熊陳勇,尹彥文,施開(kāi)創(chuàng),李 軍,鄭 敏,韋顯凱,馮淑萍,龍 鳳,屈素潔,陸文俊,周洪槿,黃海蓮,謝守玉,黎宗強(qiáng)
(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530005;2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,南寧 530001;3.隆安縣城廂鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站,南寧 532799)
坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)于1955年首次在馬來(lái)西亞庫(kù)蚊體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1],感染宿主譜廣泛,鴨、鵝、雞、麻雀、蚊蟲(chóng)等均能被感染[2]。2010年,中國(guó)福建、浙江、江蘇等地的蛋種鴨場(chǎng)突發(fā)新疫情,以蛋鴨產(chǎn)蛋驟降、卵巢出血性壞死、甚至死亡為主要特征[3-5],后經(jīng)證實(shí)致病原為鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)[6],發(fā)病率高達(dá)90%,病死率為5%~10%[7],目前中國(guó)多地均有發(fā)病的報(bào)道[8-9],給中國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。
DTMUV是屬于黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約11 kb,包括5′-及3′-非編碼區(qū)(UTR)和1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。ORF編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白,分別為核衣殼蛋白C、膜蛋白prM和囊膜糖蛋白E;7種非結(jié)構(gòu)蛋白,分別為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[10-11]。E蛋白是病毒粒子表面主要結(jié)構(gòu)蛋白,也是中和抗體的靶向蛋白,參與調(diào)節(jié)病毒受體結(jié)合、宿主范圍及毒力關(guān)鍵因子等重要過(guò)程[12]。NS5蛋白是黃病毒中最大的非結(jié)構(gòu)蛋白,且不同病毒間最為保守,相關(guān)研究表明,NS5蛋白能抑制干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,進(jìn)而阻礙天然免疫反應(yīng)[13]。因此,E和NS5基因是DTMUV分子流行病學(xué)研究、病原學(xué)診斷及研發(fā)疫苗和藥物的理想靶標(biāo)。
廣西地處候鳥(niǎo)遷徙過(guò)冬的沿海區(qū)域,毗鄰東南亞國(guó)家的邊境口岸,同時(shí)也是中國(guó)的養(yǎng)鴨大省。為進(jìn)一步了解近年來(lái)DTMUV廣西毒株的流行情況及遺傳進(jìn)化特征,本研究對(duì)2019-2021年采集自廣西各地的病死鴨組織進(jìn)行DTMUV檢測(cè),并根據(jù)毒株檢測(cè)年份及來(lái)源地選擇部分陽(yáng)性樣品開(kāi)展全基因組測(cè)序和序列分析,以期了解并掌握DTMUV廣西毒株的遺傳變異新特點(diǎn),為有效防控DTMUV感染提供參考數(shù)據(jù)。
核酸提取試劑盒購(gòu)自蘇州天隆生物科技有限公司;PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×TaqPCR MasterMix試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。
病料來(lái)自2019-2021年廣西各地養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢的臨床病死鴨,采集肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、心臟、氣管和腦等組織樣品,置于含有適量PBS溶液的滅菌離心管中,經(jīng)組織磨碎儀研磨至糜狀,離心取上清提取總RNA,采用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室已建立的DTMUV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)[14]。
廣西養(yǎng)鴨主產(chǎn)區(qū)集中于桂東、南及東南,根據(jù)毒株檢測(cè)年份及來(lái)源地,選取2019年北海、鐘山,2020年鐘山、上思、欽州,2021年蒙圩、白沙、下灣(均屬于貴港市)各1份共計(jì)8份經(jīng)檢測(cè)為陽(yáng)性的病料cDNA為模板(表1),根據(jù)DTMUV參考株序列(GenBank登錄號(hào):KC990542),應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物(表2)進(jìn)行DTMUV全序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL:2×Gflex PCR Buffer (Mg2+,dNTP plus) 25 μL,上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL,TksGflex DNA Polymerase 1 μL,cDNA 5 μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性10 s,50 ℃退火15 s,68 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán);68 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),目的條帶使用膠回收試劑盒回收純化,連接至pMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,每個(gè)重組子挑取3個(gè)陽(yáng)性菌落送測(cè)序。對(duì)測(cè)序所獲片段進(jìn)行拼接,獲得DTMUV基因組全序列。
表1 DTMUV廣西毒株信息
應(yīng)用BioEdit軟件對(duì)廣西毒株及參考毒株(表3)進(jìn)行序列比對(duì)和相似性分析。使用Mega 7.0軟件計(jì)算ORF及E、NS5基因最佳核苷酸替換模型為GTR+G+I、TN93+G、GTR+G+I。應(yīng)用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在線(xiàn)軟件(http:∥tools.immuneepitope.org/bcell/)預(yù)測(cè)E蛋白潛在的B細(xì)胞抗原表位;應(yīng)用NetNGlyc 1.0在線(xiàn)軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)預(yù)測(cè)E蛋白N-糖基化位點(diǎn)。以最佳核苷酸替換模型為基礎(chǔ),采用最大似然法(maximum likelihood)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),Bootstrap值定義為1 000次。應(yīng)用RDP 5(recombination detection program 5)和SimPlot v 3.5.1軟件對(duì)廣西毒株及參考毒株全序列進(jìn)行重組分析。應(yīng)用BEAST v 1.10.4軟件對(duì)E、NS5基因估算遺傳進(jìn)化速率及最近共同祖先時(shí)間(the most recent common ancestor,tMRCA)。
表2 用于擴(kuò)增DTMUV全基因序列的引物
續(xù)表
表3 DTMUV參考毒株
續(xù)表
以選取的8份DTMUV陽(yáng)性病料cDNA為模板,利用設(shè)計(jì)的特異性引物分段擴(kuò)增DTMUV全序列,結(jié)果顯示,擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(圖1)。經(jīng)測(cè)序、拼接得到8株DTMUV全序列,大小均為10 992 bp。經(jīng)E蛋白氨基酸序列比對(duì)表明,8株均為DTMUV野毒株,分別命名為:GXZS01-2019、GXBH01-2019、GXSS01-2020、GXZS02-2020、GXQZ01-2020、GXMW01-2021、GXXW01-2021及GXBS01-2021,為廣西毒株。
1~8,P1~P8片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M,DL5000 DNA Marker1-8,PCR amplification products of P1-P8 segments,respectively;M,DL5000 DNA Marker圖1 DTMUV全序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of DTMUV genome sequence
相似性比對(duì)析結(jié)果顯示,廣西毒株之間ORF及E、NS5基因核苷酸與氨基酸序列相似性分別為97.9%~99.8%和99.1%~99.9%、97.0%~99.9%和99.0%~100%、97.8%~99.9%和99.3%~99.9%(表4);與國(guó)內(nèi)外參考毒株的序列相似性分別為86.4%~99.3%和96.0%~99.8%、85.8%~99.5%和94.8%~100%、87.1%~99.2%和97.5%~99.9%(表5)。其中,與水禽源TMUV的相似性分別為89.2%~99.2%和96.0%~99.8%、89.1%~99.5%和94.8%~100%、89.7%~99.2%和97.5%~99.9%;與雞源TMUV的相似性分別為86.7%~96.5%和96.1%~99.2%、86.5%~96.5%和96.2%~98.8%、87.3%~96.8%和97.6%~99.6%;與其他宿主源TMUV的相似性分別為86.4%~96.5%和96.0%~99.4%、85.8%~96.7%和96.2%~99.4%、87.1%~96.8%和97.6%~99.7%。表明DTMUV廣西毒株間相似性較高,與水禽源TMUV相似性高于其他宿主源。
應(yīng)用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)廣西毒株的E蛋白B細(xì)胞抗原表位,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)16個(gè)潛在抗原表位,其中第157位的丙氨酸抗原相關(guān)指數(shù)最高。應(yīng)用NetNGlyc 1.0在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)糖基化位點(diǎn),為154位氨基酸NYSA序列。E蛋白氨基酸序列比對(duì)顯示,與疫苗株FX2010相比,廣西毒株共有11處位點(diǎn)發(fā)生變異,第38、122及277位氨基酸處為不同毒株普遍發(fā)生變異;第43、150、153、326、403、464及487位氨基酸處為部分DTMUV廣西毒株特有的突變,而GXBH01-2019株在第280位氨基酸處出現(xiàn)缺失(表6)。表明廣西毒株E蛋白既有共性又存在獨(dú)特的氨基酸突變,但均未涉及抗原表位與糖基化位點(diǎn)。
表4 廣西毒株之間ORF及E、NS5基因序列相似性比對(duì)
表5 廣西毒株與參考毒株ORF及E、NS5基因序列相似性比對(duì)
表6 廣西毒株與疫苗株E蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果
基于ORF及E、NS5基因核苷酸序列對(duì)廣西毒株與國(guó)內(nèi)外參考毒株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示,ORF及E、NS5基因均可分為1、2、3及TMUV群(圖2~4)。分布1群的毒株為來(lái)自泰國(guó)的DK/TH/CU-DTMUV2007株;分布2群的毒株來(lái)自中國(guó)、泰國(guó),其中2群又劃分為2.1和2.2亞群,廣西毒株(圖2~4中標(biāo)注▲的毒株)均集中于2.1亞群,廣西的GX2013E株也屬于該群,而廣西的GX2011、GX2015株則屬于2.2亞群,表明DTMUV廣西流行毒株進(jìn)化趨勢(shì)不完全一致;分布3群的為山東SD14株;蚊蟲(chóng)源及雞源TMUV毒株組成TMUV群。廣西毒株GXZS01-2019、GXZS02-2020、GXBH01-2019與CHN-JL株遺傳關(guān)系較近,而其他廣西毒株與AQ-19、H株遺傳關(guān)系較近,與相似性比對(duì)結(jié)果一致。基于E、NS5基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與ORF相似。
圖2 基于DTMUV ORF核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis based on ORF nucleotide sequences of DTMUV
圖3 基于DTMUV E基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis based on E gene nucleotide sequences of DTMUV
應(yīng)用RDP5和SimPlot軟件對(duì)廣西毒株和參考毒株全序列進(jìn)行重組分析,結(jié)果顯示,ziYY150901、HB2016、GXBH01-2019及GXZS02-2020株均有重組信號(hào)(圖5),其中,ziYY150901株重組的主要親本為ZJ201506株,相似性為99.7%,次要親本為SDHS株,相似性為99.5%;HB2016株重組的主要親本為ZJ201506株,相似性為99.5%,次要親本為GX2015株,相似性為100%;GXBH01-2019株重組的主要親本為GXZS01-2019株,相似性為99.8%,次要親本為GXXW01-2021株,相似性為99.9%;GXZS02-2020株重組的主要親本為GXZS01-2019株,相似性為99.8%,次要親本為GXQZ01-2020株,相似性為99.8%。
圖4 基于DTMUV NS5基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis based on NS5 gene nucleotide sequences of DTMUV
應(yīng)用BEAST v 1.10.4軟件,采用貝葉斯聚結(jié)分析方法,對(duì)廣西毒株與國(guó)內(nèi)外參考毒株的E、NS5基因估算遺傳進(jìn)化速率與tMRCA,結(jié)果顯示,E、NS5基因的遺傳進(jìn)化速率分別為1.31×10-3和1.30×10-3替換/(位點(diǎn)·年);tMRCA分別為88.90和88.91年(表7)。表明E、NS5基因的進(jìn)化速率相近,二者進(jìn)化比較同步。
A~D,ziYY150901、HB2016、GXBH01-2019和GXZS02-2020株;1,主要親本;2,次要親本A-D,ziYY150901,HB2016,GXBH01-2019 and GXZS02-2020 strains,respectively;1,Major parent;2,Minor parent圖5 廣西毒株與參考毒株全序列重組分析Fig.5 Recombination analysis of complete genome of DTMUV between Guangxi and reference strains
表7 DTMUV E、NS5基因遺傳進(jìn)化速率和tMRCA估算
廣西地處亞熱帶氣候,與東南亞國(guó)家接壤,同時(shí)也是候鳥(niǎo)遷徙過(guò)冬地區(qū)。TMUV宿主譜廣泛,除感染鴨、鵝、雞等家禽外,也能感染麻雀、鴿子等鳥(niǎo)類(lèi)及蚊蟲(chóng)[15-16],而鳥(niǎo)類(lèi)、蚊蟲(chóng)作為T(mén)MUV傳播媒介,存在散播病毒及與沿海地區(qū)養(yǎng)殖的水禽交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。另外,有報(bào)道稱(chēng),養(yǎng)鴨場(chǎng)從業(yè)人員的DTMUV血清陽(yáng)性檢出率超過(guò)70%,可能引發(fā)公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[17-18]。本研究采集2019-2021年廣西各地病死鴨的肝臟、脾臟、腎臟、卵巢等組織病料,利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)顯示,DTMUV與DuCV陽(yáng)性檢出率較高。推測(cè)可能的原因有兩方面:一是由于DuCV等病原體引起機(jī)體免疫抑制,從而導(dǎo)致DTMUV疫苗接種效果不佳,達(dá)不到預(yù)期的保護(hù)作用;二是田間DTMUV流行毒株可能發(fā)生變異,疫苗株交叉保護(hù)力下降。因此,為進(jìn)一步了解近年來(lái)DTMUV廣西毒株遺傳分子特征,本研究根據(jù)毒株檢測(cè)年限及來(lái)源地,從廣西養(yǎng)鴨主產(chǎn)區(qū)送檢病料中選取8份陽(yáng)性提取總RNA,利用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增DTMUV全序列,并進(jìn)行遺傳多樣性分析。
相似性比對(duì)結(jié)果顯示,與8株廣西毒株ORF相似性最高的分別為H株(5/8)、CHN-JL株(2/8)及AQ-19株(1/8),在遺傳距離上也得出同樣的結(jié)論,其中,H株為Feng等[19]2019年從3周齡的金定鴨體內(nèi)分離到的隸屬2.1亞群強(qiáng)毒株。廣西毒株之間ORF核苷酸序列相似性最高達(dá)99.8%,與參考毒株的核苷酸序列相似性最高達(dá)99.3%,其中,與廣西GX2011、GX2013E及GX2015株的ORF核苷酸序列相似性分別為95.9%~96.2%、96.8%~97.0%及95.6%~95.9%,而E、NS5基因的相似性和ORF相當(dāng),表明廣西毒株之間相似性較高。農(nóng)海連[20]分離的4株廣西DTMUV毒株與參考毒株的核苷酸序列相似性高于96%,氨基酸序列相似性高于98%;李剛[21]分離的山東DTMUV毒株與2010-2012年分離株的ORF氨基酸序列相似性為96.8%~98.6%,與2017年分離株的氨基酸序列相似性為98%以上;劉烈發(fā)等[22]從江西省某蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)分離到1株DTMUV,與參考毒株核苷酸序列相似性在98.5%以上。表明國(guó)內(nèi)毒株之間相似性普遍較高,遺傳變異程度小,與本研究結(jié)果相似。
經(jīng)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè),E蛋白共有16個(gè)B細(xì)胞抗原表位及1個(gè)N-糖基化位點(diǎn),為E蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)。E蛋白是DTMUV重要的抗原結(jié)構(gòu)蛋白,可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答,使機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體,在宿主的免疫壓力下,E蛋白將會(huì)發(fā)生遺傳變異[23]。據(jù)報(bào)道,E蛋白第156位氨基酸突變會(huì)破壞第154位氨基酸處的糖基化位點(diǎn),進(jìn)而影響DTMUV的復(fù)制和傳播[24]。E蛋白氨基酸序列分析顯示,廣西毒株與參考毒株在第156位氨基酸處均未出現(xiàn)變異。與疫苗株FX2010相比,E蛋白出現(xiàn)了多個(gè)位點(diǎn)的突變,如廣西毒株GXZS01-2019、GXZS02-2020及GXBH01-2019與參考毒株CHN-JL在第43位氨基酸處均出現(xiàn)相同突變,而在E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,該3個(gè)毒株與CHN-JL株遺傳距離也最近;第157位氨基酸處發(fā)生突變的毒株為雞源、蚊蟲(chóng)源TMUV,以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中分群屬于3群的SD14毒株,屬于2群的廣西毒株與其他水禽源TMUV在該位點(diǎn)均未突變,而第157位氨基酸處的抗原指數(shù)最高,可能與病毒的宿主范圍或分群有關(guān)。此外,有7個(gè)氨基酸位點(diǎn)是部分廣西毒株特有的突變。廣西毒株的E蛋白突變位點(diǎn)均未涉及關(guān)鍵位點(diǎn),至于這些位點(diǎn)突變的影響尚需進(jìn)一步研究。
基于ORF核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,廣西毒株分布于2.1亞群,同樣源自廣西的GX2013E株也屬于該群,而廣西的GX2011、GX2015株則分布于2.2亞群。Zhu等[25]研究報(bào)道,2.1亞群是中國(guó)新出現(xiàn)的一種強(qiáng)毒力型毒株,對(duì)雛鴨的致病性高于2.2亞群。表明DTMUV廣西流行毒株呈現(xiàn)不同的進(jìn)化趨勢(shì),更多的毒株向高致病性的群體進(jìn)化。另外,廣西毒株與參考毒株的遺傳距離也不盡相同,GXZS01、GXZS02、GXBH01與CHN-JL株遺傳距離較近,而另外5個(gè)毒株與H、AQ-19株距離較近。廣西的GX2013E與HD1-2013株遺傳距離較近,而廣西的GX2011、GX2015與GD06株遺傳距離較近。E、NS5基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分布與ORF相似。表明廣西毒株進(jìn)化趨勢(shì)出現(xiàn)分歧,呈現(xiàn)遺傳多樣性的特征。
DTMUV全序列重組分析顯示,共有4株有重組信號(hào),其中,ziYY150901、HB2016株重組位點(diǎn)相似,位于E-NS1-NS2A區(qū)域,GXBH01-2019株位于NS1-NS2A-NA2B區(qū)域,GXZS02-2020株位于E-NS1區(qū)域。表明重組位點(diǎn)位于E蛋白及其臨近的非結(jié)構(gòu)蛋白。E蛋白作為宿主的重要保護(hù)性抗原,對(duì)病毒的吸附、融合及受體結(jié)合等發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24,26]。非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒核酸復(fù)制、蛋白合成加工與病毒粒子組裝等方面起關(guān)鍵性作用[27]。因此,這些基因發(fā)生重組需引起密切關(guān)注。貝葉斯遺傳進(jìn)化速率分析顯示,1955-2021年E、NS5基因進(jìn)化速率相近。Ninvilai等[28]估算E基因的進(jìn)化速率為1.507×10-3替換/(位點(diǎn)·年);Yu等[29]研究報(bào)道,E基因的進(jìn)化速率為5×10-4替換/(位點(diǎn)·年)。本研究中,E基因的進(jìn)化速率介于二者之間,可能與參考毒株的種類(lèi)和數(shù)量及分析軟件參數(shù)設(shè)置等因素有關(guān)。E基因最大可信進(jìn)化分支樹(shù)顯示,TMUV約出現(xiàn)在1 934.9年,并且經(jīng)數(shù)次進(jìn)化形成不同群體。通過(guò)軟件計(jì)算得出,廣西毒株早在2 016.5年就已存在(未發(fā)表)。因此,需持續(xù)密切關(guān)注DTMUV流行病學(xué)調(diào)查與分子遺傳特征分析,及時(shí)了解掌握DTMUV在廣西地區(qū)流行新態(tài)勢(shì)與新特點(diǎn),為有效防控DTMU感染制定措施提供數(shù)據(jù)支持。
本研究擴(kuò)增8株DTMUV全序列,經(jīng)相似性、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因重組及抗原蛋白氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),廣西毒株與國(guó)內(nèi)主要流行毒株親緣性較近,抗原蛋白氨基酸序列發(fā)生獨(dú)特的突變,向高致病性群體進(jìn)化趨勢(shì)明顯,毒株存在重組現(xiàn)象,為進(jìn)一步制定有效的防控措施提供了參考依據(jù)。