2019-2021年鴨坦布蘇病毒廣西流行毒株遺傳多樣性分析

熊陳勇，尹彥文，施開(kāi)創(chuàng)，李 軍，鄭 敏，韋顯凱，馮淑萍，龍 鳳，屈素潔，陸文俊，周洪槿，黃海蓮，謝守玉，黎宗強(qiáng)

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧 530001；3.隆安縣城廂鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，南寧 532799)

坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)于1955年首次在馬來(lái)西亞庫(kù)蚊體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[1]，感染宿主譜廣泛，鴨、鵝、雞、麻雀、蚊蟲(chóng)等均能被感染[2]。2010年，中國(guó)福建、浙江、江蘇等地的蛋種鴨場(chǎng)突發(fā)新疫情，以蛋鴨產(chǎn)蛋驟降、卵巢出血性壞死、甚至死亡為主要特征[3-5]，后經(jīng)證實(shí)致病原為鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)[6]，發(fā)病率高達(dá)90%，病死率為5%～10%[7]，目前中國(guó)多地均有發(fā)病的報(bào)道[8-9]，給中國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

DTMUV是屬于黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約11 kb，包括5′-及3′-非編碼區(qū)(UTR)和1個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。ORF編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白C、膜蛋白prM和囊膜糖蛋白E；7種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[10-11]。E蛋白是病毒粒子表面主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是中和抗體的靶向蛋白，參與調(diào)節(jié)病毒受體結(jié)合、宿主范圍及毒力關(guān)鍵因子等重要過(guò)程[12]。NS5蛋白是黃病毒中最大的非結(jié)構(gòu)蛋白，且不同病毒間最為保守，相關(guān)研究表明，NS5蛋白能抑制干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，進(jìn)而阻礙天然免疫反應(yīng)[13]。因此，E和NS5基因是DTMUV分子流行病學(xué)研究、病原學(xué)診斷及研發(fā)疫苗和藥物的理想靶標(biāo)。

廣西地處候鳥(niǎo)遷徙過(guò)冬的沿海區(qū)域，毗鄰東南亞國(guó)家的邊境口岸，同時(shí)也是中國(guó)的養(yǎng)鴨大省。為進(jìn)一步了解近年來(lái)DTMUV廣西毒株的流行情況及遺傳進(jìn)化特征，本研究對(duì)2019-2021年采集自廣西各地的病死鴨組織進(jìn)行DTMUV檢測(cè)，并根據(jù)毒株檢測(cè)年份及來(lái)源地選擇部分陽(yáng)性樣品開(kāi)展全基因組測(cè)序和序列分析，以期了解并掌握DTMUV廣西毒株的遺傳變異新特點(diǎn)，為有效防控DTMUV感染提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

核酸提取試劑盒購(gòu)自蘇州天隆生物科技有限公司；PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、2×TaqPCR MasterMix試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 病料檢測(cè)

病料來(lái)自2019-2021年廣西各地養(yǎng)鴨場(chǎng)送檢的臨床病死鴨，采集肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、心臟、氣管和腦等組織樣品，置于含有適量PBS溶液的滅菌離心管中，經(jīng)組織磨碎儀研磨至糜狀，離心取上清提取總RNA，采用PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室已建立的DTMUV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)[14]。

1.3 DTMUV全序列擴(kuò)增與測(cè)序

廣西養(yǎng)鴨主產(chǎn)區(qū)集中于桂東、南及東南，根據(jù)毒株檢測(cè)年份及來(lái)源地，選取2019年北海、鐘山，2020年鐘山、上思、欽州，2021年蒙圩、白沙、下灣(均屬于貴港市)各1份共計(jì)8份經(jīng)檢測(cè)為陽(yáng)性的病料cDNA為模板(表1)，根據(jù)DTMUV參考株序列(GenBank登錄號(hào)：KC990542)，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物(表2)進(jìn)行DTMUV全序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×Gflex PCR Buffer (Mg2+,dNTP plus) 25 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，TksGflex DNA Polymerase 1 μL，cDNA 5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火15 s，68 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶使用膠回收試劑盒回收純化，連接至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，每個(gè)重組子挑取3個(gè)陽(yáng)性菌落送測(cè)序。對(duì)測(cè)序所獲片段進(jìn)行拼接，獲得DTMUV基因組全序列。

表1 DTMUV廣西毒株信息

1.4 序列分析

應(yīng)用BioEdit軟件對(duì)廣西毒株及參考毒株(表3)進(jìn)行序列比對(duì)和相似性分析。使用Mega 7.0軟件計(jì)算ORF及E、NS5基因最佳核苷酸替換模型為GTR+G+I、TN93+G、GTR+G+I。應(yīng)用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在線(xiàn)軟件(http:∥tools.immuneepitope.org/bcell/)預(yù)測(cè)E蛋白潛在的B細(xì)胞抗原表位；應(yīng)用NetNGlyc 1.0在線(xiàn)軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)預(yù)測(cè)E蛋白N-糖基化位點(diǎn)。以最佳核苷酸替換模型為基礎(chǔ)，采用最大似然法(maximum likelihood)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值定義為1 000次。應(yīng)用RDP 5(recombination detection program 5)和SimPlot v 3.5.1軟件對(duì)廣西毒株及參考毒株全序列進(jìn)行重組分析。應(yīng)用BEAST v 1.10.4軟件對(duì)E、NS5基因估算遺傳進(jìn)化速率及最近共同祖先時(shí)間(the most recent common ancestor,tMRCA)。

表2 用于擴(kuò)增DTMUV全基因序列的引物

續(xù)表

表3 DTMUV參考毒株

續(xù)表

2 結(jié) 果

2.1 DTMUV全序列擴(kuò)增與測(cè)序

以選取的8份DTMUV陽(yáng)性病料cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物分段擴(kuò)增DTMUV全序列，結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符(圖1)。經(jīng)測(cè)序、拼接得到8株DTMUV全序列，大小均為10 992 bp。經(jīng)E蛋白氨基酸序列比對(duì)表明，8株均為DTMUV野毒株，分別命名為：GXZS01-2019、GXBH01-2019、GXSS01-2020、GXZS02-2020、GXQZ01-2020、GXMW01-2021、GXXW01-2021及GXBS01-2021，為廣西毒株。

1～8，P1～P8片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M,DL5000 DNA Marker1-8,PCR amplification products of P1-P8 segments，respectively；M,DL5000 DNA Marker圖1 DTMUV全序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of DTMUV genome sequence

2.2 核苷酸與氨基酸序列相似性比對(duì)

相似性比對(duì)析結(jié)果顯示，廣西毒株之間ORF及E、NS5基因核苷酸與氨基酸序列相似性分別為97.9%～99.8%和99.1%～99.9%、97.0%～99.9%和99.0%～100%、97.8%～99.9%和99.3%～99.9%(表4)；與國(guó)內(nèi)外參考毒株的序列相似性分別為86.4%～99.3%和96.0%～99.8%、85.8%～99.5%和94.8%～100%、87.1%～99.2%和97.5%～99.9%(表5)。其中，與水禽源TMUV的相似性分別為89.2%～99.2%和96.0%～99.8%、89.1%～99.5%和94.8%～100%、89.7%～99.2%和97.5%～99.9%；與雞源TMUV的相似性分別為86.7%～96.5%和96.1%～99.2%、86.5%～96.5%和96.2%～98.8%、87.3%～96.8%和97.6%～99.6%；與其他宿主源TMUV的相似性分別為86.4%～96.5%和96.0%～99.4%、85.8%～96.7%和96.2%～99.4%、87.1%～96.8%和97.6%～99.7%。表明DTMUV廣西毒株間相似性較高，與水禽源TMUV相似性高于其他宿主源。

2.3 E蛋白氨基酸序列分析

應(yīng)用Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)廣西毒株的E蛋白B細(xì)胞抗原表位，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)16個(gè)潛在抗原表位，其中第157位的丙氨酸抗原相關(guān)指數(shù)最高。應(yīng)用NetNGlyc 1.0在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)糖基化位點(diǎn)，為154位氨基酸NYSA序列。E蛋白氨基酸序列比對(duì)顯示，與疫苗株FX2010相比，廣西毒株共有11處位點(diǎn)發(fā)生變異，第38、122及277位氨基酸處為不同毒株普遍發(fā)生變異；第43、150、153、326、403、464及487位氨基酸處為部分DTMUV廣西毒株特有的突變，而GXBH01-2019株在第280位氨基酸處出現(xiàn)缺失(表6)。表明廣西毒株E蛋白既有共性又存在獨(dú)特的氨基酸突變，但均未涉及抗原表位與糖基化位點(diǎn)。

表4 廣西毒株之間ORF及E、NS5基因序列相似性比對(duì)

表5 廣西毒株與參考毒株ORF及E、NS5基因序列相似性比對(duì)

表6 廣西毒株與疫苗株E蛋白氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.4 遺傳進(jìn)化分析

基于ORF及E、NS5基因核苷酸序列對(duì)廣西毒株與國(guó)內(nèi)外參考毒株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，ORF及E、NS5基因均可分為1、2、3及TMUV群(圖2～4)。分布1群的毒株為來(lái)自泰國(guó)的DK/TH/CU-DTMUV2007株；分布2群的毒株來(lái)自中國(guó)、泰國(guó)，其中2群又劃分為2.1和2.2亞群，廣西毒株(圖2～4中標(biāo)注▲的毒株)均集中于2.1亞群，廣西的GX2013E株也屬于該群，而廣西的GX2011、GX2015株則屬于2.2亞群，表明DTMUV廣西流行毒株進(jìn)化趨勢(shì)不完全一致；分布3群的為山東SD14株；蚊蟲(chóng)源及雞源TMUV毒株組成TMUV群。廣西毒株GXZS01-2019、GXZS02-2020、GXBH01-2019與CHN-JL株遺傳關(guān)系較近，而其他廣西毒株與AQ-19、H株遺傳關(guān)系較近，與相似性比對(duì)結(jié)果一致。基于E、NS5基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與ORF相似。

圖2 基于DTMUV ORF核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis based on ORF nucleotide sequences of DTMUV

圖3 基于DTMUV E基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic analysis based on E gene nucleotide sequences of DTMUV

2.5 DTMUV全序列重組分析

應(yīng)用RDP5和SimPlot軟件對(duì)廣西毒株和參考毒株全序列進(jìn)行重組分析，結(jié)果顯示，ziYY150901、HB2016、GXBH01-2019及GXZS02-2020株均有重組信號(hào)(圖5)，其中，ziYY150901株重組的主要親本為ZJ201506株，相似性為99.7%，次要親本為SDHS株，相似性為99.5%；HB2016株重組的主要親本為ZJ201506株，相似性為99.5%，次要親本為GX2015株，相似性為100%；GXBH01-2019株重組的主要親本為GXZS01-2019株，相似性為99.8%，次要親本為GXXW01-2021株，相似性為99.9%；GXZS02-2020株重組的主要親本為GXZS01-2019株，相似性為99.8%，次要親本為GXQZ01-2020株，相似性為99.8%。

圖4 基于DTMUV NS5基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis based on NS5 gene nucleotide sequences of DTMUV

2.6 E、NS5基因遺傳進(jìn)化速率與tMRCA估算結(jié)果

應(yīng)用BEAST v 1.10.4軟件，采用貝葉斯聚結(jié)分析方法，對(duì)廣西毒株與國(guó)內(nèi)外參考毒株的E、NS5基因估算遺傳進(jìn)化速率與tMRCA，結(jié)果顯示，E、NS5基因的遺傳進(jìn)化速率分別為1.31×10-3和1.30×10-3替換/(位點(diǎn)·年)；tMRCA分別為88.90和88.91年(表7)。表明E、NS5基因的進(jìn)化速率相近，二者進(jìn)化比較同步。

A～D，ziYY150901、HB2016、GXBH01-2019和GXZS02-2020株；1，主要親本；2，次要親本A-D，ziYY150901,HB2016，GXBH01-2019 and GXZS02-2020 strains，respectively；1，Major parent;2，Minor parent圖5 廣西毒株與參考毒株全序列重組分析Fig.5 Recombination analysis of complete genome of DTMUV between Guangxi and reference strains

表7 DTMUV E、NS5基因遺傳進(jìn)化速率和tMRCA估算

3 討 論

廣西地處亞熱帶氣候，與東南亞國(guó)家接壤，同時(shí)也是候鳥(niǎo)遷徙過(guò)冬地區(qū)。TMUV宿主譜廣泛，除感染鴨、鵝、雞等家禽外，也能感染麻雀、鴿子等鳥(niǎo)類(lèi)及蚊蟲(chóng)[15-16]，而鳥(niǎo)類(lèi)、蚊蟲(chóng)作為T(mén)MUV傳播媒介，存在散播病毒及與沿海地區(qū)養(yǎng)殖的水禽交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)。另外，有報(bào)道稱(chēng)，養(yǎng)鴨場(chǎng)從業(yè)人員的DTMUV血清陽(yáng)性檢出率超過(guò)70%，可能引發(fā)公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[17-18]。本研究采集2019-2021年廣西各地病死鴨的肝臟、脾臟、腎臟、卵巢等組織病料，利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)顯示，DTMUV與DuCV陽(yáng)性檢出率較高。推測(cè)可能的原因有兩方面：一是由于DuCV等病原體引起機(jī)體免疫抑制，從而導(dǎo)致DTMUV疫苗接種效果不佳，達(dá)不到預(yù)期的保護(hù)作用；二是田間DTMUV流行毒株可能發(fā)生變異，疫苗株交叉保護(hù)力下降。因此，為進(jìn)一步了解近年來(lái)DTMUV廣西毒株遺傳分子特征，本研究根據(jù)毒株檢測(cè)年限及來(lái)源地，從廣西養(yǎng)鴨主產(chǎn)區(qū)送檢病料中選取8份陽(yáng)性提取總RNA，利用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增DTMUV全序列，并進(jìn)行遺傳多樣性分析。

相似性比對(duì)結(jié)果顯示，與8株廣西毒株ORF相似性最高的分別為H株(5/8)、CHN-JL株(2/8)及AQ-19株(1/8)，在遺傳距離上也得出同樣的結(jié)論，其中，H株為Feng等[19]2019年從3周齡的金定鴨體內(nèi)分離到的隸屬2.1亞群強(qiáng)毒株。廣西毒株之間ORF核苷酸序列相似性最高達(dá)99.8%，與參考毒株的核苷酸序列相似性最高達(dá)99.3%，其中，與廣西GX2011、GX2013E及GX2015株的ORF核苷酸序列相似性分別為95.9%～96.2%、96.8%～97.0%及95.6%～95.9%，而E、NS5基因的相似性和ORF相當(dāng)，表明廣西毒株之間相似性較高。農(nóng)海連[20]分離的4株廣西DTMUV毒株與參考毒株的核苷酸序列相似性高于96%，氨基酸序列相似性高于98%；李剛[21]分離的山東DTMUV毒株與2010-2012年分離株的ORF氨基酸序列相似性為96.8%～98.6%，與2017年分離株的氨基酸序列相似性為98%以上；劉烈發(fā)等[22]從江西省某蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)分離到1株DTMUV，與參考毒株核苷酸序列相似性在98.5%以上。表明國(guó)內(nèi)毒株之間相似性普遍較高，遺傳變異程度小，與本研究結(jié)果相似。

經(jīng)在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)，E蛋白共有16個(gè)B細(xì)胞抗原表位及1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，為E蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)。E蛋白是DTMUV重要的抗原結(jié)構(gòu)蛋白，可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體，在宿主的免疫壓力下，E蛋白將會(huì)發(fā)生遺傳變異[23]。據(jù)報(bào)道，E蛋白第156位氨基酸突變會(huì)破壞第154位氨基酸處的糖基化位點(diǎn)，進(jìn)而影響DTMUV的復(fù)制和傳播[24]。E蛋白氨基酸序列分析顯示，廣西毒株與參考毒株在第156位氨基酸處均未出現(xiàn)變異。與疫苗株FX2010相比，E蛋白出現(xiàn)了多個(gè)位點(diǎn)的突變，如廣西毒株GXZS01-2019、GXZS02-2020及GXBH01-2019與參考毒株CHN-JL在第43位氨基酸處均出現(xiàn)相同突變，而在E基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，該3個(gè)毒株與CHN-JL株遺傳距離也最近；第157位氨基酸處發(fā)生突變的毒株為雞源、蚊蟲(chóng)源TMUV，以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中分群屬于3群的SD14毒株，屬于2群的廣西毒株與其他水禽源TMUV在該位點(diǎn)均未突變，而第157位氨基酸處的抗原指數(shù)最高，可能與病毒的宿主范圍或分群有關(guān)。此外，有7個(gè)氨基酸位點(diǎn)是部分廣西毒株特有的突變。廣西毒株的E蛋白突變位點(diǎn)均未涉及關(guān)鍵位點(diǎn)，至于這些位點(diǎn)突變的影響尚需進(jìn)一步研究。

基于ORF核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，廣西毒株分布于2.1亞群，同樣源自廣西的GX2013E株也屬于該群，而廣西的GX2011、GX2015株則分布于2.2亞群。Zhu等[25]研究報(bào)道，2.1亞群是中國(guó)新出現(xiàn)的一種強(qiáng)毒力型毒株，對(duì)雛鴨的致病性高于2.2亞群。表明DTMUV廣西流行毒株呈現(xiàn)不同的進(jìn)化趨勢(shì)，更多的毒株向高致病性的群體進(jìn)化。另外，廣西毒株與參考毒株的遺傳距離也不盡相同，GXZS01、GXZS02、GXBH01與CHN-JL株遺傳距離較近，而另外5個(gè)毒株與H、AQ-19株距離較近。廣西的GX2013E與HD1-2013株遺傳距離較近，而廣西的GX2011、GX2015與GD06株遺傳距離較近。E、NS5基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分布與ORF相似。表明廣西毒株進(jìn)化趨勢(shì)出現(xiàn)分歧，呈現(xiàn)遺傳多樣性的特征。

DTMUV全序列重組分析顯示，共有4株有重組信號(hào)，其中，ziYY150901、HB2016株重組位點(diǎn)相似，位于E-NS1-NS2A區(qū)域，GXBH01-2019株位于NS1-NS2A-NA2B區(qū)域，GXZS02-2020株位于E-NS1區(qū)域。表明重組位點(diǎn)位于E蛋白及其臨近的非結(jié)構(gòu)蛋白。E蛋白作為宿主的重要保護(hù)性抗原，對(duì)病毒的吸附、融合及受體結(jié)合等發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[24,26]。非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒核酸復(fù)制、蛋白合成加工與病毒粒子組裝等方面起關(guān)鍵性作用[27]。因此，這些基因發(fā)生重組需引起密切關(guān)注。貝葉斯遺傳進(jìn)化速率分析顯示，1955-2021年E、NS5基因進(jìn)化速率相近。Ninvilai等[28]估算E基因的進(jìn)化速率為1.507×10-3替換/(位點(diǎn)·年)；Yu等[29]研究報(bào)道，E基因的進(jìn)化速率為5×10-4替換/(位點(diǎn)·年)。本研究中，E基因的進(jìn)化速率介于二者之間，可能與參考毒株的種類(lèi)和數(shù)量及分析軟件參數(shù)設(shè)置等因素有關(guān)。E基因最大可信進(jìn)化分支樹(shù)顯示，TMUV約出現(xiàn)在1 934.9年，并且經(jīng)數(shù)次進(jìn)化形成不同群體。通過(guò)軟件計(jì)算得出，廣西毒株早在2 016.5年就已存在(未發(fā)表)。因此，需持續(xù)密切關(guān)注DTMUV流行病學(xué)調(diào)查與分子遺傳特征分析，及時(shí)了解掌握DTMUV在廣西地區(qū)流行新態(tài)勢(shì)與新特點(diǎn)，為有效防控DTMU感染制定措施提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié) 論

本研究擴(kuò)增8株DTMUV全序列，經(jīng)相似性、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因重組及抗原蛋白氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，廣西毒株與國(guó)內(nèi)主要流行毒株親緣性較近，抗原蛋白氨基酸序列發(fā)生獨(dú)特的突變，向高致病性群體進(jìn)化趨勢(shì)明顯，毒株存在重組現(xiàn)象，為進(jìn)一步制定有效的防控措施提供了參考依據(jù)。