豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外分離培養(yǎng)研究進(jìn)展

喻宗崗，馬海明，2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

豬的解剖結(jié)構(gòu)和生理特征與人相似，因此可以作為人類疾病研究的模型[1]。為比較病理模型的優(yōu)劣，研究發(fā)現(xiàn)，豬假性肥大肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(duchenne muscular dystrophy，DMD)模型的病理狀態(tài)比鼠模型中更接近于人[2-3]。因此，豬肌肉疾病模型比小鼠模型更有優(yōu)勢(shì)。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在出生后機(jī)體骨骼肌發(fā)育、維持和再生等生命活動(dòng)中都發(fā)揮著重要的作用[4]。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不僅是肌纖維細(xì)胞核的來(lái)源，而且能促進(jìn)纖維的肥大[5-6]。被激活的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以誘導(dǎo)肌細(xì)胞增殖、分化，并促使肌細(xì)胞與肌纖維融合[7]。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不僅有增殖分化的潛能，而且可被招募參與骨骼肌運(yùn)動(dòng)[8]，在肌纖維損傷修復(fù)和再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9-10]。因此，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞也可以作為肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的良好體外研究模型[11]。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞最早由Mauro[12]于1961年在青蛙腿肌上分離獲得，它位于肌纖維質(zhì)膜和基底膜之間[13]，主要分布于慢肌纖維中[14]。之后陸續(xù)建立了細(xì)胞自然貼壁培養(yǎng)法、熒光激活細(xì)胞分選法和磁珠激活分選法等方法。自然貼壁法耗時(shí)、低效，熒光激活分選法依賴昂貴的儀器，磁珠法獲得的細(xì)胞活力低[15]。通過(guò)添加酶可以適當(dāng)縮短分離時(shí)間，并獲得高純度、高活力的細(xì)胞，但是目前酶消化法仍存在酶使用種類、劑量、消化時(shí)間不統(tǒng)一，離心過(guò)濾時(shí)離心力和濾徑大小不一、離心過(guò)濾次數(shù)不一致等問(wèn)題。作者通過(guò)對(duì)分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的取材、消化、過(guò)濾、離心、體外培養(yǎng)、鑒定等基本步驟進(jìn)行綜述，期望為體外獲得高純度、高活力的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，建立規(guī)范有效的分離方法提供參考。

1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離

1.1 取材

1.1.1 取材部位 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離有直接分離法和肌纖維分離法2種。Doumit等[16]于1992年利用直接分離法首次從4～8周齡豬的半膜肌中分離出肌源衛(wèi)星細(xì)胞；Bekoff等[17]于1997年利用肌纖維分離法在小鼠骨骼肌中分離獲得肌源衛(wèi)星細(xì)胞。Wilschut等[18]于2010年建立豬單纖維分離法，自此陸續(xù)從崗上肌[19]、趾長(zhǎng)伸肌[20]、三角肌群[21]、背最長(zhǎng)肌[22-24]、半腱肌、半膜肌[24-25]、股二頭肌[26-27]、腓腸肌[28]、三頭肌[29]、后腿肌、菱形肌[11,30]、第三腓骨肌[28]、脛骨前肌[4]等肌肉組織中分離出了豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(圖1A)。因背最長(zhǎng)肌相較四肢的小肌群更大，取材最容易，常被用于分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。

1.1.2 取材時(shí)期 分離豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的材料可取自胎兒期至幼齡期，如60胚齡[31-32]、1日齡[4,33]、3日齡[19,27]、4日齡[26,28]、5日齡[24]、7日齡[34]、4～6周齡[23]、1月齡[19]、2月齡[35]、5月齡[36]和25周齡[34](圖1B)。其中最常用的是出生后1日齡豬，并且1～7日齡豬占到85%以上，最大日齡為25周齡。豬日齡越大肌肉的體積越大，取材相對(duì)越容易，然而，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)肌肉中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量越少，其增殖分化潛能也會(huì)越低，因此要獲得足夠數(shù)量且分化潛能高的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞應(yīng)取材于1日齡豬背最長(zhǎng)肌。另外，即使取自同時(shí)期的同一部位，不同品種骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力也存在差別[37]，如中國(guó)大蒲蓮豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖能力高于長(zhǎng)白豬[7]。

p60 d，60胚齡；d，出生后天數(shù)；w，出生后周齡；mon，出生后月齡p60 d,60 embryo age;d,Days after birth;w,Weeks after birth;mon,Months after birth圖1 肌肉組織取樣部位(A)和時(shí)期(B)及其使用百分率Fig.1 Sampling site (A) and period (B) of muscle tissues and their percentage of use

1.2 消化

根據(jù)分離豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞使用酶的種類，將分離方法分為單酶消化法和多酶消化法，單酶有鏈酶蛋白酶[38-39]、膠原酶D[34]、蛋白酶[24,27,40-41]、蛋白酶ⅩⅣ[31,42]、胰蛋白酶[25,43-44]、Ⅰ型膠原蛋白酶[45-52]、Ⅱ型膠原蛋白酶[7,29,53-63](圖2)。Ⅱ型膠原蛋白酶是最常用的酶，不同的酶有最佳的使用方法。Ⅱ型膠原蛋白酶能有效消化肌肉組織中的結(jié)締組織，用0.2% Ⅱ型膠原蛋白酶消化2 h最佳(圖3A、3D)。Ⅰ型膠原蛋白酶最佳使用方法是0.2%消化1～2 h(圖3B、3E)。蛋白酶使用量有4種規(guī)格(圖3C)，最佳消化時(shí)間是1 h(圖3F)。

圖2 消化酶及其使用百分率Fig.2 Digestive enzymes and their percentage of use

聯(lián)合使用2種酶的方法有膠原酶+Ⅹ型胰蛋白酶[19]、Ⅰ型膠原酶+胰蛋白酶[4,23,64-65]、Ⅱ型膠原酶+胰蛋白酶[66]、蛋白酶+Ⅺ型膠原蛋白酶[67-68](圖2)，其中，0.1%～0.2%Ⅰ型膠原酶+0.25%胰蛋白酶應(yīng)用最多，也有聯(lián)合使用胰蛋白酶+膠原酶+DNA酶3種酶分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的[11,24]。羅桂芬等[21]比較了鏈霉蛋白酶、胰酶及膠原酶消化法的分離效果，發(fā)現(xiàn)鏈酶蛋白酶消化法與其他酶消化法相比，可獲得數(shù)量最多的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，但細(xì)胞活力沒有差異。因?yàn)椴煌拿缸饔糜诓煌牡孜铮z原蛋白酶主要作用于肌束，鏈酶蛋白酶和胰蛋白酶作用于基底膜和肌膜，促使骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的釋放[69]。聯(lián)合使用多種酶消化肌肉組織中的異質(zhì)物，雖然能有效去除雜質(zhì)，但是延長(zhǎng)了消化時(shí)間。1日齡豬肌肉組織中含有最多的是結(jié)締組織，因此使用Ⅱ型膠原蛋白酶是最有效的分離方法。

A、D，分別為Ⅱ型膠原蛋白酶的使用濃度和消化時(shí)間使用百分率；B、E，分別為Ⅰ型膠原蛋白酶的使用濃度和消化時(shí)間使用百分率；C、F，分別為蛋白酶的使用濃度和消化時(shí)間使用百分率A and D，The concentration of type Ⅱ collagenase and the percentage of digestion time respectively;B and E,The usage percentage of concentration and digestion time of type Ⅰ collagenase,respectively;C and F,The usage percentage of protease concentration and digestion time,respectively圖3 3種常用單酶使用條件Fig.3 Application conditions of three common single enzymes

1.3 過(guò)濾和離心

骨骼肌中包含血管、神經(jīng)等結(jié)締組織(圖4)，分離肌衛(wèi)星細(xì)胞時(shí)需要過(guò)濾和離心除去結(jié)締組織以獲得高純度的細(xì)胞。分離豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞有不過(guò)濾、過(guò)濾1次和過(guò)濾多次3種方式(圖5A)。1次過(guò)濾有20 μm[19,26]、40 μm[35,41,68]、70 μm[4]、100 μm[27,70]、100目[70]和300 mm[46]等多種濾徑參數(shù)(圖5B)。2次過(guò)濾有100 μm+40 μm[34,67,71]、100 μm+70 μm[11,30,57]、200目+400目[55-56,59,66]、200 mm+50 mm[53,60,62]、200 μm+70 μm[45]、70 μm+40 μm[31,42]、76 μm+37 μm[72]、500 μm+53 μm[38]7種(圖5C)，其中200目+400目在2次過(guò)濾中應(yīng)用最廣泛。3次過(guò)濾有100 μm+70 μm+40 μm[29,48,58,61,64]和100目+200目+400目[73]2種；其中100 μm+70 μm+40 μm是3次過(guò)濾的最佳方式(圖5C)。1次過(guò)濾雖然省時(shí)，但可能因過(guò)濾不足得到的細(xì)胞不純；3次過(guò)濾不僅延長(zhǎng)了時(shí)間，還可能因過(guò)度過(guò)濾損傷細(xì)胞而降低細(xì)胞活力。因此，最優(yōu)的過(guò)濾方式是200目+400目2次過(guò)濾法。

普通離心和密度梯度離心是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞常見的2種分離方式。普通離心有1次離心和多次離心2種，多次離心有多次單一離心力和多次不同離心力2種。300×g離心5 min(2次)[35]比1 000 r/min離心10 min然后1 000 r/min離心5 min[47](圖5D)時(shí)間短，相同分離效果下更為簡(jiǎn)便。多次不同離心力中(圖5E)，2 000 r/min離心5 min后1 000 r/min離心10 min[74]比300×g離心6 min后800×g再離心10 min[39]用時(shí)少，故而更簡(jiǎn)捷。在用時(shí)上，3次離心中，1 500×g離心10 min、800×g離心10 min、800×g離心5 min比100×g離心5 min、1 000×g離心5 min(2次)[34]用時(shí)長(zhǎng)，比1 200×g離心15 min、300×g離心5 min、1 200 g離心15 min[27]用時(shí)短，但是先高離心力能有效去除大塊碎屑，再低離心力去除細(xì)微雜質(zhì)，還不至損傷細(xì)胞，造成細(xì)胞活力下降，是最好的3次離心法。Percoll密度梯度離心有3種70%、50%、40%[26,43]，70%、50%、40%、25%[26,44]和60%、20%[11,30](圖5F)，其中60%、20%密度梯度離心法因?yàn)槌煞州^其他2種更簡(jiǎn)單，因此最簡(jiǎn)便。1次和2次離心雖能去除大部分被消化的結(jié)締組織，但是仍有殘留，所獲的細(xì)胞不純，因此，要有效去除雜質(zhì)，3次離心法是最佳選擇。

圖4 骨骼肌結(jié)構(gòu)模式圖[33]Fig.4 Skeletal muscle structure model diagram[33]

A，過(guò)濾次數(shù)使用百分率；B，1次過(guò)濾使用百分率；C，多次過(guò)濾使用百分率；D，1次離心使用百分率；E，多次離心使用百分率；F，密度梯度離心使用百分率A,The percentage of filtering times;B,The percentage of single filtration;C,The usage percentage of multiple filtration;D,The percentage of single centrifugation;E,The percentage of multiple centrifugal use;F,The percentage of density gradient centrifugation圖5 過(guò)濾和離心程序及其使用百分率Fig.5 Filtration and centrifugation procedures and their percentage of use

2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)分離目標(biāo)分為成肌細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離法和單纖維分離法。常用成肌細(xì)胞、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離法來(lái)獲得原代細(xì)胞。有研究比較了單核成肌細(xì)胞分離法和單纖維分離法獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的優(yōu)劣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核成肌細(xì)胞分離法無(wú)法得到同質(zhì)性高的成肌細(xì)胞，且其中的肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量少，再生能力差；單纖維分離法得到的衛(wèi)星細(xì)胞細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，且可以了解骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞初始位置和遷移轉(zhuǎn)化等過(guò)程[20]。也有通過(guò)共培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和基質(zhì)血管細(xì)胞來(lái)獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法[75]。

離心后的細(xì)胞中含有成肌細(xì)胞和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，為獲得單一的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞還需進(jìn)一步分離純化。成肌纖維細(xì)胞貼壁早于肌衛(wèi)星細(xì)胞，利用差速貼壁的特性，即可以獲得成肌細(xì)胞和肌衛(wèi)星細(xì)胞[75-76]。體外培養(yǎng)豬肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)液包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、抗生素和其他添加物等多種物質(zhì)。對(duì)46篇文獻(xiàn)的培養(yǎng)液分析歸納獲得如下結(jié)果。

豬肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)基有6種，使用頻次最高的是DMEM/F12(圖6A)。血清因其中含有細(xì)胞生長(zhǎng)必需的成分常被添加在培養(yǎng)基中，常見的添加方式有添加1種血清和添加2種血清。添加10%胎牛血清(FBS)比添加20% FBS更經(jīng)濟(jì)。10% FBS+10%馬血清(HS)和10% FBS+10%豬血清(PS)使用較少(圖6B)。為防止外源微生物的污染，常在培養(yǎng)基中添加抗生素。在46篇研究中只有7篇未添加抗生素，抗生素使用率達(dá)到84%以上(圖6C)。在添加抗生素的報(bào)道中，1%青-鏈霉素(P/S)是必需成分，也有同時(shí)添加了青-鏈霉素和兩性菌素[11,26,28-30,43,47,49]，還有同時(shí)添加了青-鏈霉素、兩性菌素和慶大霉素[44]。在培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和谷氨酰胺丙氨酸二肽可提高細(xì)胞的活性、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。部分還添加了基礎(chǔ)成肌纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、雞胚提取物(CEE)、氨基酸(AA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等物質(zhì)(圖6D～6H)，其中bFGF、CEE和EGF可提高細(xì)胞的貼壁率，AA為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，HEPES保證細(xì)胞生長(zhǎng)的緩沖能力。在培養(yǎng)液中添加胞外基質(zhì)(如明膠、鼠尾膠原、多聚賴氨酸、層黏連蛋白和纖維黏連蛋白)可有效提高細(xì)胞的貼壁率[77]。對(duì)于沒有損傷的細(xì)胞，有自然貼壁的能力，不用添加促貼壁的物質(zhì)，增加添加物后細(xì)胞滲透壓和緩沖力會(huì)改變還需要添加緩沖液，因此，DMEM/F12+10% FBS+1% P/S是豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)液。

①A，基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用百分率；B，血清使用百分率；C，抗生素使用百分率；D，谷氨酰胺使用百分率；E，基礎(chǔ)纖維生長(zhǎng)因子使用百分率；F，雞胚提取物使用百分率；G，氨基酸使用百分率；H，其他添加物的使用百分率。②DMEM，杜氏改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基；FBS，胎牛血清；HS，馬血清；PS，豬血清；FCS，小牛血清；PS，青-鏈霉素；Amp，兩性菌素；GTM，慶大霉素；bFGF，基礎(chǔ)成肌纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；CEE，雞胚提取物；NEAA，非必需氨基酸；AA，氨基酸；HEPES，4-羥乙基哌嗪乙磺酸；EGF，表皮生長(zhǎng)因子；None,在46篇文獻(xiàn)中未使用該物質(zhì)①A,The used percentage of basic medium;B,The used percentage of serum;C,The used percentage of antibiotics;D,The used percentage of glutamine;E,The used percentage of basic fiber growth factor;F,The used percentage of chicken embryo extract;G,The used percentage of amino acids;H,The used percentage of other additives. ②DMEM,Dulbecco’s modified Eagle’s medium；FBS,fetal bovine serum；HS,Horse serum；PS,Porcine serum；FCS,Fetal calf serum；P/S,Penicillin-streptomycin；Amp,Amphotericin；GTM,Gentamicin；bFGF,Basic fibroblast growth factor；CEE,Chicken embryo extract；NEAA,Nonessential amino acid；AA,Amino acid；HEPES,4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid；EGF,Epidermal growth factor；None,The substance was not used in 46 literatures圖6 培養(yǎng)液各組分及其使用百分率Fig.6 Components of culture medium and their percentage of use

3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是多潛能干細(xì)胞，可以分化為成肌細(xì)胞和成脂細(xì)胞，因此可以使用成肌或成脂標(biāo)志物來(lái)鑒定。根據(jù)標(biāo)志基因在細(xì)胞中的位置可分為核標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記和細(xì)胞表面膜蛋白標(biāo)記[78]。常見的核標(biāo)記有配對(duì)盒基因3(PAX3)、PAX7；轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記有生肌調(diào)節(jié)因子5(Myf5)、Myf4、肌分化因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(MyoG)等，表面膜蛋白主要有m-鈣黏蛋白、α7-和β1-整合素、c-Met、C-X-C趨化因子受體4型(CXCR4)、多配體蛋白聚糖-3和多配體蛋白聚糖-4、降鈣素受體、顱腦損傷蛋白-1、CD34、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM1)和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子-1 (NCAM1)[79-80]。肌衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志基因有PAX7[7,43,47,53,56,60,63,66,81-83]和Myf5[27,40,67,84]，成脂標(biāo)志基因有脂蛋白脂酶(LPL)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)、脂肪細(xì)胞和定向分化因子1(ADD1)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP-1)[67]，成肌標(biāo)志基因有PAX7[27,28,34]、MyoD、MyoD1[4,26-28,67,85]、MyoG[26,28,85]、Myf5[27,28,33,34]、肌球蛋白重鏈(MHC)[24]和結(jié)蛋白(Desmin)[4,24,28,30,55]。PAX7是鑒定骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的最佳因子。

免疫熒光(IF)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、流式細(xì)胞分析(FC)和免疫組化(IHC)是常用的鑒定方法(圖7)。不同的鑒定因子因其表達(dá)的部位和鑒定的簡(jiǎn)便及有效性的不同而有所側(cè)重。Desmin使用IHC法鑒定最為有效(圖8A)，Myf5用IF法鑒定效果最好(圖8B)。MyoD的鑒定方式中qPCR法相較IF法更為方便、經(jīng)濟(jì)，因此被廣泛使用(圖8C)。PAX7使用IF法鑒定最有效(圖8D)。成脂細(xì)胞標(biāo)志基因常用PCR法來(lái)鑒定，還可以使用油紅O染色法來(lái)鑒定[51]。相較于Desmin、Myf5和MyoD，PAX7在衛(wèi)星干細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞上均有表達(dá)(圖9)，因此是最佳的鑒定因子。

圖7 鑒定方法及其使用百分率Fig.7 Identification methods and their percentage of use

圖8 標(biāo)記因子的鑒定方法及其使用百分率Fig.8 Identification method and application percentage of marker factors

圖9 參與調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)變化過(guò)程的標(biāo)記因子[33]Fig.9 Marker factors involved in regulating the growth and changes of muscle satellite cells[33]

4 小 結(jié)

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以從不同時(shí)期的多種肌肉中分離，且各時(shí)期分離細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力不同，部位決定著取材的便捷性，因此，常用1日齡豬的背最長(zhǎng)肌分離豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。酶消化涉及到用酶種類及各酶使用方法，酶種類的增加可以有效去除肌肉中的雜質(zhì)，但延長(zhǎng)了消化時(shí)間，很可能因過(guò)度消化損傷細(xì)胞膜，降低細(xì)胞活力，所以使用單酶是比較保險(xiǎn)的選擇。0.2% Ⅱ型膠原蛋白酶37 ℃消化2 h是最有效的消化方式。消化后的肌肉組織是細(xì)胞和異質(zhì)碎屑的混合物，需要通過(guò)過(guò)濾和離心去除組織碎屑，獲得純細(xì)胞。單次過(guò)濾、單次離心難以有效去除雜質(zhì)，多次過(guò)濾、離心可能會(huì)損傷細(xì)胞膜降低細(xì)胞活力，因此2次過(guò)濾加3次離心是最佳選擇，即400目+200目過(guò)濾，1 500×g離心10 min、800×g離心10 min、800×g離心5 min是最佳組合。

過(guò)濾離心后的細(xì)胞還包含成肌細(xì)胞，因此需進(jìn)一步培養(yǎng)純化獲得單一的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。成肌細(xì)胞在培養(yǎng)液中正常生長(zhǎng)后會(huì)較早貼壁，因此可取貼壁后的上清繼續(xù)培養(yǎng)來(lái)獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)至關(guān)重要，原代細(xì)胞在離體環(huán)境中需要充足的營(yíng)養(yǎng)和無(wú)菌環(huán)境，DMEM/F12+10% FBS+1% P/S是細(xì)胞培養(yǎng)的常見培養(yǎng)液。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可通過(guò)核標(biāo)志、轉(zhuǎn)錄標(biāo)志和膜表面標(biāo)志等標(biāo)志基因或衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)記、成肌細(xì)胞標(biāo)記和成脂細(xì)胞標(biāo)記因子來(lái)鑒定，PAX7基因廣泛表達(dá)于肌衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞，因此是最佳的鑒定基因。盡管qPCR、FC、IF和IHC等方法均可用來(lái)鑒定，但I(xiàn)F法更為直觀和準(zhǔn)確，因此廣泛被使用。

為獲得純度、活力和分化潛能更高的豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，還需要規(guī)范和優(yōu)化取材、消化、過(guò)濾、離心、培養(yǎng)和鑒定等步驟，建立簡(jiǎn)便有效的體外分離培養(yǎng)程序。隨著新的鑒定方法的出現(xiàn)和新技術(shù)的普及，豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)也將更加高效便捷。