(qū)進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增程序：98℃預(yù)變性2min，28個循環(huán)(98℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，最后72℃延伸10min。

1.3 擴增產(chǎn)物磁珠純化回收

在25μL PCR產(chǎn)物中加入體積0.8倍的磁珠，充分震蕩懸浮后，磁力架上吸附5min，吸出上清；再次加入20μl 0.8倍磁珠洗滌液，震蕩充分懸浮后，磁力架上吸附5min，小心吸出上清液；然后，添加200μL 80%乙醇，倒置磁力架上，充分吸附后吸出上清液，靜置室溫5min；待酒精揮發(fā)和磁珠出現(xiàn)裂縫后，25μL洗脫液洗脫，并將PCR管放在吸附架上充分吸附5min，取上清液保存。

1.4 測序文庫構(gòu)建

利用熒光定量儀對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，并根據(jù)測序量要求進(jìn)行混合。測序文庫構(gòu)建：①文庫制備試劑盒中的End Repair Mix 2切除DNA序列5’端的突出堿基，同時添加一個磷酸基團、補齊3’端的缺失堿基；②在DNA序列的3’端添加A堿基以防止DNA片段自連，同時保證目標(biāo)序列能與測序接頭相連(測序接頭3’端有一個突出的T堿基)；③在序列5’端添加含有文庫特異性標(biāo)簽(即：Index序列)的測序接頭，使DNA分子能被固定在Flow Cell上；④采用核酸純化磁珠篩選去除接頭自連片段，純化添加接頭后的文庫體系；⑤對上述連上接頭的DNA片段進(jìn)行PCR擴增，從而富集測序文庫模板，并采用磁珠再次純化文庫富集產(chǎn)物；⑥2%瓊脂糖凝膠電泳對文庫做最終的片段選擇與純化。

1.5 高通量測序

基于測序平臺完成文庫測序。測序步驟：①在生物分析儀上，采用安捷倫高靈敏度DNA試劑盒，完成文庫質(zhì)檢(單峰且無接頭)；②在熒光定量系統(tǒng)上，采用檢測試劑盒，完成文庫定量(濃度2nM以上)；③合格的各上機測序文庫梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈上機測序；④利用MiSeq測序儀進(jìn)行雙端測序，試劑為MiSeq Reagent Kit V3。為了保證測序質(zhì)量，最佳測序長度和插入片段范圍應(yīng)為200～450bp。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

依據(jù)高通量序列篩選要求，利用FLASH軟件將成對序列拼接成一條序列，經(jīng)Trimmomatic軟件的質(zhì)控過濾，去除不合規(guī)序列，校正序列方向，完成對原始雙端測序數(shù)據(jù)的優(yōu)質(zhì)序列篩選。利用QIIME2軟件，按DADA2算法和默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列去噪(相當(dāng)于100%相似度聚類)，生成ASVs(amplicon sequence variants)特征序列和特征表。采用QIIME2的classify-sklearn算法，對每個ASVs的特征序列使用預(yù)先訓(xùn)練好的Naive Bayes分類器進(jìn)行物種分類及注釋。其中，細(xì)菌和古細(xì)菌16S rRNA基因選用Silva數(shù)據(jù)庫(Release132，http：//www.arb-silva.de)注釋，真菌18S rRNA基因選用本地化Fungene數(shù)據(jù)庫(RDP整理來源于GeneBank的功能基因數(shù)據(jù)庫)注釋。

基于QIIME2軟件，結(jié)合R語言工具包、GraPhlAn、Krona軟件，對抽平后的ASV表進(jìn)行分類學(xué)物種組成、Alpha多樣性及物種差異進(jìn)行分析。最后，依據(jù)PICRUSt2分析軟件，結(jié)合功能單元PCoA分析，對基因功能潛能進(jìn)行了預(yù)測。其中，功能數(shù)據(jù)庫注釋選用MetaCyc(統(tǒng)計二級功能通路豐度)和KEGG(統(tǒng)計二級功能通路豐度)數(shù)據(jù)庫。

2 微生物群落結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

2.1 煤樣分析

結(jié)合地質(zhì)資料，NF1-1、NF1-2和NF1-3煤樣分別屬侏羅系中下統(tǒng)延安組(J1-2y)第三巖段(J1-2y3)2-1下號煤層(平均厚度2.16m)、第二巖段(J1-2y2)3-1號煤層(平均厚度1.62m)和第一巖段(J1-2y1)6-1上號煤層(平均厚度1.17m)。三組樣品的工業(yè)分析和元素分析見表1。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析

2.2 微生物群落Alpha多樣性

經(jīng)測序，3個樣本的細(xì)菌16S rRNA共得到218392條高質(zhì)量序列量，古細(xì)菌16S rRNA得到304092條，真菌18S rRNA得到372460條。按最小序列抽平，保證樣品間的可比性。在100%序列相似度下，細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌分別劃分出1663個、150個和180個ASV數(shù)。各樣本文庫覆蓋度均達(dá)到99%以上，表明樣本中絕大多數(shù)的微生物能夠被獲得和檢測出來。此外，采用隨機抽樣方法構(gòu)建稀釋曲線，3樣本的稀釋曲線最終趨于平緩，說明樣本所得數(shù)據(jù)量滿足絕大多數(shù)物種。

對3個樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析結(jié)果見表2。Chao1和Observed species指數(shù)表征豐富度，兩指數(shù)值越大群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性，Shannon指數(shù)值越大、Simpson指數(shù)值越小，則群落多樣性越高；Pielou指數(shù)表征均勻度。

2.2.1 群落豐富度

在群落豐富度中(表2)，對比不同埋深煤樣(-254m、-262.5m和-317m)的Chao1和Observed species指數(shù)，發(fā)現(xiàn)微生物群落豐富度為細(xì)菌>真菌>古細(xì)菌，這與前人研究一致[9]。其中，古細(xì)菌和真菌Chao1和Observed species指數(shù)值隨著煤樣埋深的增加而減小，說明其真菌和古細(xì)菌群落豐富度隨煤樣埋深增大而降低。煤樣NF1-2細(xì)菌的Chao1指數(shù)值641.8和Observed species指數(shù)值639.9最大，說明NF1-2煤樣中的細(xì)菌群落豐富度最高?；诳傮w群落角度，微生物群落豐富度隨煤樣埋深增加而降低。這可能是埋深增加改變了煤層環(huán)境，特別是地壓增大，導(dǎo)致了總?cè)郝湄S富度降低；而埋深較淺煤樣可能受外界環(huán)境因素大，如水文地質(zhì)的影響，則群落豐富度高。Raudsepp[10]通過煤層優(yōu)勢群與環(huán)境優(yōu)勢群的對比，驗證了水文地質(zhì)對煤層中微生物的豐富度有顯著的影響；此外，學(xué)者們還分析了煤層裂隙水的微生物功能，也表明了地下微生物的流動性[11]。

表2 微生物群落Alpha多樣性指數(shù)

2.2.2 群落多樣性

在群落多樣性中，各煤樣細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌的Shannon和Simpson指數(shù)值見表2。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，群落多樣性指數(shù)隨煤樣埋深無顯著規(guī)律，各群落內(nèi)的Pielou指數(shù)值差別不大，均勻度不顯著。這說明3個煤樣在各細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌菌群內(nèi)多樣性差異不大，且與樣品埋深無顯著關(guān)系。這也表明煤樣可能受外界干擾因素小，使3個煤樣菌群多樣性和均勻度不顯著。Li等[3]針對不同埋深(-118m和-20m)混合樣品(煤炭+土壤)生物群落多樣性進(jìn)行了研究，得到了細(xì)菌多樣性差異隨埋深變化大，而古細(xì)菌差異性則較?。粶\層樣品細(xì)菌群落多樣性差異顯著正是受外界干擾因素所致。在本研究中，細(xì)菌多樣性隨埋深差異性小。結(jié)合細(xì)菌豐富度指數(shù)，可知3個煤樣細(xì)菌群落是優(yōu)勢群體，而不是古細(xì)菌和真菌群落，這與前人研究一致[9]。

2.3 微生物群落組成與差異

2.3.1 細(xì)菌群落組成與差異

在細(xì)菌中，3個煤樣共鑒定出27門67綱159目267科468屬。在門水平，3個煤樣都以變形菌門為優(yōu)勢門，分別占84.4%、96%和94.9%豐度，如圖1(a)所示。變形菌門是最大的細(xì)菌門，屬革蘭氏陰性菌，環(huán)境分布廣泛，類群龐大，具有固氮、物質(zhì)降解、生物修復(fù)等方面的重要應(yīng)用價值[12]。在前人研究中，鄂爾多斯盆地煤層的細(xì)菌優(yōu)勢門主要是變形菌門和放線菌門[9]。本研究中，細(xì)菌優(yōu)勢門是變形菌門。相對煤礦開采后的煤樣和水樣，近原位煤樣受外界干擾因素小，所以細(xì)菌優(yōu)勢門類可能相對單一。

在屬水平中，NF1-1，NF1-2和NF1-3主要是水桿菌屬為優(yōu)勢屬，分別占36.7%，52.1%和55.3%豐度；其他菌屬占比在2.6%～23.8%豐度之間，如圖1(b)所示。水桿菌屬是叢毛單胞菌科，伯克氏菌目，β-變形桿菌綱，最早在飲水中被發(fā)現(xiàn)。隨后，在我國西藏溫泉沉積物和臺灣淡水中，分別分離得到Aquabacterium tepidiphilum[13]和Aquabacterium lacunae[14]菌種，現(xiàn)已有9菌種被報道。2015年，Pham等[15]從石油污染的土壤中分離得到Aquabacterium olei NBRC 110486菌株，研究發(fā)現(xiàn)該菌株能以汽油、柴油和煤油為碳源生長，降解率達(dá)58%。這說明煤層內(nèi)可能附存有以煤炭為碳源生長，且高效降解煤炭的菌種。對于原位煤層生物降解、煤炭微生物氣化和高效菌株篩選的研究具有重要的意義。

結(jié)合屬水平物種組成熱圖(見附加材料)，重點分析前5豐度(除未分類屬，包括：Aquabacterium、Pelomonas、Inhella、Paucibacter和Ideonella)的屬水平物種差異。水桿菌屬(Aquabacterium)和Paucibacter屬分布差異是隨樣品埋深增加，豐度也增加，最大豐度值NF1-3樣品分別是55.3%和3.6%；Inhella屬則隨樣品埋深增加，豐度降低；而嗜糖假單胞菌屬(Pelomonas)和Ideonella屬在NF1-2中豐度最大。整體來看，煤樣細(xì)菌前5豐度的屬水平物種組成差異小。隨煤樣埋深變化不顯著，無明顯的新增屬或者減少屬。

圖1 近原位煤樣中細(xì)菌門和屬水平群落組成

2.3.2 古細(xì)菌群落組成與差異

在古細(xì)菌中，3個煤樣共鑒定出6門14綱21目26科31屬。在門水平，3個煤樣以廣古菌門(Euryarchaeota)、Asgardaeota門和泉古菌門(Crenarchaeota)為優(yōu)勢門。相對細(xì)菌，煤樣古細(xì)菌的優(yōu)勢門更豐富，各煤樣優(yōu)勢門豐度如圖2(a)所示。同時，隨著煤樣埋深增加，廣古菌門和泉古菌門豐度依次增加，Asgardaeota門豐度依次降低，而丙鹽古菌門(Diapherotrites)是煤樣NF1-1獨有門。

廣古菌門是分布廣泛的古細(xì)菌一門，包括產(chǎn)甲烷菌、極端嗜鹽菌、嗜熱嗜酸菌和嗜熱菌[16]。其中，厭氧產(chǎn)甲烷菌是學(xué)者們在煤層氣領(lǐng)域研究的重點，已成為判別甲烷生物成因的有效數(shù)據(jù)，包括甲烷桿菌綱、甲烷球菌綱、甲烷微菌綱和甲烷火菌綱[17]。Asgardaeota門是新提出的古細(xì)菌門，它被認(rèn)為是破譯真核生物起源的鑰匙[18]。在煤樣中發(fā)現(xiàn)Asgardaeota門，為其分布和特征的認(rèn)知起到積極作用。泉古菌門是最原始的古細(xì)菌類群，包括多種極端嗜熱嗜酸菌群(如熱球菌屬和熱網(wǎng)菌屬)。上述古細(xì)菌門多被認(rèn)為存在于極端環(huán)境，本煤樣發(fā)現(xiàn)此三門且為優(yōu)勢門，說明極端環(huán)境的煤儲層內(nèi)存在有多樣的古細(xì)菌門，并為煤炭的微生物轉(zhuǎn)化研究提供更多的可能。

在屬水平中，3個煤樣的優(yōu)勢屬比較分散，主要包括Odinarchaeia屬、Bathyarchaeia屬、甲烷桿菌屬、Lokiarchaeia屬、Micrarchaeia屬、未分類屬，具體如圖2(b)所示。其中，Odinarchaeia屬是新提出的古細(xì)菌屬，主要被發(fā)現(xiàn)于缺氧的沉積物環(huán)境中(如海底沉積物)，被認(rèn)為是沉積物有機碳降解的關(guān)鍵參與者[18]。Bathyarchaeia屬也是新古細(xì)菌屬，環(huán)境中分布廣泛，被認(rèn)為在全球碳循環(huán)中扮演著重要的角色[19]。本次在近原位煤樣中發(fā)現(xiàn)Odinarchaeia和Bathyarchaeia屬，為其進(jìn)一步環(huán)境分布和生態(tài)特征研究起到推動作用。同時，此兩屬可能涉及甲烷代謝、有機碳和芳香族化合物降解等方面功能[18，19]，這為煤炭生物降解和煤層氣生物成因提供了新的菌群研究。值得關(guān)注的是在煤樣NF1-1和NF1-3中檢測到甲烷桿菌屬，豐度分別為10%和9.98%。它是產(chǎn)甲烷菌之一，能夠厭氧代謝煤炭生成甲烷氣體。目前，學(xué)者們認(rèn)為不同來源樣品中古細(xì)菌群落組成也不同[20]。Wawrik等[21]采集美國白堊紀(jì)果園煤系地層內(nèi)11處樣品，發(fā)現(xiàn)甲烷八疊球菌屬和甲烷微菌屬是主要產(chǎn)甲烷菌屬。然而，美國粉河盆地和切諾基盆地是甲烷八疊球菌[22]。在國內(nèi)研究中，山西晉城沁水盆地的產(chǎn)甲烷菌屬包括甲烷桿菌屬、甲烷微菌屬、甲烷葉菌屬和甲烷螺菌屬，其中甲烷桿菌屬為優(yōu)勢菌屬[23]；鄂爾多斯盆地產(chǎn)甲烷菌屬有甲烷葉菌屬、甲烷絲菌屬和甲烷八疊球菌屬[7，9]。本次鄂爾多斯盆地煤樣是甲烷桿菌屬，與山西晉城沁水盆地優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌屬一致。這豐富了鄂爾多斯盆地產(chǎn)甲烷菌屬生物信息，也說明采樣地煤層中有生物轉(zhuǎn)化甲烷的菌屬，也為實現(xiàn)煤層生物甲烷化提供了可能性。

圖2 近原位煤樣中古細(xì)菌門和屬水平群落組成

結(jié)合屬水平物種組成熱圖(見附加材料)，重點分析前5豐度(除未分類屬，包括：Odinarchaeia、Bathyarchaeia、Marine Benthic Group D and DHVEG-1、Methanobacterium和Lokiarchaeia)的屬水平物種差異。Odinarchaeia和Bathyarchaeia屬分布差異是隨樣品埋深增加，豐度增加；最大豐度是NF1-3樣品，分別為26.9%和21.7%。Marine Benthic Group D and DHVEG-1屬在NF1-2中豐度最大。Methanobacterium屬存在于NF1-1和NF1-3煤樣，而Lokiarchaeia屬單獨存在于NF1-1。整體來看，煤樣古細(xì)菌前5豐度的屬水平物種組成差異大，隨煤樣埋深變化顯著，有明顯的差異和獨有古細(xì)菌屬。

2.3.3 真菌群落組成與差異

在真菌中，3個煤樣共鑒定出20門38綱52目66科72屬。在門水平，NF1-1以84%鏈形植物門(Streptophyta)為優(yōu)勢門；NF1-2和NF1-3是以鏈形植物門、子囊菌門(Ascomycota)和Colpodellidae門為優(yōu)勢門，具體如圖3(a)所示。

鏈形植物門屬綠色植物界，是由淡水中綠藻和有胚植物組成。在光呼吸途徑中，通過過氧化物酶(乙醇酸氧化酶)將自身產(chǎn)生的過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣，常被發(fā)現(xiàn)于池塘、土壤和石頭等[24]。子囊菌門是一類高等菌物，多以陸生，營養(yǎng)方式有腐生、寄生和共生；其中，腐生的子囊菌能分解木材、食品、布匹、皮革及動植物殘體[25]。Colpodellidae門常被發(fā)現(xiàn)于動物排泄物和人類血液中[26]。前人對煤層真菌群落研究較少，已報道中多以子囊菌門、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和綠藻菌門(Chlorophyta)為優(yōu)勢門[27]。本次在煤層中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢門將豐富真菌門類分布特征。

圖3 近原位煤樣中真菌門和屬水平群落組成

在屬水平中，NF1-1是73.1%未分類屬為優(yōu)勢屬；NF1-2以45.8%玉蜀黍?qū)?Zea)和14.7% Colpodella屬為優(yōu)勢屬；NF1-3是以50.9%未分類屬、10.8% Colpodella屬和12.1% 復(fù)膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)為優(yōu)勢屬，如圖3(b)所示。遺憾的是NF1-1和NF1-3主要優(yōu)勢屬未被分類。NF1-2優(yōu)勢屬玉蜀黍?qū)偈侵匾瘫究乒任镏?，廣泛分布于世界各地[28]。本次僅在NF1-2中檢測到玉蜀黍?qū)?，可能是采樣時地面殘留的玉米秸稈混入樣品導(dǎo)致。

結(jié)合屬水平物種組成熱圖(見附加材料)，重點分析前5豐度(除未分類屬：Zea、Colpodella、Saccharomycopsis、Broussonetia和Malassezia)的屬水平物種差異。在真菌屬水平中，煤樣相對較高豐度中含較多的未分類屬，使差異分析質(zhì)量不高。整體來看，近原位煤樣真菌前5豐度的屬水平物種組成差異大，菌屬隨煤樣埋深變化規(guī)律不顯著，但各煤樣有明顯的差異和獨有屬。

2.4 菌群功能預(yù)測

通過Picrust2軟件對煤樣細(xì)菌和古細(xì)菌群落進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫二級功能預(yù)測，真菌群落利用MetaCyc數(shù)據(jù)庫進(jìn)行二級功能預(yù)測(見附加材料)。其中，KEGG通路數(shù)據(jù)庫分為6大類，包括代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞進(jìn)程、生物體系統(tǒng)和人類疾病。MetaCyc數(shù)據(jù)庫包括生物合成，降解/利用/同化，前體代謝物和能量的產(chǎn)生，聚糖途徑和代謝簇。

在二級功能水平下，細(xì)菌預(yù)測30個功能，古細(xì)菌預(yù)測29個，真菌預(yù)測27個。在細(xì)菌和古細(xì)菌中，相對豐度前5位的預(yù)測功能都屬代謝類通路。其中，細(xì)菌和古細(xì)菌相對豐度前4位的氨基酸代謝，碳水化合物代謝，輔因子和維生素的代謝，萜類和聚酮化合物的代謝是相同代謝。而相對豐度第5位的細(xì)菌是脂質(zhì)代謝，古細(xì)菌是能量代謝。經(jīng)代謝可知，細(xì)菌和真菌前五位代謝都屬基本生物代謝。其中，碳水化合物和脂肪是生物的主要能源。碳水化合物代謝也稱糖類化合物代謝，是微生物主要的碳源和能量來源，且有調(diào)節(jié)細(xì)胞活動的重要功能[29]。一般以葡萄糖、糖原和含糖的復(fù)合物三種形式存在。脂質(zhì)是生物儲能和供能主要物質(zhì)，也是細(xì)胞膜的主要成份對細(xì)胞代謝和增殖至關(guān)重要[30]。而氨基酸是微生物所需蛋白質(zhì)的組成，其代謝與生物的生命活動密切相關(guān)[29]。輔因子是促進(jìn)酶與反應(yīng)物進(jìn)入活化反應(yīng)，并加速酶催化反應(yīng)的物質(zhì)[31]。維生素是微生物所必需的某些少量有機化合物，對生物新陳代謝、生長、發(fā)育和健康有極重要作用[29]。因此，通過預(yù)測功能分析可知細(xì)菌和古細(xì)菌在煤層附存中以維持基本生命活動為主要代謝。

在真菌中，相對豐度前五位的預(yù)測功能分布于生物合成，降解/利用/同化，前體代謝物和能量的產(chǎn)生。它們分別是呼吸作用，脂肪酸和脂質(zhì)降解，碳水化合物生物合成，核苷和核苷酸的生物合成，輔因子/輔基/電子載體和維生素生物合成。不難看出，真菌的前五位預(yù)測功能也都是維持生物基本生命的物質(zhì)合成。其中，呼吸作用是細(xì)胞內(nèi)有機物經(jīng)酶催化后逐步氧化分解，同時釋放能量的過程。而其他預(yù)測功能與細(xì)菌和真菌類似。因此，真菌在煤層附存中也是維持基本生命活動所需物質(zhì)和能量。

3 結(jié) 論

原位煤樣中細(xì)菌群落為優(yōu)勢群體，古細(xì)菌群落為弱勢群體，真菌群落介于中間。其中，細(xì)菌群落以變形菌門為優(yōu)勢門，優(yōu)勢屬為水桿菌屬；古細(xì)菌群落以廣古細(xì)菌門、Asgardaeota門和泉古細(xì)菌門為優(yōu)勢門，而優(yōu)勢屬比較分散，存在有甲烷桿菌屬；真菌群落以鏈形植物門、子囊菌門和Colpodellidae門為優(yōu)勢門，優(yōu)勢屬為玉蜀黍?qū)?、Colpodella屬和復(fù)膜孢酵母屬?？傮w上，微生物群落豐富度隨埋深增高而降低，而多樣性規(guī)律卻不明顯。在預(yù)測功能中，細(xì)菌和古細(xì)菌主要以維持基本生命活動的物質(zhì)和能量進(jìn)行代謝，包括碳源，糖源，氨基酸和維生素；真菌以維持基本生命活動所需物質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)化及合成為主要預(yù)測功能。