替米考星原粉和可溶性粉在單次給藥肉雞的藥代動力學研究

宋圣哲， 王俊豪， 童照寒， 黃心河， 楊彩梅， 金慶日

(浙江農(nóng)林大學 動物科技學院·動物醫(yī)學院 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應用技術研究重點實驗室，浙江 臨安 311300)

替米考星(Tilmicosin)是美國禮來公司于上世紀80年代開發(fā)，并于90年代商品化上市的一種由泰樂菌素半合成的大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素[1]。替米考星是由泰樂菌素經(jīng)過酸溶液水解的產(chǎn)物。替米考星的合成路線主要有2條。1) 由泰樂菌素堿進行水解合成；2) 利用泰樂菌素磷酸鹽或泰樂菌素酒石酸鹽進行水解，脫掉相應的鹽基，再進一步合成[2]。替米考星的抗菌譜很廣，對所有的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、螺旋體、支原體等均有抑制活性。對家禽、豬、牛、羊等動物由敏感菌引起的感染性疾病具有顯著的防治效果[3-4]，農(nóng)業(yè)部也已審批多種替米考星原料和制劑[5]。

替米考星的抑菌和殺菌作用機制為抑制細菌蛋白的合成，進而發(fā)揮良好的殺菌作用[6]。它可以可逆性的結合細菌核糖體的50S亞單位，作用于P位結合點，阻礙mRNA的移位，阻止肽鏈的延長[7]，發(fā)揮其抑菌活性。但替米考星不與哺乳動物的核糖體80S亞單位結合，此機制可能與其毒性較小有關。據(jù)Nerland EM等報道，仔豬感染胸膜肺炎放線桿菌后給其灌服400 μg/g替米考星，可誘導支氣管肺泡液中的白細胞凋亡，并減輕肺部炎癥[8]。

替米考星的藥動學特征表現(xiàn)在通過皮下注射或口服給藥后吸收快、血中藥物半衰期長、藥物組織穿透力強、體內(nèi)分布容積大[3]、在乳房組織和肺部組織中藥物質(zhì)量濃度高、有效血藥質(zhì)量濃度維持時間長和消除緩慢[9]。替米考星可用于治療和控制肉雞的由雞毒支原體[10]、鼻氣管炎鳥疫桿菌[11]、雞滑液霉形體[12]和多殺性巴氏桿菌及其他敏感菌引起的家禽呼吸道疾病，且效果顯著。替米考星對所有的革蘭陽性菌、部分革蘭陰性菌、支原體及螺旋體均具有良好的抗菌活性[13]。特別對畜禽支原體，化膿棒狀桿菌，肺炎鏈球菌，化膿鏈球菌，巴氏桿菌，金黃色葡萄球菌及胸膜肺炎放線桿菌的活性比泰樂菌素更強[2]。Jordan F T等的研究結果表明，替米考星和泰樂菌素對雞滑液霉形體的MIC90分別為0.006～0.025 μg/mL和0.833 μg/mL，替米考星和泰樂菌素對雞敗血霉形體的MIC90為0.002 5～0.1和0.078 μg/mL[10]，由此可知替米考星的抗菌活性較泰樂菌素強。與泰樂菌素相比，替米考星治療大腸桿菌[14]、雞毒支原體[10, 14]、雞巴氏桿菌病[15]感染的病雞，可降低氣囊的損傷程度[14]，減輕病原菌性疾病對實驗雞體重減輕的影響[10]，減少病原菌引起的家禽病理性損害程度，降低死亡率[15]。

該試驗將施行替米考星原粉組和37.5%替米考星可溶性粉組的藥動學試驗，用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)檢測肉雞血漿中替米考星的質(zhì)量濃度，再通過Winnonlin軟件，計算藥動學參數(shù)，闡明替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉在肉雞體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1) 儀器 電子分析天平(G&G electronic scale DT5000，上海錫為科學儀器有限公司)；高速離心機(Eppendorf centrifuge 5418，廣州雷得生物技術有限公司)；磁力攪拌器(85-2，杭州儀表電機有限公司)；UPLC-MS/MS(美國沃特世公司)；Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 色譜柱(美國沃特世公司)； 振蕩混勻器(Vortexgenie2，妙生科技有限公司)；真空濃縮儀(德國艾本德公司)；超聲波清洗器(Biosafer SB-5200DT，南京賽飛生物科技有限公司)。

2) 實驗動物 健康、體重相似的黃羽肉雞8只，購自浙江省杭州市臨安區(qū)肉雞養(yǎng)殖有限公司。

3) 試劑 替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉，由浙江萬方生物科技有限公司提供。肝素鈉(185 USP units/mg)、生理鹽水、乙腈、甲酸、甲醇，購自生工生物工程(上海)股份有限公司。舒泰50，購自法國維克公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1) 流動相的制備 0.1%甲酸(A)∶乙腈(B)= 1∶9(V/V)

2) 替米考星標準溶液的制備 準確稱取替米考星100 mg，置于5 mL容量瓶，用流動相稀釋至刻度，配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的標準品儲備液。用流動相進行梯度稀釋，獲得質(zhì)量濃度為0.5、1、2.5、5、10、20、50和200 μg/mL的標準品溶液。

1.2.2 灌服給藥

健康肉雞8只，在溫度和濕度恒定的實驗動物房(浙江農(nóng)林大學動物科技學院)適應飼養(yǎng) 1周后，隨機分為替米考星原粉組和37.5%替米考星可溶性粉組。灌服給藥前禁食12 h以上，不禁水。以30 mg/kg劑量，給其中4只灌服替米考星原粉溶液，另外4只灌服37.5%替米考星可溶性粉溶液。雞只的體重為(1.87±0.07) kg。

1.2.3 給藥和采血方案

替米考星原粉組和37.5%替米考星可溶性粉組以30 mg/kg劑量灌服。分別在肉雞灌服給藥后0.5、1、2、3.5、4、4.5、6、8和24 h，通過翅靜脈采集血液，每次采集0.5 mL。將采集好的全血置于肝素納離心管中，以8 000 r/min 離心3 min，取血漿并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 標準曲線樣品的預處理與檢測

取45 μL雞空白血漿，置于1.5 mL離心管中，每管加5 μL質(zhì)量濃度分別為 0.5、1、2.5、5、10 μg/mL替米考星標準溶液，渦旋振蕩混勻。每管加150 μL甲醇，渦旋震蕩混勻5 min，13 000 r/min離心 5 min，取上清至干凈EP管。45 ℃真空干燥，加200 μL流動相，渦旋振蕩混勻3 min，13 000 r/min離心5 min，取上清，用UPLC/MS/MS檢測血漿中替米考星的質(zhì)量濃度。

1.2.5 血液樣品預處理與檢測

取50 μL雞只血漿，置于1.5 mL離心管中，每管加150 μL甲醇，渦旋震蕩混勻5 min，13 000 r/min離心5 min，取上清至干凈EP管。45 ℃真空干燥，加200 μL流動相，渦旋振蕩混勻3 min。13 000 r/min離心5 min，取上清，用UPLC-MS/MS檢測血漿中替米考星的質(zhì)量濃度。

1.2.6 液相色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 Column(2.1×100 mm，1.7 μm)，流動相為0.1%甲酸(A)：乙腈(B)= 1∶9(V/V)。梯度洗脫條件如下，0～1 min為90% A，1～2 min為5% A，2～3 min為 50% A，3～5 min為90% A。流速為0.3 mL/min，進樣體積為10 μL，分析時長為5 min。

1.2.7 質(zhì)譜分析條件

用電噴霧離子源(ESI)，正離子(ES+)模式進行掃描，多離子反應監(jiān)測(MRM)模式下進行檢測。替米考星母離子的質(zhì)荷比(m/z)為869，二級質(zhì)譜子離子的質(zhì)荷比為174，相應的碰撞電壓分別為58 eV和51 eV。其他參數(shù)的設置如下：脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/hr，錐孔電壓25 V，錐孔氣流量50 L/hr，毛細管電壓3.50 kV。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

用 Winnonlin 軟件的非房室模型，計算各種藥動學參數(shù)，如消除半衰期(t1/2)、峰時(Tmax)、峰濃度(Cmax)、藥-時曲線下面積(AUC)、表觀分布容積(Vz)、體清除率(CL)和平均滯留時間(MRTlast)等。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜分析

在正離子模式下，替米考星母離子經(jīng)能量碰撞，碎裂成特征性子離子。質(zhì)荷比為869的替米考星母離子碎裂成質(zhì)荷比為174的子離子。

2.2 替米考星血漿樣品的標準曲線

替米考星標準溶液的質(zhì)量濃度依次為0.05、0.1、0.25、0.5、1 μg/mL。以替米考星標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。在質(zhì)量濃度為0.05 ～ 1 μg/mL時，替米考星峰面積與標準溶液質(zhì)量濃度呈線性相關，標準曲線見圖1，按照標準溶液質(zhì)量濃度和峰面積得到回歸方程為y=3.852 5 x+113.46，相關系數(shù)(R2)為0.996。

圖1 替米考星的標準曲線

圖2a為肉雞空白血漿色譜圖。如圖2a所示，肉雞空白血漿中未檢測出明顯的雜質(zhì)峰，此分析方法可應用于替米考星肉雞血漿樣品的分析。圖2b為替米考星標準溶液(0.25 μg/mL)的色譜圖，圖2c為肉雞灌服替米考星原粉后1 h的色譜圖。替米考星的保留時間為2.60 min，峰型對稱，分離度好，無雜質(zhì)峰干擾。

a為肉雞空白血漿的色譜圖；b為替米考星標準溶液(0.25 μg/mL)的色譜圖；c為肉雞灌服替米考星原粉后1 h的色譜圖

2.3 肉雞灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉溶液后的血藥濃度

表1 灌服鹽酸替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的血藥質(zhì)量濃度

圖3為肉雞灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉溶液后的藥時曲線。由表1和圖3可知，除了給藥后8～24 h以外，肉雞灌服37.5%替米考星可溶性粉溶液后的血藥質(zhì)量濃度均高于替米考星原粉的血藥質(zhì)量濃度。其中，肉雞灌服37.5%替米考星可溶性粉溶液后3.5 h的血藥質(zhì)量濃度顯著高于替米考星原粉(表1)。如表2和圖3所示，37.5%替米考星可溶性粉溶液后的AUCall和AUCinf均大于替米考星原粉的AUCall和AUCinf，表明37.5%替米考星可溶性粉在肉雞體內(nèi)到達全身血液循環(huán)的量大于替米考星原粉。

圖3 肉雞灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的藥時曲線

2.4 藥動學參數(shù)的計算

用Winnonlin軟件的非房室模型，計算各種藥動學參數(shù)，表2為肉雞灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的藥動學參數(shù)。

表2 灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的藥動學參數(shù)

由表2可知，AUCall指t0～t10 h的藥時曲線下面積，AUCinf指t0～t∞的藥時曲線下面積，MRTlast為平均滯留時間。

肉雞灌服37.5%替米考星可溶性粉后的Cmax大于替米考星原粉，AUCall和AUCinf也均大于替米考星原粉的AUCall和AUCinf。肉雞灌服37.5%替米考星可溶性粉和替米考星原粉后的t1/2無顯著性差異。肉雞灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的Vz、CL和MRTlast均小于替米考星原粉，表明37.5%替米考星可溶性粉在體內(nèi)的分布和滯留時間短于替米考星原粉，因此,用37.5%替米考星可溶性粉時可縮短其休藥期。

3 討論與結論

以30 mg/kg灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的Tmax均出現(xiàn)在2 h。但是Tmax是時間依賴性參數(shù)，只有當藥物的釋放速度與臨床療效或安全性密切相關時，才需要做統(tǒng)計和評價。肉雞灌服37.5%替米考星可溶性粉后的Cmax顯著大于替米考星原粉，AUCall和AUCinf也均大于替米考星原粉的AUCall和AUCinf，表明37.5%替米考星可溶性粉在肉雞體內(nèi)的吸收速率、吸收程度和到達全身血液循環(huán)的量均大于替米考星原粉，由此也可以推測37.5%替米考星可溶性粉在肉雞體內(nèi)的生物利用度也高于替米考星原粉。通過該試驗獲得的37.5%替米考星可溶性粉的相對生物利用度為266.7%。

用高效液相色譜法(HPLC)檢測雞血漿中替米考星質(zhì)量濃度時，大多數(shù)血漿樣品中替米考星的質(zhì)量濃度低于在檢測限，無法準確無誤地檢測雞血漿中替米考星的質(zhì)量濃度。因此，該試驗選用UPLC-MS/MS，檢測雞血漿中替米考星的質(zhì)量濃度。UPLC-MS/MS技術近10年來發(fā)展迅速并逐漸成熟，在檢測分析領域應用廣泛。液質(zhì)聯(lián)用技術既具有液相色譜的高分離能力，也具有質(zhì)譜的強特異性、多通道檢測、高靈敏度等特點[16]。它對生物樣本的預處理要求較低，樣品中不同組分不需要完全分離，對樣品中微量組分可進行定性和定量分析，分析過程極大地被簡化，分析時長也較短。

該試驗用UPLC-MS/MS檢測肉雞血漿中替米考星的質(zhì)量濃度，再通過藥動學研究闡明替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉在肉雞體內(nèi)的藥動學行為。試驗結果表明，37.5%替米考星可溶性粉比替米考星原粉具有更好的吸收程度和更短的滯留時間，臨床應用可適當減少給藥劑量或增加給藥間隔時間，也可縮短休藥期。37.5%替米考星可溶性粉可提高替米考星的相對生物利用度，防止抗生素的濫用，合理應用抗生素，避免細菌耐藥性的產(chǎn)生。該試驗的研究結果將為37.5%替米考星可溶性粉的臨床應用提供理論和應用依據(jù)，也將為大環(huán)內(nèi)酯類藥物的藥動學研究提供參考。