非洲豬瘟病毒P72蛋白合成肽疫苗的構(gòu)建及其免疫效力評(píng)估

徐婭玲，張霽輝，牛 熙，李 升，黃世會(huì)，冉雪琴，王嘉福

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起家豬、疣豬、歐洲野豬和美洲野豬等不同品種豬發(fā)病的急性、烈性傳染病[1],主要癥狀為肺水腫、嚴(yán)重抑郁、高熱、發(fā)紺、無食欲、多器官廣泛出血等[2]，對(duì)環(huán)境有極強(qiáng)的抵抗能力，在-20 ℃ 112 d后仍具有感染能力[3]，中國動(dòng)物病原微生物名錄中將其列為一類動(dòng)物疫病，該病首次發(fā)現(xiàn)于肯尼亞[4]，后傳播到西班牙、意大利、法國、格魯吉亞、俄羅斯等國家[5-6]，2018年初在中國遼寧省沈陽市首次暴發(fā)，由于其高致死性，對(duì)中國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]，但目前仍無有效疫苗預(yù)防，一旦發(fā)現(xiàn)，只能采取捕殺方式，因此對(duì)于ASF疫苗的研究尤為重要。

目前，ASF的疫苗研發(fā)中病毒載體疫苗與減毒活疫苗免疫原性較強(qiáng)[8-9]。但病毒載體疫苗安全性尚不能完全確定，易突變?yōu)閺?qiáng)毒株[10]，減毒活疫苗可能會(huì)導(dǎo)致豬產(chǎn)生高熱、食欲不振、輕微神經(jīng)衰弱癥狀，部分豬甚至因感染而急性死亡[11]。因此，安全性更高的疫苗對(duì)于ASF至關(guān)重要。以抗原表位為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的合成肽疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)特定表位的免疫反應(yīng)，并避免其他可能導(dǎo)致過敏性反應(yīng)的無關(guān)表位的潛在影響，具有極高的安全性[12]。P72蛋白作為ASFV主要的衣殼蛋白，有較多的抗原表位[13]，2014年 Phillips[14]通過基因定位發(fā)現(xiàn)該蛋白存在多個(gè)抗原反應(yīng)區(qū)域。郭晶等[15]也通過P72多表位融合蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了特異性抗體及其良好的免疫原性。有效的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位可通過免疫信息學(xué)分析確定，但表位的免疫原性必須通過試驗(yàn)驗(yàn)證。因此，本研究通過生物信息學(xué)的方法評(píng)估和選擇P72蛋白中能誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞應(yīng)答的抗原表位，制備合成肽疫苗，免疫小鼠，評(píng)估合成肽的免疫效力，以期為ASF合成肽疫苗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列、試驗(yàn)動(dòng)物

ASFV CAS19-01/2019株(GenBank登錄號(hào)：MN172368.1)P72蛋白氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)：QGJ83444.1)；3～5周齡SPF級(jí)雌性健康BALB/c小鼠(許可編號(hào)：EAE-GZU-2021-P014)購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

弗氏完全與不完全佐劑(Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA)、ELISA包被液、ELISA終止液、TMB顯色液、紅細(xì)胞裂解液、小鼠脾臟細(xì)胞分離試劑盒(Solarbio公司)；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、100目與200目細(xì)胞篩、PBS、小鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)ELISA試劑盒、IL-4 ELISA試劑盒、小鼠免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒、小鼠γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒(湖南艾方生物科技有限公司)；抗體CD3+、CD8+、CD4+(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (Goat Anti-Mouse IgG-HRP)(上海艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 抗原表位分析 利用ExPASy在線分析工具ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)P72蛋白分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和半衰期；利用Netphos在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php NetPhos-3.1)預(yù)測(cè)其磷酸化位點(diǎn)；SOPMA (https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用IEDB在線軟件(http:∥tools.immuneepitope.org/main/)預(yù)測(cè)其T細(xì)胞抗原表位、表面可及性、可塑性、抗原及親水性；利用ABCpred (https:∥webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/)、SVMtrip (http:∥sysbio.unl.edu/SVMTriP/)在線軟件預(yù)測(cè)其B細(xì)胞抗原表位。

1.3.2 合成肽疫苗的構(gòu)建 根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果，將篩選的T細(xì)胞抗原表位與B細(xì)胞抗原表位以隨機(jī)組合的方式進(jìn)行整合，整合的肽段由南京金斯瑞生物科技有限公司偶聯(lián)KLH蛋白合成多肽P72-1與P72-2。

1.3.3 小鼠免疫 3～5周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠30只，隨機(jī)分為3組：P72-1、P72-2和PBS組每組10只。P72-1和P72-2組分別腹腔注射免疫合成肽疫苗P72-1和P72-2，PBS組腹腔注射免疫PBS作為陰性對(duì)照，共免疫3次，每隔14 d免疫一次，劑量50 μg/只，首免佐劑為弗氏完全佐劑，二、三免佐劑為弗氏不完全佐劑。

1.4 免疫效果評(píng)估

1.4.1 特異性抗體檢測(cè) 采用ELISA方法檢測(cè)免疫后P72-1與P72-2特異性抗體，分別用10 μg/mL的P72-1與P72-2蛋白包被ELISA板，經(jīng)封閉液封閉后，加入以1∶10稀釋于PBS中的免疫動(dòng)物血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入TMB顯色液常溫避光反應(yīng)15 min，加入100 μL ELISA終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值，根據(jù)P/N(陽性D450 nm值/陰性D450 nm值)計(jì)算是否產(chǎn)生特異性抗體及其抗體效價(jià),免疫組(P)/PBS組(N)>2.1即視為檢測(cè)到特異性抗體。

1.4.2 脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 每組隨機(jī)取3只小鼠，斷頸處死后浸泡于75%乙醇中10 min，于超凈工作臺(tái)分離淋巴細(xì)胞，100 μL/孔加到96孔細(xì)胞板中，用終濃度為10 μg/mL的P72-1、P72-2刺激淋巴細(xì)胞，無抗原組為對(duì)照，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)68 h后每孔添加10 μL CCK-8，37 ℃放置1 h，測(cè)定D490 nm值，根據(jù)測(cè)量的吸光度，按照下式計(jì)算刺激指數(shù)(SI)：SI=(特異性抗原刺激孔平均D490 nm值-本底D490 nm值)/(無抗原刺激孔平均D490 nm值-本底D490 nm值)。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群 抽取首免56 d后小鼠外周血于抗凝管內(nèi)，加入20 μL熒光標(biāo)記流式抗體CD3+、CD4+、CD8+，混勻，室溫避光放置20 min后加入450 μL溶血素，混勻，室溫避光放置20 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群精準(zhǔn)計(jì)數(shù)。

1.4.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 采集P72-1、P72-2及PBS組小鼠首免后14、28和42 d的血清100 μL，根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ含量。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用 GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析，所有試驗(yàn)設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)樣品，用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 抗原表位分析結(jié)果

P72蛋白的分子式為C3303H5036N904O948S18，分子質(zhì)量為73 154.89 u，由646個(gè)氨基酸組成，平均親水系數(shù)為-0.392，不穩(wěn)定系數(shù)為38.30，是穩(wěn)定性親水蛋白，在哺乳動(dòng)物中的半衰期為30 h；其蛋白結(jié)構(gòu)中含有88個(gè)磷酸化位點(diǎn)：31個(gè)絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、7個(gè)蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)、50個(gè)酪氨酸(Tyr)位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別占19.35%、5.42%、25.08%和50.15%。通過IEDB、ABCpred、SVMtrip在線軟件預(yù)測(cè)B細(xì)胞與T細(xì)胞抗原表位，結(jié)果見表1、2，綜合各項(xiàng)分析結(jié)果，最終確定P72-1由4條多肽組成，多肽序列位置587-606、520-528、203-211、39-58位氨基酸處；P72-2由4條多肽組成，多肽序列位置為626-634、298-306、232-251、110-129位氨基酸處。

表1 P72蛋白B細(xì)胞表位分析

表2 P72蛋白T細(xì)胞表位分析

2.2 特異性抗體水平檢測(cè)

采用ELISA方法分析每次免疫后小鼠血清中特異性抗體效價(jià)，合成肽疫苗免疫組小鼠接種后分別能檢測(cè)到針對(duì)P72-1與P72-2的特異性抗體反應(yīng)，且抗體水平明顯高于PBS組，最高抗體水平出現(xiàn)在一免后28 d，P72-1最高效價(jià)為1∶25 600，P72-2最高效價(jià)為1∶12 800，PBS組小鼠血清中未檢測(cè)到特異性抗體(圖1)。

圖1 免疫小鼠特異性抗體檢測(cè)Fig.1 Detection of specific antibodies in immunized mice

2.3 脾臟淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

由圖2可知，合成肽疫苗免疫組的刺激指數(shù)均極顯著高于PBS組(P<0.01)；P72-1組高于P72-2組，但無顯著性差異(P>0.05)，表明P72-1、P72-2合成肽疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體的特異性脾臟淋巴細(xì)胞增殖。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05).The same as blow圖2 合成肽引起的脾臟淋巴細(xì)胞增殖Fig.2 Spleen lymphocyte proliferation induced by synthetic peptides

2.4 T細(xì)胞亞群檢測(cè)

小鼠分別免疫P72-1、P72-2、PBS制備的合成肽疫苗56 d后，取外周血對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平情況進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。由圖3可知，P72-2組的CD4+T淋巴細(xì)胞的比例最高，達(dá)到77.0%，其次是P72-1組占比75.9%，PBS組為70.6%。CD8+T淋巴細(xì)胞的比例最高的是PBS組,為27.8%，P72-1與P72-2占比分別為22.6%和21.6%。將合成肽疫苗組與PBS組的CD4+/CD8+比值進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。由圖4可知，合成肽疫苗組的CD4+/CD8+比值顯著高于PBS組(P<0.05)，且P72-2顯著高于P72-1(P<0.05),表明P72-1、P72-2能顯著誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫，P72-2誘導(dǎo)能力更強(qiáng)。

圖3 T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of T cell subsets

圖4 T細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值Fig.4 CD4+/CD8+ ratio of T cell subsets

2.5 細(xì)胞因子檢測(cè)

取免疫后42 d小鼠血清，通過ELISA方法檢測(cè)小鼠外周血中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4的含量。由圖5可知，與PBS組相比，P72-1和P72-2組的IFN-γ、IL-2、IL-4含量均升高，其中P72-1和P72-2組的IL-4、IL-2含量在免疫后42 d時(shí)極顯著升高(P<0.01)，在免疫后28 d時(shí)，除P72-1組IL-2含量顯著升高外(P<0.05)，其合成肽疫苗組檢測(cè)值均極顯著升高(P<0.01)；在免疫后14 d時(shí)，P72-2組IFN-γ與IL-4含量均顯著升高(P<0.05)，P72-1組IL-4含量極顯著升高(P<0.01)；P72-1與P72-2組細(xì)胞因子IL-4、IL-2、IFN-γ各個(gè)檢測(cè)值之間均存在差異，但只在IL-2上存在顯著性差異，表現(xiàn)為P72-2組顯著或極顯著高于P72-1組(P<0.05；P<0.01)。

A,IL-2;B,IFN-γ;C,IL-4圖5 合成肽引起的細(xì)胞因子變化Fig.5 Cytokine changes induced by synthetic peptides

3 討 論

非洲豬瘟是一種高度傳染的出血性疾病，病死率接近100%[16]，近年來在非洲、歐洲、亞洲等地頻繁暴發(fā)，嚴(yán)重影響了區(qū)域間的生豬及豬肉副產(chǎn)品的貿(mào)易流通，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成災(zāi)難性的打擊[17]，但其病原體ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜且缺乏負(fù)責(zé)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫抗原的知識(shí)，尚未研發(fā)出有效的非洲豬瘟疫苗。

P72是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，基因序列高度保守，在病毒感染后期表達(dá)，對(duì)病毒衣殼的形成具有重要意義[18]，已有許多研究利用P72蛋白作為候選抗原研制疫苗。謝靈志[19]利用P72蛋白制備重組腺病毒載體疫苗注射小鼠后，引起了小鼠淋巴細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子分泌，顯著增強(qiáng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平；Chen等[20]通過反向遺傳學(xué)方法表達(dá)P72蛋白構(gòu)建的新城疫病毒rNDV/P72，不僅在小鼠模型中產(chǎn)生了高水平的特異性IgG抗體，還促進(jìn)了T淋巴細(xì)胞的增殖，提升了機(jī)體的免疫應(yīng)答水平；但目前對(duì)于P72蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位的免疫效力研究還鮮有報(bào)道，因此，本研究利用P72蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位制備了合成肽疫苗P72-1與P72-2，并對(duì)其免疫效力進(jìn)行評(píng)估。

利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)、篩選蛋白抗原表位已成為表位疫苗研究的首選方法，不僅能提升疫苗的安全性，同時(shí)能保留較強(qiáng)的抗原性[21]。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)P72蛋白抗原表位進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，經(jīng)篩選得到8個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位，與傳統(tǒng)表位篩選過程比，此方法有工作量小、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，并已成功應(yīng)用在豬O型口蹄疫病毒合成肽疫苗的研究中[22]。本研究制備的合成肽疫苗P72-1與P72-2包含的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞與T細(xì)胞抗原表位在機(jī)體內(nèi)引起了良好的免疫反應(yīng)，間接ELISA結(jié)果表明，免疫小鼠在首免14 d后就產(chǎn)生了高效價(jià)特異性抗體，這與EV-D68病毒的合成肽疫苗引起的特異性抗體效果一致[23]，證明篩選的抗原表位具有良好的免疫原性。本研究通過對(duì)免疫組小鼠外周血及血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)免疫組小鼠的T細(xì)胞亞群指數(shù)與細(xì)胞因子增殖情況顯著高于對(duì)照組，表明疫苗顯著提高了機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。此外，淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)作為反映機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖的一種方法，能有效評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫功能[24]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示免疫后脾臟淋巴細(xì)胞顯著增殖情況，表明疫苗顯著提高了機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。唐華[22]構(gòu)建的A型口蹄疫病毒合成肽疫苗在小鼠體內(nèi)導(dǎo)致T細(xì)胞亞群顯著變化；孟媛等[25]制備的塞尼卡病毒VP1蛋白的亞單位疫苗在小鼠模型中引發(fā)了顯著的細(xì)胞因子變化；魏冰[26]在研究Th表位合成肽對(duì)O型口蹄疫病毒合成肽疫苗的增效作用中發(fā)現(xiàn)小鼠T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率顯著上升。這些研究都表明了具有良好免疫效力的疫苗能顯著激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，本研究基于優(yōu)勢(shì)抗原表位設(shè)計(jì)的合成肽疫苗P72-1與P72-2具有良好的免疫效力。

盡管本試驗(yàn)制備的合成肽疫苗免疫小鼠后在小鼠體內(nèi)有較好的免疫反應(yīng)，但ASFV的感染機(jī)制尚未完全明確，且未進(jìn)行豬的免疫效力評(píng)價(jià)及攻毒保護(hù)試驗(yàn)，后續(xù)研究中還需繼續(xù)篩選更多抗原的優(yōu)勢(shì)表位來優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)，以期能獲得更好的免疫保護(hù)效果。

4 結(jié) 論

本研究初步探索了ASFV P72蛋白合成肽疫苗的免疫效力，通過分析P72蛋白的結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)其抗原表位，成功構(gòu)建了多肽疫苗P72-1與P72-2，通過免疫小鼠，表明該疫苗具有良好的免疫原性，為ASFV多肽疫苗的研制奠定技術(shù)基礎(chǔ)。