飼喂蒸汽壓片玉米對(duì)新疆褐牛增重、瘤胃發(fā)酵及微生物多樣性的影響

楊 敏，高 雨，許子豪，張九龍，得力努爾·拜山別克，任萬平,2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆肉乳用草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

玉米作為能量飼料，含有大量的玉米淀粉，而玉米淀粉在玉米胚乳中主要為緊密排列的顆粒形式，不利于酶的滲透和微生物消化[1]，但經(jīng)加工處理后可改變其物理及化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而提高玉米的利用率。蒸汽壓片處理可使玉米淀粉糊化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，利于反芻動(dòng)物的消化吸收。Harrelson等[2]給肉牛飼喂蒸汽壓片玉米，發(fā)現(xiàn)其可提高瘤胃淀粉消化率；Xu等[3]利用振動(dòng)分子光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)蒸汽壓片玉米中淀粉在瘤胃中消化率提高；Zinn等[4]研究表明，蒸汽壓片處理可提高玉米利用率、降低料肉比、提升肉牛的平均日增重(ADG)；但對(duì)于飼喂蒸汽壓片玉米是否能提高肉牛瘤胃揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量、改善瘤胃微生物菌群的報(bào)道鮮見。本試驗(yàn)以新疆褐牛為研究對(duì)象，探索蒸汽壓片玉米對(duì)肉牛增重性能、瘤胃發(fā)酵和菌群組成的影響，為后續(xù)降低飼料成本、提高肉牛飼養(yǎng)效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米(新飼玉2號(hào)，2020年收割)購(gòu)自新疆呼圖壁種牛場(chǎng)，所購(gòu)玉米分為兩份，由呼圖壁種牛場(chǎng)飼料加工廠代為加工為蒸汽壓片玉米(調(diào)質(zhì)時(shí)間60 min,壓片厚度2.5 mm，壓制后熱風(fēng)干燥，容重360 g/L，淀粉糊化度≥55%，水分≤14%)和普通破碎玉米(篩孔直徑2 mm)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取16頭18月齡、體重相近(436.87 kg±17.29 kg)的新疆褐牛公牛，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為2組，每組8頭牛，單欄栓系式飼養(yǎng)，試驗(yàn)組混合飼糧中的玉米使用蒸汽壓片玉米(SFC組)，對(duì)照組使用普通破碎玉米(RBC組)，預(yù)試期15 d，正試期180 d。在試驗(yàn)開始前，對(duì)牛舍全面消毒，對(duì)所有試驗(yàn)牛稱重、驅(qū)蟲，進(jìn)行健胃和相關(guān)免疫接種。試驗(yàn)全期使用混合飼糧(精粗比為50∶50)，粗飼料為全株玉米青貯(20%)、麥秸(7%)、玉米秸稈(15%)和苜蓿(8%)。于每日07：00和18：00飼喂，兩組牛每天飼糧飼喂量一致，自由飲水。精料組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.3 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 增重性能 分別在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)對(duì)16頭?？崭狗Q重，計(jì)算兩組牛的平均日增重(average daily gain,ADG)。

1.3.2 瘤胃液的采集和瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定 于試驗(yàn)第180天用瘤胃管分別在飼前(0 h)和飼后1、3、5、7、9 h采集16頭牛的瘤胃液，測(cè)定pH(pH818,山東安耐自動(dòng)化儀表有限公司)后用5層醫(yī)用紗布過濾，分裝到凍存管中，立即投入液氮罐中凍存[5]。氨態(tài)氮(NH3-N)的測(cè)定參照馮宗慈等[6]靛酚藍(lán)比色法，微生物蛋白(MCP)和VFA的測(cè)定參照徐曉莉[7]方法。

1.3.3 瘤胃微生物菌群16S rRNA基因測(cè)序 0 h瘤胃液樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增、MiSeq測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析處理委托北京奧維森基因科技公司協(xié)助完成。用PowerSoil DNA lsolation Kit(MoBio Laboratories,Carlsbad,CA)提取樣本DNA后，采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的條帶大小和核酸純化(Agencourt AMPure XP試劑盒，Beckman Coulter Inc.)后，在Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序，測(cè)序結(jié)果以Fastq格式存儲(chǔ)，再上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)處理的測(cè)序結(jié)果，利用QIIME1(v1.8.0)軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，其中Chao1指數(shù)表示菌種豐富度，其值大小與菌群豐度呈正相關(guān)；Shannon指數(shù)表示微生物多樣性，其值越大表明菌群多樣性越豐富。使用Silva 138數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，再用RDP Classifier算法比對(duì)(設(shè)置70%的置信度閾值)得到每個(gè)擴(kuò)增序列變體(amplicon sequence variants，ASV)對(duì)應(yīng)的物種分類信息，并在門、屬水平上注釋每個(gè)樣品的瘤胃群落組成，再基于物種注釋及相對(duì)豐度結(jié)果使用R(v3.6.0)軟件進(jìn)行物種組成柱狀圖分析。在門水平上選取前10個(gè)、在屬水平上選取前12個(gè)(菌群豐度>1%)瘤胃微生物菌群進(jìn)行分析討論。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值與平均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼喂蒸汽壓片玉米對(duì)新疆褐牛增重性能的影響

由表2可知，兩組試驗(yàn)牛的初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)，SFC組的終末體重及ADG均顯著高于RBC組(P<0.05)。

2.2 飼喂蒸汽壓片玉米對(duì)新疆褐牛瘤胃發(fā)酵的影響

由表3可知，與RBC組相比，SFC組試驗(yàn)牛瘤胃液pH在1 h時(shí)顯著下降(P<0.05)，3 h時(shí)極顯著下降(P<0.01)。SFC組的NH3-N和MCP含量在0、1、3、5、7、9 h時(shí)均極顯著高于RBC組(P<0.01)。在3 h時(shí)，SFC組的乙酸和乙酸+丙酸+丁酸含量均顯著高于RBC組(P<0.05)，丙酸含量極顯著高于RBC組(P<0.01)。

2.3 飼喂蒸汽壓片玉米對(duì)新疆褐牛瘤胃微生物多樣性的影響

2.3.1 瘤胃微生物群落的多樣性和豐富度 由表4可知，兩組間的物種數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、譜系多樣性和觀測(cè)深度差異均不顯著(P>0.05)。

2.3.2 門水平上瘤胃微生物菌群組成 由表5可知，在門水平上，兩組主要的瘤胃微生物菌群是擬桿菌門和厚壁菌門。SFC組瘤胃液中擬桿菌門、螺旋菌門相對(duì)豐度顯著或極顯著高于RBC組(P<0.05；P<0.01)；厚壁菌門、脫硫桿菌門和疣微菌門相對(duì)豐度均顯著低于RBC組(P<0.05)，放線菌門相對(duì)豐度極顯著低于RBC組(P<0.01)。

2.3.3 屬水平上瘤胃微生物菌群組成 由表6可知，兩組的理研菌科RC9、普雷沃氏菌屬、NK4A214_group、克里斯滕森菌科R-7、瘤胃球菌屬和丁酸弧菌屬的相對(duì)豐度在瘤胃微生物屬水平上占比較高，SFC組瘤胃液中理研菌科RC9、普雷氏菌科UCG-003、毛螺旋菌科XPB1014和毛螺旋菌科NK3A20相對(duì)豐度均顯著高于RBC組(P<0.05)，而克里斯滕森菌科R-7相對(duì)豐度顯著低于RBC組(P<0.05)。

表6 兩組新疆褐牛瘤胃微生物屬水平菌群豐度

3 討 論

3.1 飼喂蒸汽壓片玉米對(duì)新疆褐牛增重性能的影響

本試驗(yàn)中，飼喂蒸汽壓片玉米能顯著提高新疆褐牛的終末體重和ADG。張亞偉等[8]用不同水平蒸汽壓片玉米飼喂魯西閹黃牛發(fā)現(xiàn)，蒸汽壓片玉米的添加量與終末體重和ADG呈正相關(guān)，當(dāng)蒸汽壓片玉米替代粉碎玉米的量達(dá)到100%時(shí)增重效果最顯著；白云鵬等[9]研究結(jié)果表明，與飼喂粉碎玉米相比，添加100%蒸汽壓片玉米的平?jīng)黾t牛終末體重和ADG顯著提高；Corona[10]等在育肥牛上應(yīng)用蒸汽壓片玉米也得出類似結(jié)果。以上結(jié)果說明玉米經(jīng)過蒸汽壓片處理后，能顯著提高試驗(yàn)牛的終末體重和平均日增重，這是因?yàn)橛衩捉?jīng)蒸汽壓片處理，提高了玉米淀粉在瘤胃里的消化率和降解率，更容易被肉牛消化吸收[2-3]，從而能夠提高新疆褐牛的增重性能。

3.2 飼喂蒸汽壓片玉米對(duì)新疆褐牛瘤胃發(fā)酵的影響

瘤胃pH能反映瘤胃健康狀況，且pH的高低與飼糧組成和瘤胃VFA含量密切相關(guān)，當(dāng)pH為6.6～6.8時(shí)有利于瘤胃發(fā)酵[11]，過低則會(huì)引發(fā)酸中毒。在本試驗(yàn)中，兩組瘤胃pH隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)均呈先下降后上升再趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，且在3 h時(shí)SFC組pH極顯著低于RBC組，這是因?yàn)轱曃拐羝麎浩衩卓梢燥@著提高瘤胃中淀粉的降解率[12]，增加淀粉與牛消化道的接觸面積[13]，使玉米淀粉在瘤胃中短時(shí)間快速發(fā)酵，導(dǎo)致瘤胃液pH顯著下降。Haled等[14]在育肥牛體外發(fā)酵試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SFC組發(fā)酵液pH在6 h時(shí)最低；喬富強(qiáng)等[15]以利木贊閹牛為試驗(yàn)對(duì)象飼喂蒸汽壓片玉米，其瘤胃液pH顯著降低；但Ahmadi等[16]研究表明，與磨碎玉米相比，SFC組奶牛瘤胃pH顯著提高；而郭亮等[17]研究發(fā)現(xiàn)，添加蒸汽壓片玉米對(duì)瘤胃pH無顯著影響。之所以產(chǎn)生以上不同結(jié)果，可能與蒸汽壓片玉米的添加量、飼糧組成、試驗(yàn)對(duì)象等因素有關(guān)。在本試驗(yàn)條件下，飼喂蒸汽壓片玉米能顯著降低新疆褐牛瘤胃pH，原因是蒸汽壓片玉米加大了淀粉與瘤胃液的接觸面積，提高了瘤胃發(fā)酵速率。

瘤胃中的NH3-N含量與MCP合成密切相關(guān)，既能體現(xiàn)瘤胃氮代謝也能反映蛋白質(zhì)代謝[11,17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NH3-N和MCP含量隨時(shí)間變化均呈先降低再回升的趨勢(shì)，但SFC組這兩個(gè)指標(biāo)始終高于RBC組，且在3 h時(shí)濃度最小，這與pH變化趨勢(shì)相同，在pH降低時(shí)MCP合成緩慢，NH3-N含量最低，這表明MCP的合成可能受到pH的調(diào)控；而NH3-N和MCP含量的變化與VFA的變化趨勢(shì)相反，當(dāng)VFA達(dá)到最高峰時(shí)NH3-N和MCP含量最低。有研究表明飼喂蒸汽壓片玉米能使瘤胃NH3-N含量下降[17-19]，提高M(jìn)CP的合成量，且王璐等[20]在中國(guó)荷斯坦奶牛上應(yīng)用蒸汽壓片玉米后，發(fā)現(xiàn)全替代組瘤胃NH3-N濃度在9:00至13:00始終極顯著高于破碎玉米組?？梢?，添加蒸汽壓片玉米能極顯著提高瘤胃NH3-N含量，促進(jìn)MCP的生成。

VFA是瘤胃內(nèi)的主要產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸、丁酸等，是維持反芻動(dòng)物生命活動(dòng)和提供生產(chǎn)所需能量的重要來源[11]。研究結(jié)果表明，肉牛飼喂蒸汽壓片玉米后能顯著提高丙酸含量[21-23]，在本試驗(yàn)中，SFC組在3 h時(shí)乙酸、丙酸、乙酸+丙酸+丁酸含量顯著高于RBC組，這與王璐等[20]報(bào)道的SFC組奶牛瘤胃乙酸、丙酸、總VFA含量均極顯著高于破碎玉米組的結(jié)果一致，原因可能是玉米經(jīng)蒸汽壓片處理后導(dǎo)致淀粉糊化，從而使得瘤胃微生物能夠更好地利用淀粉，增加了VFA的生成量。綜上所述，飼喂蒸汽壓片玉米可以促進(jìn)瘤胃VFA的生成。

3.3 飼喂蒸汽壓片玉米對(duì)新疆褐牛瘤胃微生物多樣性的影響

細(xì)菌、原蟲和厭氧真菌是反芻動(dòng)物瘤胃的主要微生物，與瘤胃發(fā)酵密切相關(guān)，對(duì)反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)消化和維持機(jī)體健康等十分重要。大量研究證實(shí)，對(duì)于反芻動(dòng)物而言，擬桿菌門和厚壁菌門是瘤胃的優(yōu)勢(shì)菌群[24-25]，擬桿菌門是一類分解碳水化合物的菌群，而厚壁菌門則主要降解纖維物質(zhì)[26]。本試驗(yàn)中，相比RBC組，SFC組擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著提高，厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著降低，兩組瘤胃菌群擬桿菌門和厚壁菌門占比均超過90%，SFC組擬桿菌門相對(duì)豐度較高說明其對(duì)瘤胃里的碳水化合物消化代謝較強(qiáng)，能為機(jī)體提供更多的能量。變形菌門大多為病原菌，吳瓊等[27]用16S RNA高通量測(cè)序技術(shù)分析了安格斯牛瘤胃菌群，發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物在門水平上變形菌門占14.5%，但在本試驗(yàn)中變形菌門相對(duì)豐度不足1%，說明瘤胃中的有益菌豐度壓制了有害菌的豐度。Servin等[28]研究指出，放線菌門中大部分是腐生菌，具有致病作用；疣微菌門與胃腸道免疫相關(guān)，其豐度上升表明機(jī)體免疫性能較高[29]；螺旋菌門能利用可發(fā)酵碳水化合物合成VFA[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與RBC組相比，SFC組放線菌門、疣微菌門和脫硫桿菌門相對(duì)豐度均極顯著下降，而螺旋菌門相對(duì)豐度極顯著上升，表明飼喂SFC能減少致病菌豐度，提高瘤胃VFA的合成。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，在屬水平上，瘤胃中占比較大的細(xì)菌是理研菌科RC9和普雷沃氏菌屬，彭科蘭等[31]對(duì)水牛瘤胃菌群的研究得出類似結(jié)論。非纖維碳水化合物的降解與普雷沃氏菌屬相關(guān)[32]，而普雷沃氏菌屬的瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物主要是丙酸和乙酸，在本試驗(yàn)中SFC組的普雷氏菌科UCG-003相對(duì)豐度高于RBC組，且SFC組瘤胃丙酸和乙酸含量始終高于RBC組，這說明飼喂蒸汽壓片玉米后加快了玉米淀粉在瘤胃內(nèi)代謝，導(dǎo)致SFC組瘤胃發(fā)酵比RBC組更快。克里斯滕森菌科R-7屬于厚壁菌門，能分解纖維類物質(zhì)[33]，與乙酸產(chǎn)量相關(guān)，在本試驗(yàn)中，SFC組在克里斯滕森菌科R-7相對(duì)豐度顯著低于RBC組的情況下，乙酸產(chǎn)量仍比RBC組高，說明在本試驗(yàn)中該菌群對(duì)乙酸產(chǎn)量影響較低，推測(cè)SFC組乙酸產(chǎn)量升高可能與普雷沃氏菌屬UCG-003相對(duì)豐度上升有關(guān)。SFC組毛螺旋菌科XPB1014和毛螺旋菌科NK3A20的相對(duì)豐度均比RBC組高，從Deusch等[34]研究中可知，毛螺旋菌科是產(chǎn)生短鏈脂肪酸生成酶的菌群之一，產(chǎn)物是丁酸，這與本試驗(yàn)中SFC組丁酸含量始終比RBC組高相符合。以上結(jié)果說明飼喂蒸汽壓片玉米能顯著提高普雷氏菌科UCG-003、毛螺旋菌科XPB1014和毛螺旋菌科NK3A20的相對(duì)豐度，這與SFC組的瘤胃VFA濃度較高密切相關(guān)。

新疆褐牛飼喂蒸汽壓片玉米后，SFC組瘤胃液MCP、NH3-N、乙酸、丙酸、丁酸含量均高出RBC組，這可能與SFC組的擬桿菌門、螺旋菌門、普雷氏菌科UCG-003、毛螺旋菌科XPB1014和毛螺旋菌科NK3A20這些瘤胃微生物相對(duì)豐度的增加有關(guān)，瘤胃發(fā)酵加快，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率明顯提高，使肉牛的增重性能明顯提升。

4 結(jié) 論

飼喂蒸汽壓片玉米能顯著提高新疆褐牛的增重性能，促進(jìn)瘤胃中MCP和VFA的合成，提高了與碳水化合物分解及VFA合成相關(guān)的瘤胃微生物菌群(擬桿菌門、螺旋菌門、普雷氏菌科UCG-003、毛螺旋菌科XPB1014和毛螺旋菌科NK3A20)的相對(duì)豐度，降低了與纖維降解相關(guān)(厚壁菌門)和可致病性菌群(放線菌門)的相對(duì)豐度。