嶗山奶山羊無角間性綜合征生殖缺陷基因的基因型分析

張權(quán)威，都萌萌，程 明，戴正浩，劉開東，林曉坤，高而尚，秦至莉，趙金山，李和剛

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島 266109；2.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，青島 266100)

羊角是羊的標志性特征之一，但并非經(jīng)濟性狀。在野生情況下，羊角是羊為了吸引配偶、爭奪地位等進行爭斗的重要工具。在現(xiàn)代畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，有角山羊打斗明顯且占有優(yōu)勢地位，飼喂時搶料嚴重，而且打斗還會造成流產(chǎn)甚至骨折、乳房撕裂等情況，給飼養(yǎng)管理造成極大的困難，從而增加經(jīng)濟成本。而無角羊與有角羊相比不僅減少了個體之間相互爭斗帶來的經(jīng)濟損失，而且也有利于對家畜的大批量圈養(yǎng)，更利于養(yǎng)殖和管理。因此，培育無角羊品系已經(jīng)成為羊育種發(fā)展的趨勢。

據(jù)報道，松弛素家族肽受體2(relaxin family peptide receptor 2,RXFP2)是影響綿羊角的有無、大小和角型的主要候選基因[1-4]，關(guān)于綿羊多角性狀的候選基因較多，主要有同源框基因家族D(homeobox gene family D,HOXD)和RXFP2基因等[5-8]。在山羊中同樣存在無角變異，但與綿羊不同的是山羊的無角性狀與間性性狀是緊密連鎖的，稱為無角間性綜合征(polled intersex syndrome，PIS)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于山羊1號染色體上約129 Mb處的11.7 kb缺失，并影響叉頭轉(zhuǎn)錄因子2(fokhead box L2,FOXL2)和PIS區(qū)調(diào)控的第一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(PIS regulated transcript number 1,PISRT1)的轉(zhuǎn)錄造成的[9]。有學(xué)者認為間性奶山羊中11.7 kb片段的缺失不是完全的而是部分的[10-11]，其中198 bp替換和108 bp缺失也可能引發(fā)奶山羊的間性[10]。Simon等[12]研究揭示了一種更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異，認為間性奶山羊的出現(xiàn)是由于1號染色體上約129 Mb區(qū)域總長度為約10.1 kb的缺失和1個反向插入的約480 kb大小的重復(fù)片段導(dǎo)致的。盡管目前的研究定位了山羊PIS基因的可能突變區(qū)，但具體作用機制還不清楚，嚴重阻礙了無角山羊的品種培育進程。因此，本試驗以嶗山奶山羊為研究對象，分析嶗山奶山羊PIS基因的遺傳變異特點，為培育嶗山奶山羊無角新品系提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集青島地區(qū)155只嶗山奶山羊全血樣品，其中間性山羊36只，有角公羊9只，有角母羊34只，無角母羊29只，無角公羊47只，用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取血液樣品基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 間性山羊的表型特征分析 根據(jù)36只間性嶗山奶山羊外生殖器的形態(tài)特點，對其進行形態(tài)學(xué)分類。

1.2.2 引物設(shè)計及合成 本研究涉及的引物共分為3部分：遺傳性別判定引物、PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定引物以及PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定引物。遺傳性別判定引物的設(shè)計參考性別決定區(qū)Y基因(sex determination region Y,SRY)序列(JN561348)；內(nèi)參引物則根據(jù)GAPDH基因序列(NM_001190390)設(shè)計。PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定引物PIS wt-1則參考Li等[10]11.7 kb片段變異檢測引物，其驗證引物是在PIS區(qū)設(shè)計1對包含PIS wt-1的引物PIS wt-3；PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定引物則根據(jù)山羊1號染色體PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)特征，結(jié)合NCBI公布的山羊基因組DNA的完整序列信息(RefSeq:NC_030808.1)進行設(shè)計。利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物。各鑒定引物在1號染色體上的位置如圖1所示，引物序列信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 PIS基因型鑒定引物在1號染色體上的位置Fig.1 Location of PIS genotype identification primers on chromosome 1

表1 引物信息

1.2.3 遺傳性別鑒定 PCR擴增SRY和GAPDH基因片段，通過檢測2個特異性片段的有無確定155只山羊的遺傳學(xué)性別。2個特異性片段(379、579 bp)同時存在則為雄性，只存在579 bp則為雌性。PCR擴增體系25 μL：1.1×Golden Star Super PCR Mix 22 μL，DNA 1 μL，上、下游引物(SRY-F/R、GAPDH-F/R)各1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，共34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.4 PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定 利用PIS wt-1檢測有角、無角和間性山羊，分析間性山羊在129 427 003～129 427 905 bp區(qū)域是否存在198 bp替換和108 bp缺失；同時利用PIS wt-3驗證山羊PIS區(qū)是否存在不完全缺失。PCR擴增體系10 μL：1.1×Golden Star Super PCR Mix 8.8 μL，DNA 0.4 μL，上、下游引物(PIS wt-1-F/R、PIS wt-3-F/R)各0.4 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.5 PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定 PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定具體涉及3對引物(PIS wt-2-F/R、PIS var-1-F/R、PIS var-2-F/R)，通過檢測3個特異性片段的有無來確定155只山羊的PIS基因型。擴增PIS var-1和PIS var-2片段是為了驗證山羊PIS基因的缺失類型。不同基因型山羊的擴增片段組合如表2所示。PCR擴增體系及反應(yīng)程序同1.2.3。

表2 3種PIS生殖缺陷基因型的片段大小

2 結(jié) 果

2.1 間性山羊的表型特征分析

按照間性山羊外生殖器的形態(tài)特點可將其分為3種類型：①大陰蒂雄性假間性有17只，其陰戶縮小且陰蒂增大而突出陰戶之外，性腺為睪丸組織；②擬雌性假間性有12只，其陰蒂增大，狀如陰莖，陰戶縮小嚴重且與肛門之間的距離增大;③短陰莖間性有7只，其外表為雄性，但陰莖發(fā)育不全，內(nèi)部有兩性生殖管道與睪丸。

2.2 遺傳性別鑒定

由圖2可知，正常母羊的擴增產(chǎn)物只有1條579 bp條帶，正常公羊的擴增產(chǎn)物同時具有579和379 bp 2條帶。間性山羊中只檢測出579 bp條帶，并未檢測到379 bp條帶，說明間性山羊的性染色體為XX。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，有角母羊；3，有角公羊；4、5，無角母羊；6，無角公羊；7～9，間性山羊M,DL2000 DNA Marker;1 and 2,Horned ewes;3,Horned rams;4 and 5,Hornless ewes;6,Hornless rams;7-9,Intersex goats圖2 遺傳性別判定結(jié)果電泳圖Fig.2 Electrophoretic diagram of genetic sex determination results

2.3 PIS區(qū)198 bp替換和108 bp缺失的基因型鑒定

利用PIS wt-1檢測無角山羊(圖3A)和有角山羊(圖3B)都顯示出903和713 bp條帶，而間性山羊只顯示出713 bp條帶(圖3B)。利用PIS wt-3檢測間性山羊時并未檢測出1 438 bp條帶(圖4)，說明在1號染色體129 427 003～129 427 905 bp區(qū)域并不存在198 bp替換和108 bp缺失。

①A,無角山羊檢測結(jié)果；B，有角和間性山羊檢測結(jié)果。②M，DL2000 DNA Marker；1～8，無角山羊；9，有角山羊；10～16，間性山羊①A,Test results of hornless goats;B,Horned and intersex goats test results.②M,DL2000 DNA Marker；1-8,Hornless goats;9,Horned goats;10-16,Intersex goats圖3 引物PIS wt-1的PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection results of primer PIS wt-1

2.4 PIS區(qū)10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)的基因型鑒定

PCR擴增結(jié)果顯示，有角山羊只有214 bp片段(圖5A、5B)，其基因型為野生型純合子，并沒有發(fā)生10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)，說明有角山羊并不會出現(xiàn)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異；而間性山羊不僅檢測出了下游斷點的680 bp片段(圖5A)，還檢測出了上游斷點的271 bp片段(圖5B)，其基因型為缺失突變純合子，同時發(fā)生了10.1 kb的雙缺失和480 kb的雙重復(fù)。在檢測中發(fā)現(xiàn)10只基因型為雙缺失的純合子無角公羊(表3)，其余無角山羊同時具有214 bp片段以及下游斷點的680 bp片段和上游斷點的271 bp片段(圖5A、5B)，其基因型為突變雜合子，突變基因包含10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)。

M，DL2000 DNA Marker；1～3，有角山羊；4～6，無角山羊；7～9，間性山羊。下同M，DL2000 DNA Marker;1-3,Horned goats;4-6,Hornless goats;7-9,Intersex goats. The same as below圖4 引物PIS wt-3的PCR驗證結(jié)果Fig.4 PCR validation results of primer PIS wt-3

A，引物PIS wt-2和PIS var-2的PCR結(jié)果；B，引物PIS var-1的PCR結(jié)果A,The PCR results of primers PIS wt-2 and PIS var-2;B,The PCR results of primer PIS var-1圖5 嶗山奶山羊的2個結(jié)構(gòu)變異PCR檢測結(jié)果Fig.5 PCR detection results of two structural variations in Laoshan dairy goats

表3 嶗山奶山羊群體PIS生殖缺陷基因型檢測結(jié)果

3 討 論

在山羊中，無角性狀是顯性性狀，而與其緊密連鎖的間性性狀則是隱性性狀，間性山羊表現(xiàn)出一定的發(fā)育障礙和卵巢畸形，無法應(yīng)用于育種。盡管在20年前Pailhoux等[9]就已經(jīng)明確了造成山羊雌性性別反轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象的原因，但是在此后的研究中卻發(fā)現(xiàn)間性山羊的出現(xiàn)并不是簡單的11.7 kb的純合缺失[10-11,13]。而最近的一項研究中使用長讀測序技術(shù)精準地將PIS缺失區(qū)的長度從11.7 kb縮短至10 159 bp，而且原位于1號染色體150 334 286～150 818 098 bp的約480 kb的重復(fù)序列反向插入到PIS缺失區(qū)的位置中[12]，這種變異在中國唐山奶山羊和金堂黑山羊中也得到了印證[14-15]。本研究結(jié)果表明間性嶗山奶山羊的PIS區(qū)是完全缺失的，且符合10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)插入這一變異特征。另外，在1號染色體129 427 003～129 427 905 bp區(qū)域并不存在198 bp的替換和108 bp的缺失，這與198 bp替換和108 bp缺失也可能引發(fā)山羊間性性狀的結(jié)論并不相同[10]。對155只嶗山奶山羊進行基因分型時發(fā)現(xiàn)所有有角山羊等位基因都是純合的，沒有缺失和重復(fù)；而間性山羊等位基因的缺失和重復(fù)都是純合的，這與先前大部分報道的結(jié)果一致[12,14-15]，但是與個別研究結(jié)果不同[10-11]。而在檢測的無角公羊中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因型都是雜合的，只有10只等位基因為純合型的雙缺失無角公羊，與預(yù)期結(jié)果一致。以上結(jié)果證實了突變雜合子無角母羊是可育的，而間性性狀僅發(fā)生在突變純合子母羊中[16-17]。

目前，推測山羊1號染色體129 Mb處的10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)至少影響FOXL2、PISRT1、鉀離子通道15(potassium inwardly rectifying clannel subfamily J member 15，KCNJ15)和ETS轉(zhuǎn)錄因子(ETS transcription factor，ERG)基因的表達，進而影響了山羊的性別分化過程。FOXL2基因是哺乳動物的雌性性別決定基因[18-19]，具有阻止睪丸形成的功能[20]，其缺失可上調(diào)SRY轉(zhuǎn)錄因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)的表達[21]；研究證明，PIS區(qū)的缺失和480 kb的重復(fù)不僅影響FOXL2基因的轉(zhuǎn)錄[9]，還可導(dǎo)致FOXL2基因下游出現(xiàn)幾個特定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[14]；在對來自山羊、綿羊和鹿的221個轉(zhuǎn)錄組的分析中發(fā)現(xiàn)FOXL2基因是一種與角的發(fā)育有關(guān)的基因[22]。PISRT1基因是一種睪丸抑制因子，可抑制SOX9基因的表達[23]；在間性山羊的性腺中PISRT1基因表達下降、SOX9基因表達增加[9]，且其基因多態(tài)性與間性山羊存在緊密聯(lián)系[24]。因此，可將PISRT1基因作為調(diào)控山羊間性性狀的候選基因。480 kb重復(fù)片段包含KCNJ15和ERG基因，而這2種基因的額外拷貝可能在角和性腺發(fā)育中起重要作用。KCNJ15基因在卵泡上皮細胞中高表達[25]，說明KCNJ15基因可能參與卵巢功能的發(fā)育。ERG基因不僅是一種致癌基因[26]，還參與生物體的骨骼發(fā)育[27]。以上這些基因可能在角的發(fā)育和生長代謝方面具有潛在的調(diào)節(jié)作用，并且與間性山羊的出現(xiàn)密切相關(guān)。

牛的無角性狀受多個復(fù)等位基因的控制且不同品種個體間存在差異已被證實[28-31]。綿羊的角性狀至少受2個基因位點的調(diào)控也已經(jīng)被證實[3-4,7-8]，但是山羊的無角性狀和間性性狀的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)仍不清楚。盡管對間性山羊和正常山羊的PIS變異區(qū)域進行三維結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)了顯著的染色體結(jié)構(gòu)差異，但是依然沒有強有力的證明PIS變異區(qū)域的這些序列是如何相互影響的[14]。FOXL2基因功能的喪失導(dǎo)致雌性山羊胎兒出現(xiàn)性反轉(zhuǎn)[19]，而在間性山羊性腺中轉(zhuǎn)基因表達PISRT1基因并不能逆轉(zhuǎn)山羊的間性性狀[32]；另外，在480 kb處發(fā)現(xiàn)14個與山羊角型性狀完全相關(guān)的SNPs位點[15]。據(jù)此推斷，山羊的無角顯性基因可能位于480 kb上，而間性山羊的出現(xiàn)是由于10.1 kb的缺失影響了FOXL2基因的轉(zhuǎn)錄造成的，二者緊密連鎖，其雙突變導(dǎo)致山羊出現(xiàn)間性性狀且僅發(fā)生在雌性山羊中，雜合突變僅表現(xiàn)為無角。雖然目前的研究依然沒有解釋清楚無角性狀和間性性狀的作用機制，但是明確了在間性山羊中10.1 kb的缺失是完全的，并且在嶗山奶山羊中10.1 kb缺失/480 kb重復(fù)雙突變結(jié)合遺傳學(xué)性別鑒定可以作為診斷間性山羊的依據(jù)。

4 結(jié) 論

間性山羊的出現(xiàn)是由于1號染色體下游129 Mb區(qū)域總長度約10.1 kb的完全缺失和1個反向插入的約480 kb大小的重復(fù)片段導(dǎo)致，且間性性狀僅發(fā)生在純合子母羊中，而公羊的純合缺失并不會出現(xiàn)間性性狀。本研究結(jié)果為進一步揭示山羊無角性狀的遺傳機制以及培育嶗山奶山羊無角新品系提供重要參考。