牛病毒性腹瀉病毒E0蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

王 煒，韓慧慧，丁乃崢，何成強

(山東師范大學生命科學學院，山東省動物抗性重點實驗室，濟南 250014)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)作為牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)的病原體，可引起牛腹瀉、胃腸道炎癥、呼吸系統(tǒng)疾病、生殖障礙等一系列臨床癥狀[1]，對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經濟損失[2]。在中國，BVD作為一種瘟疫性傳染病，被列為三類動物疫病中的牛病之一[3]。BVDV可以感染野生及家養(yǎng)動物[4]，尤其是被感染的妊娠母牛產下的持續(xù)性感染(persistent infection，PI)小牛，能不斷從鼻眼部分泌物及排泄物中排出具有傳染性的BVDV,這種持續(xù)性病毒來源，成為驅動BVDV流行的關鍵因素，使得BVDV的清除具有較高難度[5-6]。

BVDV屬于黃病毒科中的瘟病毒屬[7]，長度約12.3 kb，是正義RNA病毒，主要分BVDV-1和BVDV-2[8-9]。BVDV具有較高的流行率，牛群中抗體陽性率較高[10-11]。BVDV感染后，糖蛋白E2作為BVDV感染后免疫反應的主要目標之一，被廣泛應用于BVDV疫苗的研制[12-13]。但E2蛋白的突變率高，往往導致免疫的失敗[14-15]。BVDV的包膜蛋白E0(Erns)由約228個氨基酸組成，大小約26 ku，具有RNA酶活性，可降解BVDV RNA[16]，是瘟病毒編碼蛋白中保守性相對較高、參與病毒攝取細胞及感染性病毒粒子有效組裝的重要結構蛋白[17]，較E2抗原多樣性少，也是宿主抗體應答的主要靶標之一[18-19]。E0作為BVDV免疫原性蛋白具有很高的抗原保守性[20]，對于阻斷宿主對病毒感染的反應較為重要[21]，通過阻斷干擾素(IFN)的合成來頡頏宿主的先天免疫防御，從而建立長期感染[22]。針對BVDV E0的抗體能有效結合細胞及其培養(yǎng)物中的BVDV。目前，E0蛋白因其獨特的免疫學特點逐漸成為抗原蛋白免疫法制備相應抗體的候選抗原。

本研究通過PCR擴增E0基因，構建pET28a-E0原核表達載體，通過大腸桿菌表達系統(tǒng)誘導表達E0蛋白，采用親和層析純化E0蛋白，將其免疫小鼠收集血清制備BVDV E0多克隆抗體。然后通過Western blotting、細胞免疫熒光試驗、ELISA等試驗檢測多克隆抗體的特異性，為BVDV E0蛋白的結構和功能研究及BVDV的檢測提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

BVDV Singer_Arg株(GenBank登錄號：DQ088995.2)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞、乳倉鼠腎細胞系BHK-21、牛腎細胞系MDBK、BVDV感染性RNA表達載體pMC18-BVDV和pET-28a(+)均由山東師范大學生命科學學院動物生殖發(fā)育與疾病實驗室保存；6～8周齡ICR小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。

1.2 主要試劑

DMEM、PBS、FBS(VivaCell)均購自上海逍鵬生物科技有限公司；限制性內切酶、T4 DNA Ligase(2011A)均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；ApexHF HS DNA Polymerase FS MasterMix(AD12202)購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒12.5%(PG113)購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；His標簽鼠單克隆抗體(AB0002)、beta-Actin Antibody(AB0035)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG(AB0102)、HRP標記的羊抗兔IgG(AB0101)和Alexa熒光488標記的羊抗鼠IgG(AB0142)均購自泊灣生物科技有限公司；弗氏佐劑(F5881/F5506)購自上海懋康生物科技有限公司；Ni NTA beads(SA004100)購自常州天地人和生物科技有限公司；全自動倒置熒光顯微成像系統(tǒng)(型號DMi8)購自徠卡儀器有限公司；酶標儀(型號Spectra Max M5)購自Molecular Devices 美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成 根據BVDV Singer_Arg株(GenBank登錄號：DQ088995.2)的E0基因序列，利用DNAMAN軟件設計E0基因的上、下游引物：BVDV-E0-F：5′-CGGAATTCATAACACAGTGGAACCTACAAGAC-3′(下劃線處為EcoRⅠ識別位點)；BVDV-E0-R：5′-AATCTCGAGCTAGGGGGAAGCCGCGTAT-3′(下劃線處為XhoⅠ識別位點)，預期擴增片段大小為684 bp。引物由青島擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.3.2 原核表達載體pET28a-E0的構建 以實驗室保存的pMC18-BVDV質粒為模板，PCR擴增E0基因片段。PCR反應體系25 μL：ApexHF HS DNA Polymerase FS MasterMix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,滅菌ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性30 s，65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán);72 ℃延伸8 min;4 ℃保存。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的產物并純化，將E0片段和pET-28a(+)載體經EcoRⅠ和XhoⅠ 37 ℃水浴酶切2.5 h，然后使用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經菌落PCR篩選陽性克隆，提取重組質粒經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，由青島擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.3.3 原核表達載體pET28a-E0的誘導表達 將測序成功的pET28a-E0和pET-28a(+)轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，培養(yǎng)菌液D600 nm為0.6～0.8時，添加1 mmol/L的IPTG在37 ℃條件下誘導4 h，收集菌體進行12.5%的SDS-PAGE，經考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后觀察E0蛋白的表達情況。因重組質粒帶有His標簽，以His標簽鼠單克隆抗體為一抗，Western blotting檢測誘導蛋白。

1.3.4 可溶性分析 取誘導表達E0蛋白的pET28a-E0菌體，8 000 r/min離心10 min收集菌體沉淀，加入PBS重懸菌體沉淀，冰水浴條件下超聲破碎菌體：30 min，功率400 W，開4 s，關6 s，8 000 r/min離心2 min取上清和沉淀，通過12.5%的SDS-PAGE分析E0蛋白的可溶性。

1.3.5 E0蛋白的純化及鑒定 依據步驟1.3.3和1.3.4大量誘導pET28a-E0重組菌體，超聲破碎后離心收集沉淀，采用Ni NTA beads親和層析純化蛋白，經上柱結合、洗滌緩沖液洗滌雜蛋白、洗脫緩沖液洗脫目的蛋白等步驟純化E0蛋白，將純化后的E0蛋白處理后通過12.5%的SDS-PAGE分析蛋白純化情況。以His標簽鼠單克隆抗體(1∶2 000)為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，Western blotting檢測蛋白純化結果。

1.3.6 免疫小鼠 將純化的E0蛋白使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度后與弗氏佐劑等體積混合超聲乳化成油乳狀，背部皮下多點注射免疫4只6～8周齡ICR小鼠(50～100 μg/只)。免疫前鼠尾采血收集血清備用，每次免疫間隔2周進行。第1次使用弗氏完全佐劑，第2、3次免疫使用弗氏不完全佐劑，3次免疫后均采血收集血清備用。

1.3.7 BVDV E0多克隆抗體特異性檢測 將純化的E0蛋白與蛋白上樣緩沖液按4∶1的比例混合后沸水煮8 min，將其作為抗原通過Western blotting檢測BVDV E0多克隆抗體與E0蛋白的特異性結合。蛋白樣先經12.5%的SDS-PAGE分離，然后轉移至PVDF膜，將PVDF膜用封閉液封閉2 h，將4只小鼠的BVDV-E0多克隆抗體和免疫前血清以1∶1 000比例稀釋分別作為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗后以1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗后顯色并拍照。將pET28a-E0質粒轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，收集菌體細胞裂解提取蛋白，如上述處理后作為抗原，將BVDV-E0多克隆抗體和免疫前血清1∶1 000稀釋作為一抗，通過Western blotting檢測BVDV E0多克隆抗體的特異性。

1.3.8 BVDV檢測 將BHK-21細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長至75%時，將BVDV感染性RNA表達載體pMC18-BVDV轉染至BHK-21細胞，48 h后收集包裝的病毒上清并感染MDBK細胞，培養(yǎng)48 h后，收集細胞裂解提取蛋白，以制備的BVDV E0多克隆抗體(1∶1 000)為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠為二抗，Western blotting檢測BVDV感染性RNA表達載體pMC18-BVDV在BHK-21細胞內的表達和包裝病毒在MDBK細胞內的復制，其中試驗組和BHK-21/MDBK空白細胞陰性對照組分別做2個重復。通過細胞免疫熒光檢測多克隆抗體的應用效果，將MDBK細胞爬片并培養(yǎng)至貼壁狀態(tài)、將BVDV病毒液接種細胞，感染培養(yǎng)24 h，PBS清洗3次后用4%的多聚甲醛固定8 min，PBS清洗3次，透膜液37 ℃透膜30 min，PBS清洗3次后用5%的BSA室溫封閉1 h，然后將BVDV E0多克隆抗體稀釋400倍作為一抗，37 ℃孵育1 h，PBS再次清洗后以1∶200稀釋的 Alexa熒光488標記的羊抗鼠IgG為二抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，DAPI染核液染核5 min，最后PBS清洗3次后封片，然后鏡檢并拍照。通過雙抗夾心法ELISA檢測BVDV，將免疫前小鼠血清和BVDV E0多克隆抗體倍比稀釋后4 ℃過夜包被酶標板，PBST清洗3次后用10%的馬血清37 ℃封閉2 h，PBST清洗3次，然后滴加病毒感染復數(MOI)為0.1～0.5的BVDV病毒液，37 ℃孵育2 h，再次PBST清洗3次后加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，37 ℃孵育2 h，PBST清洗3次后每孔加入100 μL的TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，最后每孔加入100 μL終止液終止反應，用酶標儀測定D450 nm值并分析結果，以陽性血清D450 nm值/陰性血清D450 nm值(P/N值)>2的抗體稀釋度定義為抗血清效價。

1.3.9 BVDV E0多克隆抗體效價測定 通過ELISA法檢測4只小鼠的抗血清效價，將純化的E0蛋白稀釋至4 μg/mL后包被酶標板，用10%的馬血清37 ℃封閉2 h，TBST清洗3次后以4只小鼠免疫前血清(陰性對照)和BVDV E0多克隆抗體分別倍比稀釋為一抗，37 ℃孵育2 h，PBST清洗3次后，以1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，37 ℃孵育2 h，PBST清洗3次后每孔加入100 μL的TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，終止反應后用酶標儀測定D450 nm值并進行結果分析。

2 結 果

2.1 pET28a-E0載體的構建

使用EcoR Ⅰ和XhoⅠ對pET28a-E0重組質粒進行雙酶切鑒定(圖1)，在5 369和684 bp處出現(xiàn)與預期相符的載體條帶和目的條帶，經測序比對分析，原核表達載體pET28a-E0構建成功。

M，DL10000 DNA Marker；1，空載質粒雙酶切；2，pET28a-E0重組質粒；3，pET28a-E0重組質粒雙酶切M，DL10000 DNA Marker；1，Double digestion of empty vector plasmid；2，Recombinant plasmid pET28a-E0；3，Double digestion of recombinant plasmid pET28a-E0圖1 重組質粒的雙酶切鑒定Fig.1 Double digestion identification of recombinant plasmid

2.2 E0蛋白的表達、可溶性分析、純化及鑒定

通過12.5%的SDS-PAGE觀察發(fā)現(xiàn)，經1 mmol/L的IPTG在37 ℃條件下誘導的pET28a-E0重組質粒在26 ku處出現(xiàn)BVDV E0目的條帶，而pET-28a(+)空載質粒和未誘導的重組質粒處未出現(xiàn)(圖2A)?？扇苄苑治霭l(fā)現(xiàn)，E0蛋白主要存在于沉淀中，即其在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在(圖2A)。取誘導表達E0蛋白的pET28a-E0菌體，超聲破碎離心后通過Ni NTA breads親和層析純化目的蛋白，經12.5%的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)純化出雜蛋白較少、濃度較高的E0蛋白(圖2A)。以His標簽鼠單克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，經Western blotting檢測，誘導蛋白(圖2B)和純化蛋白(圖2C)在26 ku處均出現(xiàn)目的條帶，表明BVDV E0蛋白已成功誘導純化，且純化蛋白特異性良好，可用于后期免疫試驗。

2.3 BVDV E0多克隆抗體特異性檢測

如圖3所示，E0純化蛋白免疫前采集的4只小鼠血清(免疫前血清)均未能檢測出目的條帶(圖3A)，而E0純化蛋白免疫后采集的小鼠血清(BVDV E0多克隆抗體)則能特異性檢測出純化后的E0蛋白(圖3B)；免疫前血清在pET-28a(+)和pET28a-E0均未檢測出目的條帶(圖3C)。BVDV E0多克隆抗體在pET28a-E0檢測出目的條帶(圖3D)，而在pET-28a(+)未檢測出。證明BVDV E0多克隆抗體具有良好的免疫特異性，可特異性識別BVDV E0蛋白。

2.4 BVDV檢測

Western blotting檢測BVDV感染性RNA表達載體pMC18-BVDV在BHK-21細胞內的表達和包裝病毒在MDBK細胞內的復制，結果顯示均在26 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖4A和4B)，即為BVDV E0蛋白大小，證明該多克隆抗體可特異性識別細胞表達的E0蛋白。通過細胞免疫熒光檢測BVDV，結果如圖4C所示，E0多克隆抗體組出現(xiàn)熒光，而免疫前血清對照組未出現(xiàn)熒光，表明本試驗制備的多克隆抗體可用于BVDV的免疫熒光檢測。通過雙抗夾心法ELISA檢測BVDV，結果如圖4D所示，在1∶500至1∶32 000抗血清稀釋比范圍內，BVDV檢測均為陽性，且隨著稀釋比的升高，P/N值呈上升趨勢。以上結果表明，本試驗制備的BVDV E0多克隆抗體可特異性識別BVDV E0蛋白，用于BVDV的檢測。

①A，SDS-PAGE檢測誘導和純化蛋白；B、C，Western blotting檢測誘導和純化蛋白。②M，蛋白質分子質量標準；1，pET-28a(+)未經IPTG誘導；2，pET-28a(+)經IPTG誘導4 h；3，pET28a-E0未經IPTG誘導；4，pET28a-E0經IPTG誘導4 h；5，上清；6，沉淀；7，流出液；8，洗脫液；9，E0純化蛋白；10，E0誘導蛋白；11，E0純化蛋白①A，Detection of induced and purified proteins by SDS-PAGE；B and C，Detection of induced and purified proteins by Western blotting.②M，Protein Marker；1，pET-28a(+) was not induced by IPTG；2，pET-28a(+) was induced by IPTG for 4 h；3，pET28a-E0 was not induced by IPTG；4，pET28a-E0 was induced by IPTG for 4 h；5，Supernatant；6，Precipitation；7，Effluent；8，Eluent；9，E0 purified protein；10，E0 induced protein；11，E0 purified protein圖2 E0蛋白的表達、可溶性分析、純化及鑒定Fig.2 Expression,solubility analysis,purification and identification of E0 protein

①A、B，分別為免疫前血清和BVDV E0多克隆抗體作為一抗Western blotting檢測E0純化蛋白；C、D，分別為免疫前血清和BVDV E0多克隆抗體作為一抗Western blotting檢測大腸桿菌BL21表達的總蛋白。②M，蛋白質分子質量標準；1～4，耳標號A851、A852、A853、A795小鼠免疫前血清；5～8，耳標號A851、A852、A853、A795小鼠免疫后血清。9、11，pET-28a(+)誘導蛋白；10、12，pET28a-E0誘導蛋白①A and B，Pre-immune serum and BVDV E0 polyclonal antibody were used as primary antibodies to detect E0 purified protein by Western blotting，respectively；C and D，Pre-immune serum and BVDV E0 polyclonal antibody were used as primary antibodies to detect the total protein expressed by E.coli BL21 by Western blotting，respectively.②M，Protein Marker；1-4，Pre-immune serum of mice with ear number A851，A852，A853，A795;5-8，Post-immune serum of mice with ear number A851，A852，A853，A795；9 and 11,pET-28a(+) induced protein；10 and 12,pET28a-E0 induced protein圖3 BVDV E0多克隆抗體特異性檢測Fig.3 Specific detection of BVDV E0 polyclonal antibody

①A、B，Western blotting檢測BVDV E0分別在BHK-21和MDBK細胞中的表達；C，細胞免疫熒光檢測被BVDV感染的MDBK細胞(100×)；D，雙抗夾心法ELISA檢測BVDV。②M，蛋白質分子質量標準；1～3，轉染pMC18-BVDV質粒的BHK-21細胞；4，空白BHK-21細胞，5～7，包裝病毒感染的MDBK細胞；8，空白MDBK細胞①A and B，The expression of BVDV E0 in BHK-21 and MDBK cells by Western blotting；C，Cellular immunofluorescence detection of MDBK cells infected with BVDV (100×)；D，Detection of BVDV by double antibody sandwich ELISA.②M，Protein Marker；1-3，BHK-21 cells transfected with pMC18-BVDV plasmid；4，Blank BHK-21 cells; 5-7，MDBK cells infected with packaging virus；8，Blank MDBK cells圖4 BVDV E0多克隆抗體檢測BVDVFig.4 Detection of BVDV by BVDV E0 polyclonal antibody

2.5 BVDV E0多克隆抗體效價測定

利用ELISA法檢測制備的BVDV E0多克隆抗體的效價，如圖5所示，A851小鼠免疫后血清(BVDV E0多克隆抗體)以1∶64 000比例稀釋時P/N值仍在2倍以上，并且檢測發(fā)現(xiàn)4只免疫小鼠抗血清效價均高于1∶32 000。結果證明，本試驗制備的BVDV E0多克隆抗體效價較高。

圖5 BVDV E0多克隆抗體效價測定Fig.5 Titer determination of BVDV E0 polyclonal antibody

3 討 論

BVDV在世界范圍內被稱為感染反芻動物的非典型瘟病[23]，可引起牛慢性持續(xù)性感染和急性致死性疾病，死亡率較高[24]，對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失。因此快速準確的診斷方法是防控BVDV的關鍵。BVDV抗原ELISA和實時熒光定量PCR是檢測感染動物的兩種最可靠、最靈敏的方法，實時熒光定量PCR在轉錄水平檢測目的基因，涉及RNA合成過程，操作較復雜；ELISA作為蛋白的定量檢測，靈敏度高，操作方式靈活，是檢測BVDV最具成本效益的方法[25]。在準確檢測BVDV的基礎上，研發(fā)易于制備且高效價的檢測抗體尤為重要。BVDV疫苗和檢測抗體研究的主要靶點為E0和E2蛋白，BVDV的包膜蛋白E0作為宿主抗體應答的主要靶標之一，已逐漸成為抗原蛋白免疫法制備ELISA檢測等抗體的候選抗原蛋白[18-19]。BVDV E0蛋白是病毒顆粒的重要組成部分，表現(xiàn)出RNase活性，是BVDV毒力因子形成的關鍵[26]。E0蛋白通過長的兩性螺旋附著在膜上，屬于膜錨定的，但沒有跨膜肽[17]，因此在BVDV各結構蛋白中，E0蛋白具有較高的保守性[20]。E0蛋白大小約為26 ku，突變率低，結構穩(wěn)定，較易表達和純化，是ELISA檢測中理想的包被抗原蛋白。

目前原核表達系統(tǒng)廣泛應用于各類病原微生物蛋白的表達[27-28]，操作簡單且高效，多克隆抗體制備簡單、成本低、應用廣泛，已有BVDV E2等蛋白多克隆抗體的制備。但對于BVDV E0蛋白相關抗體的制備報道較少，因此，本研究選用BVDV E0蛋白，將其在原核表達系統(tǒng)中表達純化，免疫小鼠制備BVDV E0多克隆抗體。以純化的E0蛋白作為包被抗原，該多克隆抗體可用于BVDV的ELISA檢測，同時也可應用于組織及細胞培養(yǎng)中BVDV感染的檢測。BVDV E0多克隆抗體雖然沒有單克隆抗體的特異性好，但能與多株BVDV發(fā)生結合反應，在一定程度上克服了BVDV不同毒株之間抗原多樣性問題，檢測范圍更廣。

本研究首先利用PCR技術擴增出BVDVE0基因片段，將其克隆至pET-28a(+)載體，成功構建pET28a-E0原核表達載體，然后將pET28a-E0轉化至大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，并成功誘導表達E0蛋白，大小約26 ku，與制備兔抗BVDV E0多克隆抗體研究中[29]表達出大小約30 ku的BVDV E0蛋白的結果基本符合。經可溶性分析發(fā)現(xiàn)，BVDV E0蛋白主要以包涵體的形式存在。采用Ni NTA beads親和層析純化E0蛋白，并將純化的E0蛋白與弗氏佐劑混合乳化后免疫小鼠，結果表明，制備的BVDV E0多克隆抗體具有良好的免疫特異性，可用于Western blotting、免疫熒光試驗、ELISA等試驗檢測BVDV，為后期研制BVDV ELISA檢測試劑盒提供了抗體。并且在雙抗夾心法ELISA檢測BVDV時發(fā)現(xiàn)，BVDV MOI在0.2～0.4范圍內檢測效果較好，推測MOI=0.1時病毒粒子較少，而MOI=0.5時病毒粒子已經過飽和。值得注意的是，現(xiàn)如今中國的BVDV防控狀況仍十分艱巨，需要高效的疫苗免疫和有效的檢測抗體。本研究制備的BVDV E0多克隆抗體為BVDV的檢測奠定了基礎，但該多克隆抗體還未進行臨床應用，具體使用情況還需進一步研究。

4 結 論

本研究利用原核表達系統(tǒng)在37 ℃，1 mmol/L IPTG條件下成功誘導表達BVDV E0蛋白，純化蛋白免疫小鼠制備出BVDV E0多克隆抗體，該多克隆抗體能特異性識別BVDV及其在細胞內表達的E0蛋白，免疫特異性良好且效價較高，為研究BVDV E0蛋白的結構和功能及BVDV的檢測提供了抗體。