不同腹脂率番鴨回腸轉(zhuǎn)錄組差異分析

王小驪，王興鑫,，楊彩梅，肖英平，楊 華，呂文濤

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點(diǎn)實(shí)驗室，杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，杭州 310021；3.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，杭州 311300)

番鴨原產(chǎn)于南美洲與中美洲熱帶地區(qū)，具有肉質(zhì)好、脂肪少、瘦肉多、蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)。脂肪是畜禽體內(nèi)重要的能量來源和能量貯備形式，但脂質(zhì)氧化將影響其氣味和風(fēng)味，引起肉品質(zhì)和營養(yǎng)價值急劇下降[1]，但對家禽而言，超過85%的胴體脂肪是多余的并非生理需要，而腹部是脂肪的主要沉積部位[2]。過多的腹脂沉積不僅會造成飼料的浪費(fèi)[3]，還會影響屠宰率[4]。脂肪沉積受到脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和血管生成素樣蛋白(angiopoietin-like proteins，ANGPTLs)等影響。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS的催化是脂肪酸合成中的最后一步，在脂肪代謝中起關(guān)鍵作用[5]。Semenkovich[6]研究表明，F(xiàn)AS可以通過提高甘油三酯的合成，促進(jìn)動物脂肪的沉積。豐勝求[7]研究發(fā)現(xiàn)，Angptl1和Angptl2基因均在豬的脂肪組織中高表達(dá)。Angptl3、Angptl4、Angptl8也被證實(shí)與抑制脂肪代謝有關(guān)[8]。此外，脂肪酸結(jié)合蛋白家族(fatty acid-binding protein,FABPs)在脂肪代謝與沉積方面也起著重要作用。FABPs是一類小分子細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸運(yùn)輸有關(guān)，參與宿主體內(nèi)脂肪的合成與降解[9]。王起貴[10]研究發(fā)現(xiàn)，雞肝臟型-FABP(L-FABP)基因的5′-側(cè)翼區(qū)2個多態(tài)性位點(diǎn)G204A和T205C與雞的腹脂重和腹脂率有顯著相關(guān)性。microRNA(miRNA)是動物體內(nèi)常見的基因表達(dá)因子。通過對不同高、低腹脂含量的母雞腹脂的miRNA表達(dá)檢測及miRNA-mRNA相互作用分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的miRNA包括miR-30d、miR-26a和miR-17-5p等[11]。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)miR-30d與miR-30a-5p、miR-146b5p、miR-21和miR-101-3p在雞腹部脂肪組織中大量表達(dá)，并在脂肪形成調(diào)控中發(fā)揮作用。目前對雞的脂肪代謝方面的研究較多，但對鴨的脂肪代謝相關(guān)基因的研究比較缺乏。小腸是機(jī)體消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)最重要的場所，其中位于小腸后段的回腸，在脂肪吸收的過程中發(fā)揮著作用[13-14]。因此，本試驗利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對高、低腹脂率的番鴨回腸進(jìn)行測序分析，篩選與番鴨脂肪代謝相關(guān)的通路和基因，為進(jìn)一步研究脂肪代謝途徑的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物和組織樣品采集 本試驗選用2 000只1日齡雄性商代種番鴨，初體重為(38.46±0.87)g，試驗地點(diǎn)在浙江省蘭溪禾旺禽業(yè)合作社，番鴨自由采食和飲水，飼糧組成與楊華等[15]試驗一致。飼養(yǎng)70 d后，隨機(jī)選取200只體況健康的番鴨屠宰后稱重，采集每只番鴨的腹部脂肪并稱重，同時采集所有番鴨的回腸組織，迅速置于液氮中速凍，于-80 ℃保存，以備提取樣品總RNA。根據(jù)禽肉行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 753—2003)，計算腹脂率，將200只平均腹脂率為2.58%±0.73%的番鴨，按照腹脂率排序，取腹脂率最高的5只為H組，最低的5只為L組，對其回腸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。

1.1.2 主要試劑和儀器 TRIzol?Plus RNA純化試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT MasterMix(Perfect Real-time)均購自Invitrogen公司；RNase-free DNase Set試劑盒購自Qiagen公司；RNA Nano6000檢測試劑盒購自安捷倫公司；NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit和熒光定量染料試劑盒Power SYBR?Green Master Mix購自Applied Biosystems公司。

Nanohotometer?分光光度計購自IMPLEN公司；NanoDrop分光光度計購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與質(zhì)量檢測 從回腸組織中提取總RNA，使用TRIzol?Plus RNA純化試劑盒進(jìn)行純化，并按照說明書使用RNase-free DNase Set對總RNA進(jìn)行處理。使用Nanohotometer?分光光度計檢測RNA的純度，使用NanoDrop分光光度計檢測RNA的濃度，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的完整性和污染程度，使用安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000檢測試劑盒評估RNA樣本的完整性。

1.2.2 文庫構(gòu)建與質(zhì)檢 建庫起始RNA為總RNA，總量≥1 μg。使用NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit建庫試劑盒建立文庫。通過Oligo(dT)磁珠富集帶有Poly A尾的mRNA，隨后在NEB Fragmentation Buffer中用二價陽離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。以片段化的mRNA為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA Polymerase Ⅰ體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選250～300 bp的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫。

文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的insert size進(jìn)行檢測，insert size符合預(yù)期后，采用實(shí)時熒光定量PCR對文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，文庫有效濃度的最低閾值為2 nmol/L，以保證文庫質(zhì)量。

1.2.3 上機(jī)測序 庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求篩選后，在Illumina平臺上測序產(chǎn)生150 bp配對末端讀數(shù)。測序的基本原理是邊合成邊測序(sequencing by synthesis)。在測序的流通通道中加入4種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個測序簇延伸互補(bǔ)鏈時，每加入一個被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機(jī)軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析

1.3.1 參考序列比對 對過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行Trinity拼接處理，將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列(Ref)，采用RSEM軟件將每個樣品的高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean reads)與Ref進(jìn)行比對，分別過濾掉比對質(zhì)量值低于10的reads，非成對比對上的reads，比對到基因組多個區(qū)域的reads。

1.3.2 差異基因表達(dá)分析 使用DESeq R包(1.10.1)進(jìn)行H和L組的差異表達(dá)分析。DESeq提供統(tǒng)計程序，使用基于負(fù)二項分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)。使用Benjamini和Hochberg方法調(diào)整得到的P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。由DESeq篩選出P<0.05的基因被指定為差異表達(dá)基因。

1.3.3 GO和KEGG富集分析 采用GOseq(1.46.0)和KOBAS(KOBAS 3.0)軟件對差異基因集進(jìn)行GO(gene ontology)功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析。

1.3.4 實(shí)時熒光定量PCR分析 利用實(shí)時熒光定量PCR驗證番鴨回腸基因文庫中RNA-Seq基因表達(dá)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。分別提取高、低腹脂率組番鴨回腸的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量試劑盒進(jìn)行cDNA合成和基因定量檢測，引物采用NCBI網(wǎng)站上的Primer-BLAST程序(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)進(jìn)行設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL:Power SYBR?Green Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，共40個循環(huán)；55～95 ℃繪制熔解曲線。每個樣品重復(fù)3次，各個基因的相對表達(dá)水平以2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

表1 引物信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPPS 20.0中的非配對t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05和P<0.01作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用R軟件包進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 腹脂與腹脂率

由表2可知，H與L組的體重差異均不顯著(P>0.05),H組的腹脂重和腹脂率均極顯著高于L組(P<0.01)。

表2 各組體重、腹脂重與腹脂率

2.2 RNA測序結(jié)果

10個樣本中原始數(shù)據(jù)的平均值為52 472 860 bp，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理后平均每個樣本有51 479 286個高質(zhì)量數(shù)據(jù)，占原始數(shù)據(jù)的98.11%。Q30平均值為91.30%。將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為Ref，高質(zhì)量數(shù)據(jù)映射到Ref的平均映射率為80.11%(表3)。

表3 番鴨回腸轉(zhuǎn)錄組的序列質(zhì)量和比對信息

2.3 差異表達(dá)基因分析

兩組樣品中共檢測到31 517個基因，以P<0.05和log2|FoldChange|>1為閾值，共鑒定出602個差異表達(dá)基因，其中包括285個上調(diào)基因和317個下調(diào)基因(圖1)。根據(jù)每個樣本差異表達(dá)基因表達(dá)水平的log2(倍數(shù)變化)值進(jìn)行聚類分析，兩組樣品都顯示出了良好的重復(fù)性(圖2)。

①豎線是差異閾值的2倍，橫線是P=0.05閾值。②A象限的點(diǎn)表示下調(diào)基因，B象限的點(diǎn)表示上調(diào)基因，其余的點(diǎn)表示非差異表達(dá)基因①The vertical line is twice the difference threshold,and the horizontal line is the P=0.05 threshold. ②The dots in quadrant A represent down-regulated genes,those in quadrant B represent up-regulated genes,and the remaining dots represent non-differentially expressed genes圖1 H和L組差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes in H and L groups

①色標(biāo)表示RPKM歸一化的log2轉(zhuǎn)換計數(shù)。②單杠代表基因；垂直欄代表樣品。③顏色較深表示較高表達(dá)的基因，顏色較淺表示較低表達(dá)的基因①The color scale represents the log2 conversion count normalized by RPKM. ②The horizontal bar represents genes;The vertical bars represent samples. ③Darker colors indicate genes with higher expression,and lighter colors indicate genes with lower expression圖2 差異表達(dá)基因的聚類熱圖分析Fig.2 Clustering heat map analysis of differentially expressed genes

2.4 差異表達(dá)基因的功能富集分析

對602個差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO功能富集分析，包括生物過程、細(xì)胞成分和分子功能三大類，共有73個通路顯著富集(P<0.05)，篩選出5個與脂質(zhì)代謝相關(guān)的條目：脂質(zhì)應(yīng)答(response to lipid)、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路(steroid hormone mediated signaling pathway)、類固醇激素應(yīng)答(response to steroid hormone)、類固醇激素刺激的細(xì)胞應(yīng)答(cellular response to steroid hormone stimulus)和脂質(zhì)的細(xì)胞應(yīng)答(cellular response to lipid)，而且富集到這5個條目的差異表達(dá)基因是相同的(表4)。

表4 與脂質(zhì)代謝相關(guān)的GO條目

進(jìn)一步對602個差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，共有16個通路顯著表達(dá)(P<0.05，圖3)。其中PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、初級膽汁酸的生物合成(primary bile acid biosynthesis)、膽汁分泌(bile secretion)和花生四烯酸代謝通路(arachidonic acid metabolism)與脂肪代謝沉積相關(guān)(表5)。

Renin-angiotensin system，腎素-血管緊張素系統(tǒng)；Drug metabolism-other enzymes，藥物代謝-其他酶；Pentose and glucuronate interconversions，戊糖和葡萄糖酸酯的相互轉(zhuǎn)化；Histidine metabolism，組氨酸代謝；PPAR signaling pathway，PPAR信號通路；Glutathione metabolism，谷胱甘肽代謝；Chemical carcinogenesis，化學(xué)致癌作用；Primary bile acid biosynthesis，初級膽汁酸的生物合成；Pyrimidine metabolism，嘧啶代謝；Taurine and hypotaurine metabolism，?；撬岷偷团；撬岽x；Type Ⅱ diabetes mellitus，Ⅱ型糖尿??；Arachidonic acid metabolism，花生四烯酸代謝；Protein digestion and absorption，蛋白質(zhì)消化吸收；Bile secretion，膽汁分泌；Ascorbate and aldarate metabolism，抗壞血酸和醛酸代謝；Cytokine-cytokine receptor interaction，細(xì)胞因子細(xì)胞因子受體相互作用圖3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

表5 與脂肪代謝相關(guān)的KEGG通路

2.5 實(shí)時熒光定量PCR 驗證

為了驗證RNA-Seq結(jié)果的準(zhǔn)確性，共挑選了5個差異表達(dá)基因(ACBP、FABP2、FABP4、FABP5和ACOX2基因)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析。如圖4所示，H組這5個基因相對表達(dá)量均高于L組，但差異均不顯著(P>0.05)，與RNA-Seq結(jié)果一致。

2.6 相關(guān)性分析

通過對番鴨腹脂重和腹脂率與篩選出的基因進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腹脂重和腹脂率與NR5A2、ACBP、ACOX2、FABP2、FABP4和FABP5基因均呈正相關(guān)(r=0.47～0.87)。其中，ACOX2和FABP5基因與腹脂重和腹脂率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，ACBP基因與腹脂重和腹脂率呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)(圖5)。

圖4 實(shí)時熒光定量PCR驗證Fig.4 Validation of Real-time PCR

*，顯著相關(guān)(P<0.05)；**，極顯著相關(guān)(P<0.01)*，Significant correlation (P<0.05)；**，Extremely significant correlation (P<0.01)圖5 腹脂重和腹脂率與差異表達(dá)基因的相關(guān)性分析Fig.5 The correlation analysis of abdominal fat weight and abdominal fat rate with differentially expressed genes

3 討 論

家禽胴體脂肪含量過高會對其生產(chǎn)性能造成一定的影響，特別是肉用型家禽[16]。與肌內(nèi)脂肪不同，腹脂不能增加肉的風(fēng)味和口感，過高的腹脂含量只會造成飼料的浪費(fèi)[17]，因此如何調(diào)控番鴨的腹脂含量成為了一個亟待解決的問題。腹脂的形成與脂肪的代謝和沉積有很大的關(guān)系，可以通過調(diào)控脂肪的代謝和沉積來影響腹脂的生成。脂肪是體內(nèi)重要的能量來源和能量貯備形式，在體內(nèi)的能量動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用[18]。家禽脂肪細(xì)胞的自身合成能力有限，其脂肪來源主要是肝臟的合成以及腸道外源脂肪的吸收[19]。動物采食后，其中的脂類分子會被腸道吸收，經(jīng)門脈系統(tǒng)被運(yùn)送至血液，儲存于脂肪組織中(如腹脂)[20]。因此，本試驗對番鴨的回腸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共篩選出602個差異表達(dá)基因。通過GO功能和KEGG富集分析，篩選出與脂肪代謝相關(guān)的5個GO通路、4個KEGG通路和6個基因(NR5A2、ACBP、ACOX2、FABP2、FABP4和FABP5基因)。

GO富集分析發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)應(yīng)答、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、類固醇激素應(yīng)答、類固醇激素刺激的細(xì)胞應(yīng)答和脂質(zhì)的細(xì)胞應(yīng)答5個條目與脂肪代謝相關(guān)，其中5個條目富集的基因是相同的，只有NR5A2基因參與了脂肪的代謝，其他基因與脂肪代謝之間的關(guān)系尚不明確。核受體通過調(diào)節(jié)參與膽汁酸合成、膽固醇穩(wěn)態(tài)和甘油三酯合成的基因的表達(dá)，是一個關(guān)鍵的代謝傳感器[21]。與氧化甾醇受體NR1H3/LXR-alpha和NR1H2/LXR-beta一起，是脂質(zhì)代謝的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[22]。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，有4個與脂肪代謝相關(guān)的通路：PPAR信號通路、初級膽汁酸的生物合成、花生四烯酸代謝和膽汁分泌。PPAR信號通路主要參與調(diào)控脂肪酸代謝、糖代謝、細(xì)胞增殖與分化等[23]。FABP2、FABP4、FABP5、ACBP和ACOX2等與脂肪代謝相關(guān)的基因在此通路富集表達(dá)。FABP4是脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding proteins，F(xiàn)ABPs)家族中的一員，對機(jī)體的脂質(zhì)代謝有重要的調(diào)控作用，一方面它能促進(jìn)血液內(nèi)的脂肪酸向細(xì)胞膜流動；另一方面又能通過結(jié)合脂肪酸來調(diào)控脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)[24]。該基因在H組得到上調(diào)，說明其在H組中得到較高的表達(dá)。同屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族的FABP2和FABP5也在H組上調(diào)表達(dá)。其中FABP2主要存在于小腸細(xì)胞中，但在回腸中表達(dá)最高，參與了從腸腔中吸收脂肪酸的過程，負(fù)責(zé)長鏈脂肪酸的吸收、運(yùn)輸與代謝[25-26]。研究表明，F(xiàn)ABP5通過影響脂質(zhì)代謝從而發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，廣泛參與攝取和運(yùn)輸長鏈脂肪酸，基因調(diào)控、細(xì)胞生長和分化[27]。研究表明，ACBP可以刺激食欲，與人的肥胖也息息相關(guān)[28]。此外，研究結(jié)果表明，胞質(zhì)外的ACBP在調(diào)節(jié)攝食行為以及葡萄糖和脂質(zhì)代謝過程中起關(guān)鍵作用[29]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)該基因在H組的表達(dá)高于L組，與上述研究結(jié)果一致。ACOX2基因在H組上調(diào)表達(dá)，其參與脂肪酸代謝、脂蛋白代謝和膽汁酸合成以及過氧化物脂類代謝，在脂肪酸代謝途徑中高表達(dá)，是脂肪酸代謝過程中重要的調(diào)控基因[30]。ACOX2基因又被稱作過氧化物酶支鏈酰輔酶A氧化酶2，在過氧化物酶體中，該基因作為一種限速酶，在支鏈脂肪酸β氧化過程中催化不飽和脂肪酸氧化，將長鏈脂肪酸氧化生成短鏈脂肪酸[31]。此外，該基因還會催化膽固醇形成膽汁酸，而后者可以通過影響葡萄糖代謝以及脂質(zhì)和能量的消耗,從而調(diào)控組織內(nèi)脂肪酸的含量[32]。

4 結(jié) 論

本試驗通過對高、低腹脂率番鴨回腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)共有602個差異表達(dá)基因，其中包括285個上調(diào)基因和317個下調(diào)基因。差異基因主要富集于5個與脂肪代謝相關(guān)的GO通路(脂質(zhì)應(yīng)答、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、類固醇激素應(yīng)答、類固醇激素刺激的細(xì)胞應(yīng)答和脂質(zhì)的細(xì)胞應(yīng)答)和4個KEGG通路(PPAR信號通路、初級膽汁酸的生物合成、花生四烯酸代謝和膽汁分泌)。此外，篩選出了6個與脂肪代謝顯著相關(guān)的基因：NR5A2、ACBP、ACOX2、FABP2、FABP4和FABP5，其中，ACOX2和FABP5與腹脂重和腹脂率呈顯著正相關(guān)，ACBP與腹脂重和腹脂率呈極顯著正相關(guān)。此研究填補(bǔ)了番鴨回腸組織中調(diào)控脂肪代謝沉積基因的空白，為后續(xù)腹脂沉積的調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。