衍生化-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定噁拉戈利鈉中2-氟-3-甲氧基苯硼酸

胡素招 錢暮霜

(上海奧博生物醫(yī)藥股份有限公司 上海 201203)

基因毒性雜質(zhì)，是指能夠直接或間接（如通過(guò)代謝激活之后）與DNA（主要是其堿基）發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)。近年來(lái)，陸續(xù)從沙坦類、雷尼替丁、二甲雙胍等藥物中檢測(cè)出亞硝胺類雜質(zhì)殘留[1-6]。2020年5月，國(guó)家藥監(jiān)局也發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》[7]指導(dǎo)綱領(lǐng)?；蚨拘噪s質(zhì)的控制貫穿藥品研制的全生命周期，是一項(xiàng)復(fù)雜而精細(xì)的工程。

硼酸及硼酸酯已成為有機(jī)合成中重要片段，是藥物中的關(guān)鍵中間體。2-氟-3-甲氧基苯硼酸在噁拉戈利鈉的合成工藝中作為起始物料被使用，采用（定量）構(gòu)-效關(guān)系（QSAR）方法進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬的毒性評(píng)估，以預(yù)測(cè)細(xì)菌突變?cè)囼?yàn)的結(jié)果[8]。通過(guò)CASE Ultra構(gòu)-效模擬軟件分析2-氟-3-甲氧基苯硼酸為陽(yáng)性，在PHARM_BMUT數(shù)據(jù)庫(kù)中QSAR計(jì)算的概率為57.2%，在GT_EXPERT數(shù)據(jù)庫(kù)中QSAR計(jì)算的概率為62.1%，因此，該化合物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估歸為“有警示結(jié)構(gòu)，與原料藥結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)；無(wú)致突變性數(shù)據(jù)”的3類雜質(zhì)。參考ICH M7[9-10]，監(jiān)管部門把1.5 μg/d的可接受攝入量作為基因毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)閾值，藥品噁拉戈利鈉的口服最大日劑量為400 mg，故需要在中間體、粗品或成品中控制2-氟-3-甲氧基苯硼酸的限度為0.000 38%。通過(guò)衍生化-液質(zhì)聯(lián)用法來(lái)檢測(cè)噁拉戈利鈉中的2-氟-3-甲氧基苯硼酸的含量，采用銨離子螯合和化學(xué)衍生法（圖1）技術(shù)，在流動(dòng)相體系中添加10 mmol/L的銨離子，采用配備常規(guī)ESI源的液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）單四級(jí)桿分析系統(tǒng)，在SIM模式下用m/z 299.1 (299.1為硼酸酯螯合銨離子[M+NH4]+)進(jìn)行定量分析，靈敏度高、方法簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好，滿足目前法規(guī)規(guī)定的限量要求。

圖1 2-氟-3-甲氧基苯硼酸化學(xué)結(jié)構(gòu)式和衍生化反應(yīng)

1 材料和方法

1.1 試劑和樣品

乙腈、甲酸、二甲亞砜、乙酸均為色譜級(jí)，購(gòu)于Merck公司；甲酸銨為色譜級(jí)，購(gòu)于CNW公司；N-甲基亞氨基二乙酸為分析級(jí)，購(gòu)于TCI公司；超純水、2-氟-3-甲氧基苯硼酸對(duì)照品和噁拉戈利鈉原料藥和粗品均由公司自制。

1.2 儀器和設(shè)備

Agilent 1260液相色譜儀和Agilent 6120四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；XS205DU型電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；DHG-9015A鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件

使用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱（2.1 mm × 50 mm, 3.5 μm）。采用梯度洗脫模式，甲酸銨水溶液（10 mmol/L，用甲酸調(diào)pH 4.0）用作流動(dòng)相A和乙腈用作流動(dòng)相B，洗脫時(shí)間0 ～ 8 min，B保持 8%；8 ～9 min，B升至95%，再保持3 min，12.0 ～ 12.1 min，B降至8%，再保持3 min。進(jìn)樣體積為3 μL，柱溫為40 ℃，流速為0.6 mL/min。

質(zhì)譜儀在電噴霧電離（ESI）中采用正離子模式，選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式用于分析物質(zhì)量檢測(cè)。典型的質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓：3.0 kV，干燥氣的流速和溫度分別為12.0 L/min和350 ℃，霧化氣壓力：60 psi，碎片能量：70 V，SIM 離子：299.1 m/z（[M+NH4]+為硼酸酯螯合銨離子，質(zhì)譜采集時(shí)間：2.0～9.0 min，峰寬：0.10 min。

1.3.2 溶液配制

1）稀釋液 二甲亞砜-乙酸（10∶1）（體積比）。

2）衍生劑 稱取250 mgN-甲基亞氨基二乙酸于25 mL容量瓶中（質(zhì)量濃度10 mg/mL），用稀釋液溶解并定容至刻度，混勻，如有不溶物需過(guò)濾。

3）空白溶液 準(zhǔn)確移取稀釋液500 μL和衍生劑500μL于1.5 mL液相小瓶中，混勻，并將混合物于100 ℃加熱1 h，之后使溫度重新平衡至室溫，待測(cè)。

4）系列對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 精確稱取2-氟-3-甲氧基苯硼酸對(duì)照品，加稀釋液超聲溶解，并定量稀釋制成每1 mL中含760 ng的高濃度對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。用稀釋液逐級(jí)稀釋制成每1 mL中分別包含15.2、45.6、76.0、121.6、152.0、182.4、228.0 ng的溶液，作為系列對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；再分別準(zhǔn)確移取系列對(duì)照品儲(chǔ)備溶液500 μL和衍生劑500 μL于1.5 mL液相小瓶中，混勻，并將混合物加熱至100 ℃持續(xù)1 h，之后使溫度重新平衡至室溫，分別制成1 mL中分別包含7.6[檢出限(LOD)，10%水平]、22.8[定量限(LOQ)，30%水平]、38.0(50%水平)、60.8(80%水平)、76.0(100%水平)、91.2(120%水平)、114.0(150%水平) ng的硼酸酯溶液，作為系列對(duì)照品溶液，待測(cè)。用其響應(yīng)值繪制線性曲線，線性范圍和相關(guān)濃度點(diǎn)可根據(jù)檢測(cè)需要自行調(diào)整。

5）供試品溶液 精密稱取400 mg供試品，置于10 mL容量瓶中，用稀釋液溶解并定容至刻度，混勻，再準(zhǔn)確移取500 μL該溶液和500 μL衍生劑到1.5 mL液相小瓶，混勻，并將混合物加熱至100 ℃持續(xù) 1 h，之后使溫度重新平衡至室溫，平行配制兩份(供試品溶液濃度：20 mg/mL)。

6）回收率測(cè)定溶液 稱取400 mg供試品置于10 mL容量瓶中，分別用濃度水平為30%、80%、100%和120%的系列對(duì)照品儲(chǔ)備溶液溶解并定容至刻度，混勻，再準(zhǔn)確移取該溶液500 μL和衍生劑500 μL到1.5 mL液相小瓶，混勻，并將混合物加熱至100 ℃持續(xù)1 h，之后使溫度重新平衡至室溫，平行配制三份。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

開發(fā)的LCMS方法的專屬性是通過(guò)噁拉戈利鈉和對(duì)照品溶液的保留時(shí)間確定的，采用常規(guī)反相色譜體系在C18色譜柱上進(jìn)行分離，硼酸酯的保留時(shí)間約為3.6 min（圖2）。低比例有機(jī)相（8%乙腈）主要用于洗脫硼酸酯，高比例有機(jī)相（95%乙腈）用于洗脫噁拉戈利鈉，噁拉戈利鈉的保留時(shí)間約為10.4 min和10.6 min（注：出現(xiàn)雙峰是因?yàn)閲f拉戈利鈉化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有剛性環(huán)的手性N），硼酸酯和噁拉戈利鈉都能達(dá)到基線分離，且空白溶液對(duì)主峰的檢測(cè)無(wú)干擾，表明本方法專屬性良好。注意事項(xiàng)：由于噁拉戈利鈉濃度很高，為避免污染質(zhì)譜系統(tǒng)，建議將流路設(shè)置為“引入廢液”。

圖2 化合物HPLC圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

本方法的線性研究是通過(guò)從LOQ水平到150%水平濃度的六種雜質(zhì)濃度溶液進(jìn)行的。按照上述對(duì)照品溶液的制備過(guò)程和儀器方法參數(shù)進(jìn)行LCMS分析，對(duì)照品溶液由低濃度到高濃度進(jìn)樣，在24.3～121.6 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，通過(guò)最小二乘回歸分析尋找“峰面積”和“雜質(zhì)濃度”之間的關(guān)系，回歸方程：y=430.447 5x+ 2 244.665 7，相關(guān)系數(shù)r為0.998 4（n=6)。表明在指定的濃度范圍內(nèi)兩個(gè)參數(shù)之間線性關(guān)系良好。

本方法LOQ可達(dá)24.3 ng/mL（信噪比大于10）。將對(duì)照品溶液進(jìn)一步稀釋至信噪比約3時(shí)所得的濃度為本方法的LOD 8.1 ng/mL（信噪比大于3），滿足法規(guī)規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)0.000 38%。

2.3 重復(fù)性

100%濃度水平（81.05 ng/mL）的對(duì)照品溶液六次重復(fù)進(jìn)樣，2-氟-3-甲氧基苯硼酸的保留時(shí)間RSD為1.0%和峰面積RSD為1.1%，在可接受的范圍內(nèi)，滿足方法要求。

2.4 準(zhǔn)確度

使用一式三份的回收率溶液評(píng)估30%、80%、100%和120%濃度水平的2-氟-3-甲氧基苯硼酸的準(zhǔn)確性。計(jì)算得到其回收率范圍為90.4%～106.5%。表明該方法回收率較好。

2.5 樣品測(cè)試

選取公司制備的不同批次噁拉戈利鈉原料藥和粗品，制備成供試品溶液后進(jìn)行LCMS分析測(cè)試，樣品中均未檢出2-氟-3-甲氧基苯硼酸。

2.6 溶液穩(wěn)定性

存放于LC樣品瓶中的對(duì)照品和供試品溶液于室溫下加蓋密封放置不同時(shí)間時(shí)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果沒(méi)有顯著變化（表1），表明溶液于室溫放置16 h穩(wěn)定。

表1 溶液放置不同時(shí)間對(duì)2-氟-3-甲氧基苯硼酸測(cè)定的影響

2.7 衍生化試劑的選擇

本研究選擇N-甲基亞氨基二乙酸作為衍生化試劑是因?yàn)樗奖阋椎?，通用性好，與2-氟-3-甲氧基苯硼酸反應(yīng)只生成一種衍生物，且能迅速被定量。為了使微量基因毒性雜質(zhì)的轉(zhuǎn)化完全，衍生化試劑與微量雜質(zhì)摩爾比在幾萬(wàn)到百萬(wàn)倍不等，本研究表明5 mg/mL衍生化試劑為HPLC上分離的合適濃度范圍，濃度太高容易導(dǎo)致色譜柱過(guò)載，影響色譜柱性能。

3 討論

我們開發(fā)了一個(gè)簡(jiǎn)單的衍生化方法即可測(cè)定原料藥或原料藥中間體中低至0.000 1%～0.000 5%的非含氮芳香族硼酸的測(cè)定方法?；趯?duì)2-氟-3-甲氧基苯硼酸化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子特性的理解，利用化學(xué)衍生化和銨離子螯合與LCMS相結(jié)合可以建立高靈敏的分析方法，該方法也可適用于其他藥物中硼酸類基因毒性雜質(zhì)的分析。本研究采用配備常規(guī)ESI源的LCMS單四級(jí)桿分析系統(tǒng)，用銨離子螯合和化學(xué)衍生法檢測(cè)噁拉戈利鈉中的基因毒性雜質(zhì)2-氟-3-甲氧基苯硼酸含量，靈敏度高、方法簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好，滿足目前法規(guī)規(guī)定的限量要求。另外，通過(guò)將儀器設(shè)置為將高濃度藥品基質(zhì)引入廢液，可減少對(duì)質(zhì)譜系統(tǒng)的污染。因此，該方法非常適合對(duì)噁拉戈利鈉中潛在的痕量基因毒性雜質(zhì)2-氟-3-甲氧基苯硼酸進(jìn)行日常定量分析。