牛病毒性腹瀉病毒E0蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

王 煒，韓慧慧，丁乃崢，何成強(qiáng)

(山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省動(dòng)物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250014)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)作為牛病毒性腹瀉(bovine viral diarrhea，BVD)的病原體，可引起牛腹瀉、胃腸道炎癥、呼吸系統(tǒng)疾病、生殖障礙等一系列臨床癥狀[1]，對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在中國(guó)，BVD作為一種瘟疫性傳染病，被列為三類動(dòng)物疫病中的牛病之一[3]。BVDV可以感染野生及家養(yǎng)動(dòng)物[4]，尤其是被感染的妊娠母牛產(chǎn)下的持續(xù)性感染(persistent infection，PI)小牛，能不斷從鼻眼部分泌物及排泄物中排出具有傳染性的BVDV,這種持續(xù)性病毒來源，成為驅(qū)動(dòng)BVDV流行的關(guān)鍵因素，使得BVDV的清除具有較高難度[5-6]。

BVDV屬于黃病毒科中的瘟病毒屬[7]，長(zhǎng)度約12.3 kb，是正義RNA病毒，主要分BVDV-1和BVDV-2[8-9]。BVDV具有較高的流行率，牛群中抗體陽性率較高[10-11]。BVDV感染后，糖蛋白E2作為BVDV感染后免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)之一，被廣泛應(yīng)用于BVDV疫苗的研制[12-13]。但E2蛋白的突變率高，往往導(dǎo)致免疫的失敗[14-15]。BVDV的包膜蛋白E0(Erns)由約228個(gè)氨基酸組成，大小約26 ku，具有RNA酶活性，可降解BVDV RNA[16]，是瘟病毒編碼蛋白中保守性相對(duì)較高、參與病毒攝取細(xì)胞及感染性病毒粒子有效組裝的重要結(jié)構(gòu)蛋白[17]，較E2抗原多樣性少，也是宿主抗體應(yīng)答的主要靶標(biāo)之一[18-19]。E0作為BVDV免疫原性蛋白具有很高的抗原保守性[20]，對(duì)于阻斷宿主對(duì)病毒感染的反應(yīng)較為重要[21]，通過阻斷干擾素(IFN)的合成來頡頏宿主的先天免疫防御，從而建立長(zhǎng)期感染[22]。針對(duì)BVDV E0的抗體能有效結(jié)合細(xì)胞及其培養(yǎng)物中的BVDV。目前，E0蛋白因其獨(dú)特的免疫學(xué)特點(diǎn)逐漸成為抗原蛋白免疫法制備相應(yīng)抗體的候選抗原。

本研究通過PCR擴(kuò)增E0基因，構(gòu)建pET28a-E0原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)E0蛋白，采用親和層析純化E0蛋白，將其免疫小鼠收集血清制備BVDV E0多克隆抗體。然后通過Western blotting、細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)、ELISA等試驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體的特異性，為BVDV E0蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究及BVDV的檢測(cè)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

BVDV Singer_Arg株(GenBank登錄號(hào)：DQ088995.2)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK-21、牛腎細(xì)胞系MDBK、BVDV感染性RNA表達(dá)載體pMC18-BVDV和pET-28a(+)均由山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生殖發(fā)育與疾病實(shí)驗(yàn)室保存；6～8周齡ICR小鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 主要試劑

DMEM、PBS、FBS(VivaCell)均購(gòu)自上海逍鵬生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase(2011A)均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；ApexHF HS DNA Polymerase FS MasterMix(AD12202)購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒12.5%(PG113)購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；His標(biāo)簽鼠單克隆抗體(AB0002)、beta-Actin Antibody(AB0035)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(AB0102)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(AB0101)和Alexa熒光488標(biāo)記的羊抗鼠IgG(AB0142)均購(gòu)自泊灣生物科技有限公司；弗氏佐劑(F5881/F5506)購(gòu)自上海懋康生物科技有限公司；Ni NTA beads(SA004100)購(gòu)自常州天地人和生物科技有限公司；全自動(dòng)倒置熒光顯微成像系統(tǒng)(型號(hào)DMi8)購(gòu)自徠卡儀器有限公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)Spectra Max M5)購(gòu)自Molecular Devices 美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)BVDV Singer_Arg株(GenBank登錄號(hào)：DQ088995.2)的E0基因序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)E0基因的上、下游引物：BVDV-E0-F：5′-CGGAATTCATAACACAGTGGAACCTACAAGAC-3′(下劃線處為EcoRⅠ識(shí)別位點(diǎn))；BVDV-E0-R：5′-AATCTCGAGCTAGGGGGAAGCCGCGTAT-3′(下劃線處為XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn))，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為684 bp。引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 原核表達(dá)載體pET28a-E0的構(gòu)建 以實(shí)驗(yàn)室保存的pMC18-BVDV質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增E0基因片段。PCR反應(yīng)體系25 μL：ApexHF HS DNA Polymerase FS MasterMix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板1 μL,滅菌ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，65 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的產(chǎn)物并純化，將E0片段和pET-28a(+)載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ 37 ℃水浴酶切2.5 h，然后使用T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后，由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3.3 原核表達(dá)載體pET28a-E0的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序成功的pET28a-E0和pET-28a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)菌液D600 nm為0.6～0.8時(shí)，添加1 mmol/L的IPTG在37 ℃條件下誘導(dǎo)4 h，收集菌體進(jìn)行12.5%的SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色后觀察E0蛋白的表達(dá)情況。因重組質(zhì)粒帶有His標(biāo)簽，以His標(biāo)簽鼠單克隆抗體為一抗，Western blotting檢測(cè)誘導(dǎo)蛋白。

1.3.4 可溶性分析 取誘導(dǎo)表達(dá)E0蛋白的pET28a-E0菌體，8 000 r/min離心10 min收集菌體沉淀，加入PBS重懸菌體沉淀，冰水浴條件下超聲破碎菌體：30 min，功率400 W，開4 s，關(guān)6 s，8 000 r/min離心2 min取上清和沉淀，通過12.5%的SDS-PAGE分析E0蛋白的可溶性。

1.3.5 E0蛋白的純化及鑒定 依據(jù)步驟1.3.3和1.3.4大量誘導(dǎo)pET28a-E0重組菌體，超聲破碎后離心收集沉淀，采用Ni NTA beads親和層析純化蛋白，經(jīng)上柱結(jié)合、洗滌緩沖液洗滌雜蛋白、洗脫緩沖液洗脫目的蛋白等步驟純化E0蛋白，將純化后的E0蛋白處理后通過12.5%的SDS-PAGE分析蛋白純化情況。以His標(biāo)簽鼠單克隆抗體(1∶2 000)為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，Western blotting檢測(cè)蛋白純化結(jié)果。

1.3.6 免疫小鼠 將純化的E0蛋白使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度后與弗氏佐劑等體積混合超聲乳化成油乳狀，背部皮下多點(diǎn)注射免疫4只6～8周齡ICR小鼠(50～100 μg/只)。免疫前鼠尾采血收集血清備用，每次免疫間隔2周進(jìn)行。第1次使用弗氏完全佐劑，第2、3次免疫使用弗氏不完全佐劑，3次免疫后均采血收集血清備用。

1.3.7 BVDV E0多克隆抗體特異性檢測(cè) 將純化的E0蛋白與蛋白上樣緩沖液按4∶1的比例混合后沸水煮8 min，將其作為抗原通過Western blotting檢測(cè)BVDV E0多克隆抗體與E0蛋白的特異性結(jié)合。蛋白樣先經(jīng)12.5%的SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜用封閉液封閉2 h，將4只小鼠的BVDV-E0多克隆抗體和免疫前血清以1∶1 000比例稀釋分別作為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST清洗后以1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗后顯色并拍照。將pET28a-E0質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，收集菌體細(xì)胞裂解提取蛋白，如上述處理后作為抗原，將BVDV-E0多克隆抗體和免疫前血清1∶1 000稀釋作為一抗，通過Western blotting檢測(cè)BVDV E0多克隆抗體的特異性。

1.3.8 BVDV檢測(cè) 將BHK-21細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)至75%時(shí)，將BVDV感染性RNA表達(dá)載體pMC18-BVDV轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，48 h后收集包裝的病毒上清并感染MDBK細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞裂解提取蛋白，以制備的BVDV E0多克隆抗體(1∶1 000)為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠為二抗，Western blotting檢測(cè)BVDV感染性RNA表達(dá)載體pMC18-BVDV在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和包裝病毒在MDBK細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，其中試驗(yàn)組和BHK-21/MDBK空白細(xì)胞陰性對(duì)照組分別做2個(gè)重復(fù)。通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)多克隆抗體的應(yīng)用效果，將MDBK細(xì)胞爬片并培養(yǎng)至貼壁狀態(tài)、將BVDV病毒液接種細(xì)胞，感染培養(yǎng)24 h，PBS清洗3次后用4%的多聚甲醛固定8 min，PBS清洗3次，透膜液37 ℃透膜30 min，PBS清洗3次后用5%的BSA室溫封閉1 h，然后將BVDV E0多克隆抗體稀釋400倍作為一抗，37 ℃孵育1 h，PBS再次清洗后以1∶200稀釋的 Alexa熒光488標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，DAPI染核液染核5 min，最后PBS清洗3次后封片，然后鏡檢并拍照。通過雙抗夾心法ELISA檢測(cè)BVDV，將免疫前小鼠血清和BVDV E0多克隆抗體倍比稀釋后4 ℃過夜包被酶標(biāo)板，PBST清洗3次后用10%的馬血清37 ℃封閉2 h，PBST清洗3次，然后滴加病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1～0.5的BVDV病毒液，37 ℃孵育2 h，再次PBST清洗3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，37 ℃孵育2 h，PBST清洗3次后每孔加入100 μL的TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，最后每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值并分析結(jié)果，以陽性血清D450 nm值/陰性血清D450 nm值(P/N值)>2的抗體稀釋度定義為抗血清效價(jià)。

1.3.9 BVDV E0多克隆抗體效價(jià)測(cè)定 通過ELISA法檢測(cè)4只小鼠的抗血清效價(jià)，將純化的E0蛋白稀釋至4 μg/mL后包被酶標(biāo)板，用10%的馬血清37 ℃封閉2 h，TBST清洗3次后以4只小鼠免疫前血清(陰性對(duì)照)和BVDV E0多克隆抗體分別倍比稀釋為一抗，37 ℃孵育2 h，PBST清洗3次后，以1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，37 ℃孵育2 h，PBST清洗3次后每孔加入100 μL的TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值并進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié) 果

2.1 pET28a-E0載體的構(gòu)建

使用EcoR Ⅰ和XhoⅠ對(duì)pET28a-E0重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定(圖1)，在5 369和684 bp處出現(xiàn)與預(yù)期相符的載體條帶和目的條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析，原核表達(dá)載體pET28a-E0構(gòu)建成功。

M，DL10000 DNA Marker；1，空載質(zhì)粒雙酶切；2，pET28a-E0重組質(zhì)粒；3，pET28a-E0重組質(zhì)粒雙酶切M，DL10000 DNA Marker；1，Double digestion of empty vector plasmid；2，Recombinant plasmid pET28a-E0；3，Double digestion of recombinant plasmid pET28a-E0圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Double digestion identification of recombinant plasmid

2.2 E0蛋白的表達(dá)、可溶性分析、純化及鑒定

通過12.5%的SDS-PAGE觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1 mmol/L的IPTG在37 ℃條件下誘導(dǎo)的pET28a-E0重組質(zhì)粒在26 ku處出現(xiàn)BVDV E0目的條帶，而pET-28a(+)空載質(zhì)粒和未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒處未出現(xiàn)(圖2A)?？扇苄苑治霭l(fā)現(xiàn)，E0蛋白主要存在于沉淀中，即其在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在(圖2A)。取誘導(dǎo)表達(dá)E0蛋白的pET28a-E0菌體，超聲破碎離心后通過Ni NTA breads親和層析純化目的蛋白，經(jīng)12.5%的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)純化出雜蛋白較少、濃度較高的E0蛋白(圖2A)。以His標(biāo)簽鼠單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，經(jīng)Western blotting檢測(cè)，誘導(dǎo)蛋白(圖2B)和純化蛋白(圖2C)在26 ku處均出現(xiàn)目的條帶，表明BVDV E0蛋白已成功誘導(dǎo)純化，且純化蛋白特異性良好，可用于后期免疫試驗(yàn)。

2.3 BVDV E0多克隆抗體特異性檢測(cè)

如圖3所示，E0純化蛋白免疫前采集的4只小鼠血清(免疫前血清)均未能檢測(cè)出目的條帶(圖3A)，而E0純化蛋白免疫后采集的小鼠血清(BVDV E0多克隆抗體)則能特異性檢測(cè)出純化后的E0蛋白(圖3B)；免疫前血清在pET-28a(+)和pET28a-E0均未檢測(cè)出目的條帶(圖3C)。BVDV E0多克隆抗體在pET28a-E0檢測(cè)出目的條帶(圖3D)，而在pET-28a(+)未檢測(cè)出。證明BVDV E0多克隆抗體具有良好的免疫特異性，可特異性識(shí)別BVDV E0蛋白。

2.4 BVDV檢測(cè)

Western blotting檢測(cè)BVDV感染性RNA表達(dá)載體pMC18-BVDV在BHK-21細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和包裝病毒在MDBK細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，結(jié)果顯示均在26 ku處出現(xiàn)目的條帶(圖4A和4B)，即為BVDV E0蛋白大小，證明該多克隆抗體可特異性識(shí)別細(xì)胞表達(dá)的E0蛋白。通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)BVDV，結(jié)果如圖4C所示，E0多克隆抗體組出現(xiàn)熒光，而免疫前血清對(duì)照組未出現(xiàn)熒光，表明本試驗(yàn)制備的多克隆抗體可用于BVDV的免疫熒光檢測(cè)。通過雙抗夾心法ELISA檢測(cè)BVDV，結(jié)果如圖4D所示，在1∶500至1∶32 000抗血清稀釋比范圍內(nèi)，BVDV檢測(cè)均為陽性，且隨著稀釋比的升高，P/N值呈上升趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備的BVDV E0多克隆抗體可特異性識(shí)別BVDV E0蛋白，用于BVDV的檢測(cè)。

①A，SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)和純化蛋白；B、C，Western blotting檢測(cè)誘導(dǎo)和純化蛋白。②M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，pET-28a(+)未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2，pET-28a(+)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h；3，pET28a-E0未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；4，pET28a-E0經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h；5，上清；6，沉淀；7，流出液；8，洗脫液；9，E0純化蛋白；10，E0誘導(dǎo)蛋白；11，E0純化蛋白①A，Detection of induced and purified proteins by SDS-PAGE；B and C，Detection of induced and purified proteins by Western blotting.②M，Protein Marker；1，pET-28a(+) was not induced by IPTG；2，pET-28a(+) was induced by IPTG for 4 h；3，pET28a-E0 was not induced by IPTG；4，pET28a-E0 was induced by IPTG for 4 h；5，Supernatant；6，Precipitation；7，Effluent；8，Eluent；9，E0 purified protein；10，E0 induced protein；11，E0 purified protein圖2 E0蛋白的表達(dá)、可溶性分析、純化及鑒定Fig.2 Expression,solubility analysis,purification and identification of E0 protein

①A、B，分別為免疫前血清和BVDV E0多克隆抗體作為一抗Western blotting檢測(cè)E0純化蛋白；C、D，分別為免疫前血清和BVDV E0多克隆抗體作為一抗Western blotting檢測(cè)大腸桿菌BL21表達(dá)的總蛋白。②M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4，耳標(biāo)號(hào)A851、A852、A853、A795小鼠免疫前血清；5～8，耳標(biāo)號(hào)A851、A852、A853、A795小鼠免疫后血清。9、11，pET-28a(+)誘導(dǎo)蛋白；10、12，pET28a-E0誘導(dǎo)蛋白①A and B，Pre-immune serum and BVDV E0 polyclonal antibody were used as primary antibodies to detect E0 purified protein by Western blotting，respectively；C and D，Pre-immune serum and BVDV E0 polyclonal antibody were used as primary antibodies to detect the total protein expressed by E.coli BL21 by Western blotting，respectively.②M，Protein Marker；1-4，Pre-immune serum of mice with ear number A851，A852，A853，A795;5-8，Post-immune serum of mice with ear number A851，A852，A853，A795；9 and 11,pET-28a(+) induced protein；10 and 12,pET28a-E0 induced protein圖3 BVDV E0多克隆抗體特異性檢測(cè)Fig.3 Specific detection of BVDV E0 polyclonal antibody

①A、B，Western blotting檢測(cè)BVDV E0分別在BHK-21和MDBK細(xì)胞中的表達(dá)；C，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)被BVDV感染的MDBK細(xì)胞(100×)；D，雙抗夾心法ELISA檢測(cè)BVDV。②M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3，轉(zhuǎn)染pMC18-BVDV質(zhì)粒的BHK-21細(xì)胞；4，空白BHK-21細(xì)胞，5～7，包裝病毒感染的MDBK細(xì)胞；8，空白MDBK細(xì)胞①A and B，The expression of BVDV E0 in BHK-21 and MDBK cells by Western blotting；C，Cellular immunofluorescence detection of MDBK cells infected with BVDV (100×)；D，Detection of BVDV by double antibody sandwich ELISA.②M，Protein Marker；1-3，BHK-21 cells transfected with pMC18-BVDV plasmid；4，Blank BHK-21 cells; 5-7，MDBK cells infected with packaging virus；8，Blank MDBK cells圖4 BVDV E0多克隆抗體檢測(cè)BVDVFig.4 Detection of BVDV by BVDV E0 polyclonal antibody

2.5 BVDV E0多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

利用ELISA法檢測(cè)制備的BVDV E0多克隆抗體的效價(jià)，如圖5所示，A851小鼠免疫后血清(BVDV E0多克隆抗體)以1∶64 000比例稀釋時(shí)P/N值仍在2倍以上，并且檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4只免疫小鼠抗血清效價(jià)均高于1∶32 000。結(jié)果證明，本試驗(yàn)制備的BVDV E0多克隆抗體效價(jià)較高。

圖5 BVDV E0多克隆抗體效價(jià)測(cè)定Fig.5 Titer determination of BVDV E0 polyclonal antibody

3 討 論

BVDV在世界范圍內(nèi)被稱為感染反芻動(dòng)物的非典型瘟病[23]，可引起牛慢性持續(xù)性感染和急性致死性疾病，死亡率較高[24]，對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此快速準(zhǔn)確的診斷方法是防控BVDV的關(guān)鍵。BVDV抗原ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR是檢測(cè)感染動(dòng)物的兩種最可靠、最靈敏的方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)目的基因，涉及RNA合成過程，操作較復(fù)雜；ELISA作為蛋白的定量檢測(cè)，靈敏度高，操作方式靈活，是檢測(cè)BVDV最具成本效益的方法[25]。在準(zhǔn)確檢測(cè)BVDV的基礎(chǔ)上，研發(fā)易于制備且高效價(jià)的檢測(cè)抗體尤為重要。BVDV疫苗和檢測(cè)抗體研究的主要靶點(diǎn)為E0和E2蛋白，BVDV的包膜蛋白E0作為宿主抗體應(yīng)答的主要靶標(biāo)之一，已逐漸成為抗原蛋白免疫法制備ELISA檢測(cè)等抗體的候選抗原蛋白[18-19]。BVDV E0蛋白是病毒顆粒的重要組成部分，表現(xiàn)出RNase活性，是BVDV毒力因子形成的關(guān)鍵[26]。E0蛋白通過長(zhǎng)的兩性螺旋附著在膜上，屬于膜錨定的，但沒有跨膜肽[17]，因此在BVDV各結(jié)構(gòu)蛋白中，E0蛋白具有較高的保守性[20]。E0蛋白大小約為26 ku，突變率低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，較易表達(dá)和純化，是ELISA檢測(cè)中理想的包被抗原蛋白。

目前原核表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各類病原微生物蛋白的表達(dá)[27-28]，操作簡(jiǎn)單且高效，多克隆抗體制備簡(jiǎn)單、成本低、應(yīng)用廣泛，已有BVDV E2等蛋白多克隆抗體的制備。但對(duì)于BVDV E0蛋白相關(guān)抗體的制備報(bào)道較少，因此，本研究選用BVDV E0蛋白，將其在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)純化，免疫小鼠制備BVDV E0多克隆抗體。以純化的E0蛋白作為包被抗原，該多克隆抗體可用于BVDV的ELISA檢測(cè)，同時(shí)也可應(yīng)用于組織及細(xì)胞培養(yǎng)中BVDV感染的檢測(cè)。BVDV E0多克隆抗體雖然沒有單克隆抗體的特異性好，但能與多株BVDV發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，在一定程度上克服了BVDV不同毒株之間抗原多樣性問題，檢測(cè)范圍更廣。

本研究首先利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出BVDVE0基因片段，將其克隆至pET-28a(+)載體，成功構(gòu)建pET28a-E0原核表達(dá)載體，然后將pET28a-E0轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，并成功誘導(dǎo)表達(dá)E0蛋白，大小約26 ku，與制備兔抗BVDV E0多克隆抗體研究中[29]表達(dá)出大小約30 ku的BVDV E0蛋白的結(jié)果基本符合。經(jīng)可溶性分析發(fā)現(xiàn)，BVDV E0蛋白主要以包涵體的形式存在。采用Ni NTA beads親和層析純化E0蛋白，并將純化的E0蛋白與弗氏佐劑混合乳化后免疫小鼠，結(jié)果表明，制備的BVDV E0多克隆抗體具有良好的免疫特異性，可用于Western blotting、免疫熒光試驗(yàn)、ELISA等試驗(yàn)檢測(cè)BVDV，為后期研制BVDV ELISA檢測(cè)試劑盒提供了抗體。并且在雙抗夾心法ELISA檢測(cè)BVDV時(shí)發(fā)現(xiàn)，BVDV MOI在0.2～0.4范圍內(nèi)檢測(cè)效果較好，推測(cè)MOI=0.1時(shí)病毒粒子較少，而MOI=0.5時(shí)病毒粒子已經(jīng)過飽和。值得注意的是，現(xiàn)如今中國(guó)的BVDV防控狀況仍十分艱巨，需要高效的疫苗免疫和有效的檢測(cè)抗體。本研究制備的BVDV E0多克隆抗體為BVDV的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，但該多克隆抗體還未進(jìn)行臨床應(yīng)用，具體使用情況還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)在37 ℃，1 mmol/L IPTG條件下成功誘導(dǎo)表達(dá)BVDV E0蛋白，純化蛋白免疫小鼠制備出BVDV E0多克隆抗體，該多克隆抗體能特異性識(shí)別BVDV及其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的E0蛋白，免疫特異性良好且效價(jià)較高，為研究BVDV E0蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及BVDV的檢測(cè)提供了抗體。