玉米TRIBOA-Glc鄰甲基轉移酶基因bx7的克隆及其生物信息學分析

徐碧瑩， 黃偉鵬， 張敏艷， 吳委林， 鄭大浩

(延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002)

玉米(學名：Zea mays)在我國是3大糧食作物之一[1]，是世界上重要的糧食作物和豐產性最高的谷物作物[2]。在自然界危害玉米的害蟲種類超過90多種[3]，從玉米的根部到其上部的雄穗，受到根蟲、莖稈蛀蟲的侵害較多[4]。近年來，由于傳統(tǒng)種植方式的改變，導致玉米蟲害發(fā)生具有越來越加重的趨勢[5-6]。據(jù)研究，植物內源性苯并噁嗪類次生代謝物與其生抗性和植株表皮組織結構上防御響應密切相關[7-8]，賦予了植株對害蟲及病原菌的廣泛普遍的抗性。苯并惡嗪代謝從吲哚-3-甘油磷酸開始，經過吲哚、吲哚-2-酮、3-羥基吲哚-2-酮合成出2-羥基-苯并惡嗪-3-酮(HBOA)，再由HBOA合成出DIBOA及其衍生物DIBOA-葡萄糖苷和TRIBOA-葡萄糖苷[9]。此后在不同的鄰-甲基轉移酶的作用下進行甲基化產生各種賦予植物真正防御機能的含有甲氧基的苯并噁惡嗪-3-酮-葡萄糖苷類物質[10]。bx7基因是苯并噁嗪代謝途徑中的關鍵酶之一，催化由TRIBOA-葡萄糖苷轉化為丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)，在玉米植株抗蟲方面起著重要作用。

該研究采用cDNA-PCR克隆技術，從玉米Mo17中克隆編碼TRIBOA-Glc鄰甲基轉移酶的bx7基因，并對目標序列進行生物信息學分析，為TRIBOA-Glc鄰甲基轉移酶的體外合成和功能驗證奠定基礎，這對揭示玉米抗蟲性的分子機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗采用高抗蚜蟲玉米自交系Mo17種子，培養(yǎng)在農學院教學實驗基地，待玉米苗長至3葉期取樣并保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

總RNA提取按照RNA提取試劑盒說明書操作，cDNA合成按照Promega公司GoScriptTM反轉錄試劑盒說明書操作。

1.2.2 基因克隆與測序

利用NCBI網(wǎng)站(National Center for Biotechnology Information)下載玉米TRIBOA-Glc鄰甲基轉移酶bx7基因的mRNA序列(登錄號為NM_001127247.2)，然后通過BLAST分析方法，進行多序列比對分析。利用Primer Premier 6.0設計引物，利用Auto Dimer 1.0來檢測所設計的引物質量。其中正向引物為bx7EC545F1：GAATTCTGGGAAGAGTGTCATCAA(下劃線部分為限制性內切酶EcoR I位點)；反向引物為bx7XI2161R:CTCGAGATGTTTCCGTCCTCCGA(下劃線部分為限制性內切酶Xho I位點)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1) PCR擴增體系 cDNA，1 μL,Taq-GreenMix，5 μL,10 μmol/L引物各1 μL，最終加ddH2O補充至10 μL。

2) 反應條件為 95 ℃預變性，5 min；95 ℃，30 s，57.1 ℃，45 s，72 ℃，1 min 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸反應10 min。

3) PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證正確后，利用膠回收試劑盒將擴增出的目標條帶進行回收。將回收后的產物連接到pMD-19T載體上，再導入到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α中，在含有氨芐青霉素、IPTG、X-Gal的培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，經過藍白斑選擇挑取陽性克隆。經酶切驗證正確后將菌液送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.3 目標序列的同源性分析

將得到的測序結果，利用DNA Star軟件和Gene Doc軟件進行序列分析和同源性比對分析。在NCBI上下載禾本科bx7蛋白序列，再用MEGA7軟件構建進化樹。

1.2.4 目標序列的生物信息學分析

目標序列編碼的蛋白質序列分析，通過在NCBI網(wǎng)站上進行Blast分析確定為bx7基因后應用BioEdit軟件進行分析，采用ExPASy Proteomics Server在線工具中ProtScale模塊對bx7基因編碼的蛋白質進行親疏水性等一級結構的分析；通過NCBI在線網(wǎng)站對目標序列編碼的蛋白質進行序列同源性分析；使用TMHMM2.0、SOPMA、SWISS-MODEL在線分析工具對目標蛋白的跨膜區(qū)域分析，對二級結構、三級結構進行預測。

2 結果與分析

2.1 bx7基因序列分析

以高抗蚜蟲的玉米自交系Mo17為材料，提取RNA反轉錄為cDNA,以cDNA為模板成功克隆出含有完整的目標基因的cDNA片段(1 522 bp)(圖1)，在NCBI網(wǎng)站上與標準基因序列進行分析，經分析所獲序列含有一個完整的開放閱讀框，長1 176 bp，編碼392個氨基酸(圖2，3)。與標準基因序列相比共發(fā)生16處突變，存在1個6堿基和1個3堿基的插入突變，2個3堿基的缺失突變，12個單堿基突變。其中，1個單堿基突變位于起始密碼的上游-30 bp處，2個單堿基突變位于終止密碼的下游1 300～1 340 bp。蛋白質序列存在6處變化，即從N末端開始第92個氨基酸和第336個氨基酸天門冬氨酸(D)丟失，第124個氨基酸丙氨酸(A)變成甘氨酸(G)，第127個氨基酸甘氨酸(G)變成丙氨酸(A)，并且存在第120個氨基酸絲氨酸(S)、第122個氨基酸天門冬氨酸(D)、丙氨酸(A)的插入。

注：M為2 000 bp 、15 000 bp DNA marker；第1泳道為以cDNA為模板的PCR產物；第2泳道為PCR擴增回收產物；第3泳道為重組質粒為模板的PCR產物；第4泳道為以插入目的片段的重組質粒(pMD-19T重組質粒)；第5泳道為重組質粒酶切產物。

圖2 玉米自交系Mo17與標準基因組B73基因序列比較

2.2 目標序列的生物信息學分析

2.2.1 蛋白質理化性質分析

利用在線工具ProtScale、TMHMM 2.0對編碼的蛋白質的親疏水性(圖4)與跨膜區(qū)域結構(圖5)進行分析。結果顯示，從自交系Mo17中分離的目標序列編碼由392個氨基酸組成的蛋白(bx7Zm1753Mo17P)，與玉米標準基因組(B73)的參考蛋白(bx7Ref_B73P)相比，含有相同的親水性氨基酸殘基數(shù)，均為226個；含有的疏水性氨基酸殘基數(shù)不同，參考蛋白含有疏水性氨基酸殘基165個；目標蛋白含有疏水性氨基酸殘基166個。在參考蛋白中，丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、纈氨酸(V)、天門冬氨酸(D)、絲氨酸(S)等6種氨基酸占蛋白質總氨基酸殘基數(shù)(391)的50.1%；在目標蛋白中，占蛋白質總氨基酸殘基數(shù)(392)的50.3%，所占比例差距不大。但在全部氨基酸中，丙氨酸(A)的比例最大(11%)，色氨酸(W)與天冬酰胺(N)所占比例最低(均為1.5%)

注：峰值<0表示親水性，A表示親水區(qū)(Hydrophilic domain)；峰值>0表示疏水性，B表示疏水區(qū)(Hydrophobic domain)。

圖5 參考蛋白和目標蛋白跨膜結構分析

目標蛋白與參考蛋白的相對分子量分別為42.58 KD與42.53 KD；總元素數(shù)量分別為5 925與 5 914。除O元素、S元素數(shù)量相同外，其余3種組成元素C、H、N均有差異，分別為1 860、24、531和1857、293、530。正電荷殘疾總數(shù)相同均為38個；負電荷殘基總數(shù)相差1，分別為54、55。目標蛋白與參考蛋白經在線分析，穩(wěn)定系數(shù)小于40，表明目標序列和參考序列編碼的蛋白的穩(wěn)定性較好，推斷為穩(wěn)定的親水性蛋白。該蛋白在Mo17與標準基因組的B73中均無跨膜區(qū)域結構，屬于無跨膜結構的親水性蛋白。

利用線上ProtScale軟件的Hphob. / Kyte& Doolittle模塊對目標蛋白bx7Zm1753Mo17P的親疏水性進行分析，從結果來看(圖3)，目標蛋白bx7Zm1753Mo17P與參考蛋白bx7Ref_B73P具有相似的親水結構，疏水結構有些差異。峰值<0表示親水性，峰值>0表示疏水性，在圖中A區(qū)(A1-A10)代表親水區(qū)，B區(qū)(B1-B10)代表疏水區(qū)。在疏水區(qū)(B區(qū))B4區(qū)域對比可看到有明顯不同，不同區(qū)域的親疏水強弱不同，這可能反映了蛋白質的親水性和疏水性序列譜的折疊情況。

圖3 玉米自交系Mo17與標準基因組B73編碼蛋白質比較

2.2.2 蛋白質二級三級結構預測

通過使用SOPMA預測目的蛋白的二級結構可看出(表1，圖6)，目標蛋白和參考蛋白均由α螺旋、β轉角、無規(guī)則卷曲與延伸鏈構成，其中，α螺旋與無規(guī)則卷曲占氨基酸總數(shù)的比例較大，在參考蛋白中分別占47.06%與34.78%，在目標蛋白中分別占44.64%與35.71%，而β轉角占氨基酸總數(shù)的比例最小，僅占了4.86%與5.61%。

表1 目標蛋白和參考蛋白的二級結構

注：a(藍色)為α螺旋；b(玫紅色)為無規(guī)則卷曲；c(綠色)為β轉角;d(紅色)為延伸鏈

利用蛋白質數(shù)據(jù)庫PDB網(wǎng)站的3D Structure Viewers在線可視化工具預測參考蛋白bx7Ref_B73P和目標蛋白bx7Zm1753Mo17P的三級結構，得到三維結構圖(圖7)。由于目標片段編碼的蛋白質氨基酸序列與標準基因組上所推斷的蛋白質氨基酸序列相比，存在7個氨基酸的差異，導致參考蛋白和目的蛋白的三級結構發(fā)生顯著變化。

圖7 參考蛋白和目的蛋白的三級結構預測

2.2.3 bx7蛋白的同源性分析及進化樹

在NCBI在線分析工具中下載獲得與bx7相似性高的序列，并且利用MEGA7軟件來構建玉米(Mo17)、普通小麥(XP_044393359.1)、硬粒小麥(VAI34156.1)、二粒小麥(XP_037442496.1)、黑麥(AXY54917.1)、大麥(KAE8793625.1)、二棱大麥(XP_044965079.1)、畫眉草(TVU31390.1)、柳枝稷(XP_039772587.1)、黍稷(RLM70322.1)、高粱(XP_002441380.2)、疣粒稻(KAF0887985.1)、粳稻(XP_015619557.1)、秈稻(EAY82987.1)、短柄草(XP_014752382.1)、谷子(XP_004962112.1)的進化樹(圖8)。結果顯示，玉米(Mo17)與谷子、短柄草在同一支，普通小麥、硬粒小麥、二粒小麥、黑麥、大麥、二棱大麥、畫眉草在同一支，柳枝稷、高粱、黍稷、疣粒稻、粳稻和秈稻在同一分支，說明玉米與谷子、短柄草的親緣關系最近。

圖8 bx7與其他植物的氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.2.4 bx7蛋白的功能預測

將bx7基因編碼的氨基酸序列導入到NCBI數(shù)據(jù)庫中的Conserved Domain Database模塊進行相關蛋白結構域預測。預測結果表明，該蛋白有2個保守結構域(圖9)，該結構域分別位于第30～90和170～380位氨基酸之間，屬于dimerization2 超級家族和AdoMet_MTases 超級家族。

圖9 參考蛋白和目的蛋白的保守結構域

3 討論與結論

苯并惡嗪類化合物是參與植物防御的一類重要的次生化合物，具有抗病蟲害和化感等作用[11]。在苯并噁嗪類化合物中丁布(DIMBOA)被認為是與植物抗病蟲害密切相關的代謝物質[11]。有研究資料顯示，當丁布含量達到一定程度時，能夠完全抑制小麥赤霉病菌孢子的生長[12]；同時用丁布來飼喂家蠶幼蟲，會導致家蠶幼蟲在3 d內死亡[13]。丁布的分解產物也成為有效的化感作用的化合物，能夠降低一些雜草的生長和萌發(fā)[14]。在丁布合成途徑中，bx7基因催化TRIBOA-葡萄糖苷轉化為丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)[15-16]。不同的玉米對抗蟲性存在很大差異可能與TRIBOA-葡萄糖苷轉化為丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)的效率有關?？梢酝茰ybx7基因通過調控植物體內丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)的含量高低，進而決定植株抗蟲性的強弱[17-22]。該研究中，從玉米自交系Mo17中克隆出含有目標片段的序列長度為1 522 bp，它與玉米標準基因組數(shù)據(jù)庫中的參考序列相比，在序列長度上存在一定差異。與參考序列相比，目標序列在ORF內存在13處堿基突變，導致了蛋白質三級結構的改變；雖然來自Mo17 自交系的蛋白質分子量和總元素數(shù)量與參考蛋白有一定差異，其氨基酸序列中也存在7個氨基酸的差異，造成了蛋白質構成元素C、H、O、N 和S 組成以及蛋白質多肽鏈的正負電荷量以及親疏水特性等理化特性的略微變化。但通過與其他禾本科植物的同源性分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列一致性較高，說明bx7蛋白在禾本科植物中的功能較為保守。屬于dimerization 超級家族和AdoMet_MTases 超級家族。

對克隆基因所編碼的蛋白質親疏水性的分析表明，存在5個氨基酸的差異，其中，有2個氨基酸位于親水區(qū)，3個氨基酸位于疏水區(qū)，并且無跨膜結構。bx7基因存在于禾本科植物中，例如玉米、谷子、大麥等，當植物體受到外界侵害，該基因主要以TRIBOA-葡萄糖苷為底物使其轉化為丁布葡萄糖苷，而后去糖苷化生成丁布(DIMBOA)，最終使植物體產生能夠抵御外界侵害的有毒的苯并噁嗪類物質。該研究中，來自自交系Mo17分離出的目標片段有3個氨基酸的插入，2個氨基酸的丟失和突變，這對該基因的表達與對該酶的催化效率是否有影響，還需要進一步深入研究。