• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    2019-2021年鴨坦布蘇病毒廣西流行毒株遺傳多樣性分析

    2022-08-23 02:39:58熊陳勇尹彥文施開創(chuàng)韋顯凱馮淑萍屈素潔陸文俊周洪槿黃海蓮謝守玉黎宗強(qiáng)
    中國畜牧獸醫(yī) 2022年8期

    熊陳勇,尹彥文,施開創(chuàng),李 軍,鄭 敏,韋顯凱,馮淑萍,龍 鳳,屈素潔,陸文俊,周洪槿,黃海蓮,謝守玉,黎宗強(qiáng)

    (1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530005;2.廣西動物疫病預(yù)防控制中心,南寧 530001;3.隆安縣城廂鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站,南寧 532799)

    坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)于1955年首次在馬來西亞庫蚊體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1],感染宿主譜廣泛,鴨、鵝、雞、麻雀、蚊蟲等均能被感染[2]。2010年,中國福建、浙江、江蘇等地的蛋種鴨場突發(fā)新疫情,以蛋鴨產(chǎn)蛋驟降、卵巢出血性壞死、甚至死亡為主要特征[3-5],后經(jīng)證實(shí)致病原為鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)[6],發(fā)病率高達(dá)90%,病死率為5%~10%[7],目前中國多地均有發(fā)病的報道[8-9],給中國水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

    DTMUV是屬于黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的單股正鏈RNA病毒,基因組全長約11 kb,包括5′-及3′-非編碼區(qū)(UTR)和1個開放閱讀框(ORF)。ORF編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白,分別為核衣殼蛋白C、膜蛋白prM和囊膜糖蛋白E;7種非結(jié)構(gòu)蛋白,分別為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[10-11]。E蛋白是病毒粒子表面主要結(jié)構(gòu)蛋白,也是中和抗體的靶向蛋白,參與調(diào)節(jié)病毒受體結(jié)合、宿主范圍及毒力關(guān)鍵因子等重要過程[12]。NS5蛋白是黃病毒中最大的非結(jié)構(gòu)蛋白,且不同病毒間最為保守,相關(guān)研究表明,NS5蛋白能抑制干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,進(jìn)而阻礙天然免疫反應(yīng)[13]。因此,E和NS5基因是DTMUV分子流行病學(xué)研究、病原學(xué)診斷及研發(fā)疫苗和藥物的理想靶標(biāo)。

    廣西地處候鳥遷徙過冬的沿海區(qū)域,毗鄰東南亞國家的邊境口岸,同時也是中國的養(yǎng)鴨大省。為進(jìn)一步了解近年來DTMUV廣西毒株的流行情況及遺傳進(jìn)化特征,本研究對2019-2021年采集自廣西各地的病死鴨組織進(jìn)行DTMUV檢測,并根據(jù)毒株檢測年份及來源地選擇部分陽性樣品開展全基因組測序和序列分析,以期了解并掌握DTMUV廣西毒株的遺傳變異新特點(diǎn),為有效防控DTMUV感染提供參考數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    核酸提取試劑盒購自蘇州天隆生物科技有限公司;PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×TaqPCR MasterMix試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.2 病料檢測

    病料來自2019-2021年廣西各地養(yǎng)鴨場送檢的臨床病死鴨,采集肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、心臟、氣管和腦等組織樣品,置于含有適量PBS溶液的滅菌離心管中,經(jīng)組織磨碎儀研磨至糜狀,離心取上清提取總RNA,采用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用廣西動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室已建立的DTMUV實(shí)時熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測[14]。

    1.3 DTMUV全序列擴(kuò)增與測序

    廣西養(yǎng)鴨主產(chǎn)區(qū)集中于桂東、南及東南,根據(jù)毒株檢測年份及來源地,選取2019年北海、鐘山,2020年鐘山、上思、欽州,2021年蒙圩、白沙、下灣(均屬于貴港市)各1份共計8份經(jīng)檢測為陽性的病料cDNA為模板(表1),根據(jù)DTMUV參考株序列(GenBank登錄號:KC990542),應(yīng)用設(shè)計的特異性引物(表2)進(jìn)行DTMUV全序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL:2×Gflex PCR Buffer (Mg2+,dNTP plus) 25 μL,上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL,TksGflex DNA Polymerase 1 μL,cDNA 5 μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性1 min;98 ℃變性10 s,50 ℃退火15 s,68 ℃延伸2 min,共30個循環(huán);68 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的條帶使用膠回收試劑盒回收純化,連接至pMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,每個重組子挑取3個陽性菌落送測序。對測序所獲片段進(jìn)行拼接,獲得DTMUV基因組全序列。

    表1 DTMUV廣西毒株信息

    1.4 序列分析

    應(yīng)用BioEdit軟件對廣西毒株及參考毒株(表3)進(jìn)行序列比對和相似性分析。使用Mega 7.0軟件計算ORF及E、NS5基因最佳核苷酸替換模型為GTR+G+I、TN93+G、GTR+G+I。應(yīng)用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在線軟件(http:∥tools.immuneepitope.org/bcell/)預(yù)測E蛋白潛在的B細(xì)胞抗原表位;應(yīng)用NetNGlyc 1.0在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)預(yù)測E蛋白N-糖基化位點(diǎn)。以最佳核苷酸替換模型為基礎(chǔ),采用最大似然法(maximum likelihood)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹,Bootstrap值定義為1 000次。應(yīng)用RDP 5(recombination detection program 5)和SimPlot v 3.5.1軟件對廣西毒株及參考毒株全序列進(jìn)行重組分析。應(yīng)用BEAST v 1.10.4軟件對E、NS5基因估算遺傳進(jìn)化速率及最近共同祖先時間(the most recent common ancestor,tMRCA)。

    表2 用于擴(kuò)增DTMUV全基因序列的引物

    續(xù)表

    表3 DTMUV參考毒株

    續(xù)表

    2 結(jié) 果

    2.1 DTMUV全序列擴(kuò)增與測序

    以選取的8份DTMUV陽性病料cDNA為模板,利用設(shè)計的特異性引物分段擴(kuò)增DTMUV全序列,結(jié)果顯示,擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(圖1)。經(jīng)測序、拼接得到8株DTMUV全序列,大小均為10 992 bp。經(jīng)E蛋白氨基酸序列比對表明,8株均為DTMUV野毒株,分別命名為:GXZS01-2019、GXBH01-2019、GXSS01-2020、GXZS02-2020、GXQZ01-2020、GXMW01-2021、GXXW01-2021及GXBS01-2021,為廣西毒株。

    1~8,P1~P8片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M,DL5000 DNA Marker1-8,PCR amplification products of P1-P8 segments,respectively;M,DL5000 DNA Marker圖1 DTMUV全序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of DTMUV genome sequence

    2.2 核苷酸與氨基酸序列相似性比對

    相似性比對析結(jié)果顯示,廣西毒株之間ORF及E、NS5基因核苷酸與氨基酸序列相似性分別為97.9%~99.8%和99.1%~99.9%、97.0%~99.9%和99.0%~100%、97.8%~99.9%和99.3%~99.9%(表4);與國內(nèi)外參考毒株的序列相似性分別為86.4%~99.3%和96.0%~99.8%、85.8%~99.5%和94.8%~100%、87.1%~99.2%和97.5%~99.9%(表5)。其中,與水禽源TMUV的相似性分別為89.2%~99.2%和96.0%~99.8%、89.1%~99.5%和94.8%~100%、89.7%~99.2%和97.5%~99.9%;與雞源TMUV的相似性分別為86.7%~96.5%和96.1%~99.2%、86.5%~96.5%和96.2%~98.8%、87.3%~96.8%和97.6%~99.6%;與其他宿主源TMUV的相似性分別為86.4%~96.5%和96.0%~99.4%、85.8%~96.7%和96.2%~99.4%、87.1%~96.8%和97.6%~99.7%。表明DTMUV廣西毒株間相似性較高,與水禽源TMUV相似性高于其他宿主源。

    2.3 E蛋白氨基酸序列分析

    應(yīng)用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在線軟件預(yù)測廣西毒株的E蛋白B細(xì)胞抗原表位,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)16個潛在抗原表位,其中第157位的丙氨酸抗原相關(guān)指數(shù)最高。應(yīng)用NetNGlyc 1.0在線軟件預(yù)測N-糖基化位點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個糖基化位點(diǎn),為154位氨基酸NYSA序列。E蛋白氨基酸序列比對顯示,與疫苗株FX2010相比,廣西毒株共有11處位點(diǎn)發(fā)生變異,第38、122及277位氨基酸處為不同毒株普遍發(fā)生變異;第43、150、153、326、403、464及487位氨基酸處為部分DTMUV廣西毒株特有的突變,而GXBH01-2019株在第280位氨基酸處出現(xiàn)缺失(表6)。表明廣西毒株E蛋白既有共性又存在獨(dú)特的氨基酸突變,但均未涉及抗原表位與糖基化位點(diǎn)。

    表4 廣西毒株之間ORF及E、NS5基因序列相似性比對

    表5 廣西毒株與參考毒株ORF及E、NS5基因序列相似性比對

    表6 廣西毒株與疫苗株E蛋白氨基酸序列比對結(jié)果

    2.4 遺傳進(jìn)化分析

    基于ORF及E、NS5基因核苷酸序列對廣西毒株與國內(nèi)外參考毒株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,ORF及E、NS5基因均可分為1、2、3及TMUV群(圖2~4)。分布1群的毒株為來自泰國的DK/TH/CU-DTMUV2007株;分布2群的毒株來自中國、泰國,其中2群又劃分為2.1和2.2亞群,廣西毒株(圖2~4中標(biāo)注▲的毒株)均集中于2.1亞群,廣西的GX2013E株也屬于該群,而廣西的GX2011、GX2015株則屬于2.2亞群,表明DTMUV廣西流行毒株進(jìn)化趨勢不完全一致;分布3群的為山東SD14株;蚊蟲源及雞源TMUV毒株組成TMUV群。廣西毒株GXZS01-2019、GXZS02-2020、GXBH01-2019與CHN-JL株遺傳關(guān)系較近,而其他廣西毒株與AQ-19、H株遺傳關(guān)系較近,與相似性比對結(jié)果一致。基于E、NS5基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹與ORF相似。

    圖2 基于DTMUV ORF核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic analysis based on ORF nucleotide sequences of DTMUV

    圖3 基于DTMUV E基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis based on E gene nucleotide sequences of DTMUV

    2.5 DTMUV全序列重組分析

    應(yīng)用RDP5和SimPlot軟件對廣西毒株和參考毒株全序列進(jìn)行重組分析,結(jié)果顯示,ziYY150901、HB2016、GXBH01-2019及GXZS02-2020株均有重組信號(圖5),其中,ziYY150901株重組的主要親本為ZJ201506株,相似性為99.7%,次要親本為SDHS株,相似性為99.5%;HB2016株重組的主要親本為ZJ201506株,相似性為99.5%,次要親本為GX2015株,相似性為100%;GXBH01-2019株重組的主要親本為GXZS01-2019株,相似性為99.8%,次要親本為GXXW01-2021株,相似性為99.9%;GXZS02-2020株重組的主要親本為GXZS01-2019株,相似性為99.8%,次要親本為GXQZ01-2020株,相似性為99.8%。

    圖4 基于DTMUV NS5基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic analysis based on NS5 gene nucleotide sequences of DTMUV

    2.6 E、NS5基因遺傳進(jìn)化速率與tMRCA估算結(jié)果

    應(yīng)用BEAST v 1.10.4軟件,采用貝葉斯聚結(jié)分析方法,對廣西毒株與國內(nèi)外參考毒株的E、NS5基因估算遺傳進(jìn)化速率與tMRCA,結(jié)果顯示,E、NS5基因的遺傳進(jìn)化速率分別為1.31×10-3和1.30×10-3替換/(位點(diǎn)·年);tMRCA分別為88.90和88.91年(表7)。表明E、NS5基因的進(jìn)化速率相近,二者進(jìn)化比較同步。

    A~D,ziYY150901、HB2016、GXBH01-2019和GXZS02-2020株;1,主要親本;2,次要親本A-D,ziYY150901,HB2016,GXBH01-2019 and GXZS02-2020 strains,respectively;1,Major parent;2,Minor parent圖5 廣西毒株與參考毒株全序列重組分析Fig.5 Recombination analysis of complete genome of DTMUV between Guangxi and reference strains

    表7 DTMUV E、NS5基因遺傳進(jìn)化速率和tMRCA估算

    3 討 論

    廣西地處亞熱帶氣候,與東南亞國家接壤,同時也是候鳥遷徙過冬地區(qū)。TMUV宿主譜廣泛,除感染鴨、鵝、雞等家禽外,也能感染麻雀、鴿子等鳥類及蚊蟲[15-16],而鳥類、蚊蟲作為TMUV傳播媒介,存在散播病毒及與沿海地區(qū)養(yǎng)殖的水禽交叉感染的風(fēng)險。另外,有報道稱,養(yǎng)鴨場從業(yè)人員的DTMUV血清陽性檢出率超過70%,可能引發(fā)公共衛(wèi)生安全問題[17-18]。本研究采集2019-2021年廣西各地病死鴨的肝臟、脾臟、腎臟、卵巢等組織病料,利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測顯示,DTMUV與DuCV陽性檢出率較高。推測可能的原因有兩方面:一是由于DuCV等病原體引起機(jī)體免疫抑制,從而導(dǎo)致DTMUV疫苗接種效果不佳,達(dá)不到預(yù)期的保護(hù)作用;二是田間DTMUV流行毒株可能發(fā)生變異,疫苗株交叉保護(hù)力下降。因此,為進(jìn)一步了解近年來DTMUV廣西毒株遺傳分子特征,本研究根據(jù)毒株檢測年限及來源地,從廣西養(yǎng)鴨主產(chǎn)區(qū)送檢病料中選取8份陽性提取總RNA,利用設(shè)計的特異性引物擴(kuò)增DTMUV全序列,并進(jìn)行遺傳多樣性分析。

    相似性比對結(jié)果顯示,與8株廣西毒株ORF相似性最高的分別為H株(5/8)、CHN-JL株(2/8)及AQ-19株(1/8),在遺傳距離上也得出同樣的結(jié)論,其中,H株為Feng等[19]2019年從3周齡的金定鴨體內(nèi)分離到的隸屬2.1亞群強(qiáng)毒株。廣西毒株之間ORF核苷酸序列相似性最高達(dá)99.8%,與參考毒株的核苷酸序列相似性最高達(dá)99.3%,其中,與廣西GX2011、GX2013E及GX2015株的ORF核苷酸序列相似性分別為95.9%~96.2%、96.8%~97.0%及95.6%~95.9%,而E、NS5基因的相似性和ORF相當(dāng),表明廣西毒株之間相似性較高。農(nóng)海連[20]分離的4株廣西DTMUV毒株與參考毒株的核苷酸序列相似性高于96%,氨基酸序列相似性高于98%;李剛[21]分離的山東DTMUV毒株與2010-2012年分離株的ORF氨基酸序列相似性為96.8%~98.6%,與2017年分離株的氨基酸序列相似性為98%以上;劉烈發(fā)等[22]從江西省某蛋鴨養(yǎng)殖場分離到1株DTMUV,與參考毒株核苷酸序列相似性在98.5%以上。表明國內(nèi)毒株之間相似性普遍較高,遺傳變異程度小,與本研究結(jié)果相似。

    經(jīng)在線軟件預(yù)測,E蛋白共有16個B細(xì)胞抗原表位及1個N-糖基化位點(diǎn),為E蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)。E蛋白是DTMUV重要的抗原結(jié)構(gòu)蛋白,可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答,使機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體,在宿主的免疫壓力下,E蛋白將會發(fā)生遺傳變異[23]。據(jù)報道,E蛋白第156位氨基酸突變會破壞第154位氨基酸處的糖基化位點(diǎn),進(jìn)而影響DTMUV的復(fù)制和傳播[24]。E蛋白氨基酸序列分析顯示,廣西毒株與參考毒株在第156位氨基酸處均未出現(xiàn)變異。與疫苗株FX2010相比,E蛋白出現(xiàn)了多個位點(diǎn)的突變,如廣西毒株GXZS01-2019、GXZS02-2020及GXBH01-2019與參考毒株CHN-JL在第43位氨基酸處均出現(xiàn)相同突變,而在E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹中,該3個毒株與CHN-JL株遺傳距離也最近;第157位氨基酸處發(fā)生突變的毒株為雞源、蚊蟲源TMUV,以及系統(tǒng)進(jìn)化樹中分群屬于3群的SD14毒株,屬于2群的廣西毒株與其他水禽源TMUV在該位點(diǎn)均未突變,而第157位氨基酸處的抗原指數(shù)最高,可能與病毒的宿主范圍或分群有關(guān)。此外,有7個氨基酸位點(diǎn)是部分廣西毒株特有的突變。廣西毒株的E蛋白突變位點(diǎn)均未涉及關(guān)鍵位點(diǎn),至于這些位點(diǎn)突變的影響尚需進(jìn)一步研究。

    基于ORF核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,廣西毒株分布于2.1亞群,同樣源自廣西的GX2013E株也屬于該群,而廣西的GX2011、GX2015株則分布于2.2亞群。Zhu等[25]研究報道,2.1亞群是中國新出現(xiàn)的一種強(qiáng)毒力型毒株,對雛鴨的致病性高于2.2亞群。表明DTMUV廣西流行毒株呈現(xiàn)不同的進(jìn)化趨勢,更多的毒株向高致病性的群體進(jìn)化。另外,廣西毒株與參考毒株的遺傳距離也不盡相同,GXZS01、GXZS02、GXBH01與CHN-JL株遺傳距離較近,而另外5個毒株與H、AQ-19株距離較近。廣西的GX2013E與HD1-2013株遺傳距離較近,而廣西的GX2011、GX2015與GD06株遺傳距離較近。E、NS5基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分布與ORF相似。表明廣西毒株進(jìn)化趨勢出現(xiàn)分歧,呈現(xiàn)遺傳多樣性的特征。

    DTMUV全序列重組分析顯示,共有4株有重組信號,其中,ziYY150901、HB2016株重組位點(diǎn)相似,位于E-NS1-NS2A區(qū)域,GXBH01-2019株位于NS1-NS2A-NA2B區(qū)域,GXZS02-2020株位于E-NS1區(qū)域。表明重組位點(diǎn)位于E蛋白及其臨近的非結(jié)構(gòu)蛋白。E蛋白作為宿主的重要保護(hù)性抗原,對病毒的吸附、融合及受體結(jié)合等發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24,26]。非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒核酸復(fù)制、蛋白合成加工與病毒粒子組裝等方面起關(guān)鍵性作用[27]。因此,這些基因發(fā)生重組需引起密切關(guān)注。貝葉斯遺傳進(jìn)化速率分析顯示,1955-2021年E、NS5基因進(jìn)化速率相近。Ninvilai等[28]估算E基因的進(jìn)化速率為1.507×10-3替換/(位點(diǎn)·年);Yu等[29]研究報道,E基因的進(jìn)化速率為5×10-4替換/(位點(diǎn)·年)。本研究中,E基因的進(jìn)化速率介于二者之間,可能與參考毒株的種類和數(shù)量及分析軟件參數(shù)設(shè)置等因素有關(guān)。E基因最大可信進(jìn)化分支樹顯示,TMUV約出現(xiàn)在1 934.9年,并且經(jīng)數(shù)次進(jìn)化形成不同群體。通過軟件計算得出,廣西毒株早在2 016.5年就已存在(未發(fā)表)。因此,需持續(xù)密切關(guān)注DTMUV流行病學(xué)調(diào)查與分子遺傳特征分析,及時了解掌握DTMUV在廣西地區(qū)流行新態(tài)勢與新特點(diǎn),為有效防控DTMU感染制定措施提供數(shù)據(jù)支持。

    4 結(jié) 論

    本研究擴(kuò)增8株DTMUV全序列,經(jīng)相似性、系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因重組及抗原蛋白氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),廣西毒株與國內(nèi)主要流行毒株親緣性較近,抗原蛋白氨基酸序列發(fā)生獨(dú)特的突變,向高致病性群體進(jìn)化趨勢明顯,毒株存在重組現(xiàn)象,為進(jìn)一步制定有效的防控措施提供了參考依據(jù)。

    日韩人妻高清精品专区| 99热这里只有精品一区| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产av一区二区精品久久 | 日本av免费视频播放| 99热网站在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 中文字幕制服av| av专区在线播放| 看十八女毛片水多多多| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲av福利一区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 熟女人妻精品中文字幕| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 99国产精品免费福利视频| 国产在线免费精品| 久久鲁丝午夜福利片| 人妻 亚洲 视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 午夜福利高清视频| 高清av免费在线| 一级毛片我不卡| 性色av一级| 成人综合一区亚洲| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲怡红院男人天堂| 超碰av人人做人人爽久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美成人午夜免费资源| 黄色一级大片看看| 国产人妻一区二区三区在| 天堂俺去俺来也www色官网| 大香蕉97超碰在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 色网站视频免费| 免费大片黄手机在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 精品亚洲成a人片在线观看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 免费av不卡在线播放| 三级经典国产精品| 亚洲最大成人中文| 国产在线免费精品| 久久国产精品大桥未久av | 亚洲无线观看免费| 日韩在线高清观看一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 免费观看a级毛片全部| 多毛熟女@视频| 国模一区二区三区四区视频| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲av二区三区四区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 丰满乱子伦码专区| 久久精品夜色国产| 国产精品人妻久久久久久| 国产永久视频网站| 激情 狠狠 欧美| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 九草在线视频观看| 看非洲黑人一级黄片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲精品日本国产第一区| 国产色爽女视频免费观看| 岛国毛片在线播放| 亚洲国产精品专区欧美| 我要看黄色一级片免费的| 日日啪夜夜爽| 天堂中文最新版在线下载| 久久99热这里只有精品18| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 美女高潮的动态| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 香蕉精品网在线| 十八禁网站网址无遮挡 | 超碰av人人做人人爽久久| 少妇熟女欧美另类| 免费看光身美女| 男的添女的下面高潮视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产成人一精品久久久| 少妇高潮的动态图| 99久久精品热视频| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久久久久久久丰满| 性高湖久久久久久久久免费观看| 十分钟在线观看高清视频www | 男女国产视频网站| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av欧美aⅴ国产| 少妇丰满av| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲美女视频黄频| a级毛片免费高清观看在线播放| 成人特级av手机在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 下体分泌物呈黄色| 少妇 在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人免费观看视频高清| 亚洲精品亚洲一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久青草综合色| 简卡轻食公司| 亚洲精品一区蜜桃| 国产免费福利视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲人成网站在线播| 人人妻人人看人人澡| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲精品视频女| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久久久视频综合| 青青草视频在线视频观看| 久久99热这里只频精品6学生| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产成人aa在线观看| 久久久久久人妻| 日韩一区二区视频免费看| 黄色配什么色好看| 中文字幕av成人在线电影| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人无遮挡网站| 97精品久久久久久久久久精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| kizo精华| 边亲边吃奶的免费视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 色视频www国产| 国产日韩欧美亚洲二区| 人体艺术视频欧美日本| 伦理电影免费视频| 丝瓜视频免费看黄片| 成人亚洲欧美一区二区av| 十分钟在线观看高清视频www | 高清不卡的av网站| 国产日韩欧美在线精品| 深夜a级毛片| 免费观看性生交大片5| 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩视频在线欧美| 午夜福利在线在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 大香蕉97超碰在线| 91精品一卡2卡3卡4卡| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产淫片久久久久久久久| 日韩成人伦理影院| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 麻豆成人av视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产淫片久久久久久久久| 国产伦理片在线播放av一区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 51国产日韩欧美| 另类亚洲欧美激情| 亚洲伊人久久精品综合| 久久精品国产亚洲网站| 高清午夜精品一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 中文天堂在线官网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91狼人影院| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品第二区| 国产成人精品福利久久| 91久久精品国产一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 91久久精品电影网| 国产成人a∨麻豆精品| 免费人成在线观看视频色| 亚洲美女黄色视频免费看| 性色avwww在线观看| 18+在线观看网站| 少妇人妻 视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲国产精品一区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产毛片在线视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费看日本二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 舔av片在线| 亚洲精品一区蜜桃| 黄片无遮挡物在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 国产成人freesex在线| 日本色播在线视频| 91精品国产国语对白视频| 国产av国产精品国产| 岛国毛片在线播放| 国产探花极品一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 国产一区二区三区av在线| 激情 狠狠 欧美| 亚洲人与动物交配视频| 秋霞伦理黄片| 寂寞人妻少妇视频99o| av免费在线看不卡| 亚洲高清免费不卡视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美日本视频| 岛国毛片在线播放| 99热国产这里只有精品6| av在线播放精品| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品不卡视频一区二区| 国产爱豆传媒在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 成年免费大片在线观看| 亚洲精品一二三| 日韩精品有码人妻一区| 一区二区三区免费毛片| 久久久a久久爽久久v久久| .国产精品久久| 97超视频在线观看视频| 大香蕉97超碰在线| 国产精品国产av在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲怡红院男人天堂| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲精品国产av蜜桃| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品,欧美精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 看非洲黑人一级黄片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产在线男女| 只有这里有精品99| 综合色丁香网| 丝瓜视频免费看黄片| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 免费大片18禁| 插阴视频在线观看视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 永久免费av网站大全| av在线观看视频网站免费| 成人影院久久| 国产69精品久久久久777片| 五月开心婷婷网| 国产男女内射视频| 老女人水多毛片| 五月伊人婷婷丁香| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 九九爱精品视频在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国内精品宾馆在线| 日本免费在线观看一区| videossex国产| 久久久久久久久久成人| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲第一av免费看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 乱系列少妇在线播放| 免费看不卡的av| 日韩伦理黄色片| 一区二区三区乱码不卡18| 成人无遮挡网站| av一本久久久久| a 毛片基地| 久久这里有精品视频免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一边亲一边摸免费视频| 老司机影院成人| 秋霞伦理黄片| 在线观看免费日韩欧美大片 | 色综合色国产| 久久久成人免费电影| 我要看黄色一级片免费的| 午夜免费观看性视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲av不卡在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产男女超爽视频在线观看| 有码 亚洲区| 欧美极品一区二区三区四区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 免费大片18禁| 少妇精品久久久久久久| 国产黄频视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 高清日韩中文字幕在线| 51国产日韩欧美| h日本视频在线播放| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 三级国产精品片| 久久av网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 51国产日韩欧美| 内射极品少妇av片p| 最黄视频免费看| 久久午夜福利片| 亚洲无线观看免费| 青春草亚洲视频在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久精品94久久精品| 久热这里只有精品99| 日韩三级伦理在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 午夜激情久久久久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美国产精品一级二级三级 | 我的老师免费观看完整版| 一本久久精品| 欧美xxⅹ黑人| 在线免费十八禁| 国产成人精品久久久久久| videossex国产| 亚洲成色77777| 久久 成人 亚洲| 免费大片黄手机在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲无线观看免费| 舔av片在线| 免费看不卡的av| 一级毛片电影观看| 国产精品国产av在线观看| 亚洲国产欧美人成| 国产精品国产av在线观看| 日韩av免费高清视频| 青春草视频在线免费观看| 一本色道久久久久久精品综合| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲图色成人| 一级毛片 在线播放| av黄色大香蕉| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 色婷婷av一区二区三区视频| av在线老鸭窝| 九色成人免费人妻av| 精品一区二区三卡| 亚洲内射少妇av| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品国产av在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产av一区二区精品久久 | 亚洲人成网站高清观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日本欧美视频一区| 国国产精品蜜臀av免费| 尾随美女入室| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 91精品一卡2卡3卡4卡| 一级二级三级毛片免费看| 人妻一区二区av| 国产综合精华液| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 久久人人爽人人片av| 亚洲三级黄色毛片| 日韩人妻高清精品专区| 深爱激情五月婷婷| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 精品一区二区免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 成人免费观看视频高清| 日韩强制内射视频| 欧美高清性xxxxhd video| 久久热精品热| 欧美zozozo另类| 联通29元200g的流量卡| 日韩中字成人| 久久久色成人| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲美女视频黄频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲无线观看免费| 一级毛片 在线播放| 97精品久久久久久久久久精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产亚洲最大av| 在线观看人妻少妇| 国产精品成人在线| 视频中文字幕在线观看| 免费人成在线观看视频色| 最近最新中文字幕免费大全7| 如何舔出高潮| 国产爱豆传媒在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 精品国产三级普通话版| 春色校园在线视频观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久热精品热| 一二三四中文在线观看免费高清| 熟女av电影| 国产精品欧美亚洲77777| 国产高清三级在线| 国产一区二区在线观看日韩| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av国产久精品久网站免费入址| 久久av网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 免费观看性生交大片5| 成人午夜精彩视频在线观看| av免费在线看不卡| 嘟嘟电影网在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 2021少妇久久久久久久久久久| 色综合色国产| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美97在线视频| 亚洲国产av新网站| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| kizo精华| 天天躁日日操中文字幕| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 人妻系列 视频| 26uuu在线亚洲综合色| av国产免费在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产成人精品婷婷| 国产免费又黄又爽又色| 欧美精品国产亚洲| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩大片免费观看网站| 一个人免费看片子| 成人国产av品久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久精品国产自在天天线| 日本黄色片子视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产淫片久久久久久久久| 欧美区成人在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲久久久国产精品| 精品一区二区免费观看| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 人妻少妇偷人精品九色| 国产成人精品久久久久久| 国产av国产精品国产| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲国产av新网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 男男h啪啪无遮挡| av专区在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 美女福利国产在线 | 成人亚洲欧美一区二区av| 毛片一级片免费看久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 婷婷色综合大香蕉| 51国产日韩欧美| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 一级毛片 在线播放| 97精品久久久久久久久久精品| 两个人的视频大全免费| 最后的刺客免费高清国语| 精品酒店卫生间| 国产黄片视频在线免费观看| av黄色大香蕉| 中文天堂在线官网| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久亚洲国产成人精品v| 我的女老师完整版在线观看| 九九爱精品视频在线观看| av国产免费在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 插逼视频在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产成人freesex在线| 亚洲欧洲日产国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 26uuu在线亚洲综合色| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产真实伦视频高清在线观看| 中文字幕制服av| 我的女老师完整版在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 夫妻午夜视频| 欧美+日韩+精品| 成人特级av手机在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 国产黄片视频在线免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 日本一二三区视频观看| 1000部很黄的大片| 韩国av在线不卡| 美女主播在线视频| 伊人久久国产一区二区| 亚洲自偷自拍三级| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 99re6热这里在线精品视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲成人一二三区av| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美国产精品一级二级三级 | 欧美三级亚洲精品| 亚洲av免费高清在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 嘟嘟电影网在线观看| 国产成人一区二区在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 中文字幕久久专区| 一级二级三级毛片免费看| 一个人看的www免费观看视频| 精品久久久精品久久久| 国产熟女欧美一区二区| 简卡轻食公司| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产成人免费观看mmmm| 赤兔流量卡办理| 搡老乐熟女国产| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲美女视频黄频| 精品亚洲成国产av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 不卡视频在线观看欧美| 午夜老司机福利剧场| 日韩av不卡免费在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 日本av免费视频播放| 成年av动漫网址| 亚洲伊人久久精品综合| 国产乱人偷精品视频| 国产成人91sexporn| 一个人免费看片子| 男女边吃奶边做爰视频| 熟女av电影| av国产久精品久网站免费入址| av网站免费在线观看视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日韩精品有码人妻一区| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久精品94久久精品| 在线精品无人区一区二区三 | 国产精品99久久久久久久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日本黄大片高清| 亚洲四区av| 日韩av不卡免费在线播放| 成年免费大片在线观看| 亚洲综合色惰| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲成人手机| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜精品国产一区二区电影| 一边亲一边摸免费视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品久久久精品久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 性色av一级| 一区二区av电影网| 成年女人在线观看亚洲视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区|