利用單堿基編輯器定點(diǎn)突變豬肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的研究

王 晶，朱 喆，張 鵬，畢延震

(1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物胚胎工程與分子育種湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064)

中國(guó)豬種質(zhì)資源豐富，占全世界1/3左右。寧鄉(xiāng)花豬是中國(guó)本土著名品種，具有肌內(nèi)脂肪含量高、繁殖力高、抗病抗逆性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，但其生長(zhǎng)速度、飼料報(bào)酬和瘦肉率低等缺點(diǎn)限制了該品種在市場(chǎng)中的發(fā)展。因此，如何在規(guī)避缺點(diǎn)的同時(shí)最大化利用其內(nèi)在優(yōu)勢(shì)，對(duì)寧鄉(xiāng)花豬乃至整個(gè)地方豬養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展有著重要意義。

傳統(tǒng)豬遺傳育種周期長(zhǎng)且成本高。目前，以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良性狀的研究，該方法在豬種質(zhì)資源創(chuàng)新中具有重要意義[1-2]。在CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中，sgRNA與Cas9蛋白形成的復(fù)合物會(huì)切割靶DNA，導(dǎo)致靶DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)，DSB是最嚴(yán)重的DNA損傷形式之一，可能會(huì)引起染色體結(jié)構(gòu)異?；蛉笔?，擾亂細(xì)胞正常功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3-4]。因此，如何能在不產(chǎn)生DSB的情況下進(jìn)行精準(zhǔn)編輯成為亟需解決的難題。2016年，以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的單堿基編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)在不造成DSB的情況下精準(zhǔn)突變單個(gè)堿基，其原理是將失去切割活性的核酸酶Cas9蛋白(deactiaved Cas9，dCas9)和作用于單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)堿基的脫氨酶融合，依靠sgRNA將堿基編輯酶錨定到靶位點(diǎn)上，從而使局部ssDNA上的胞嘧啶(cytosine，C)或腺嘌呤(adenine，A)脫氨，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)C→T或A→G替換[5],其中，胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor，CBE)可以將密碼子(CAA、CAG、CGA或TGG)精準(zhǔn)轉(zhuǎn)換成終止密碼子(TAG、TAA或TGA)來(lái)阻止翻譯[6]。與傳統(tǒng)CRISPR/Cas9技術(shù)相比，單堿基編輯器能在避免發(fā)生DSB及堿基缺失或增加的情況下實(shí)現(xiàn)基因突變，減少DNA損傷和細(xì)胞死亡[5]。近年來(lái)，科學(xué)家致力于改進(jìn)堿基編輯器，已經(jīng)產(chǎn)生了具有高編輯效率[7]、窄編輯窗口和廣泛前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)識(shí)別位點(diǎn)的多種變體[8]，且應(yīng)用于多種動(dòng)物基因編輯[9-11]。

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)又稱生長(zhǎng)分化因子8，主要在骨骼肌中表達(dá)，對(duì)肌肉發(fā)育和再生具有負(fù)調(diào)控作用[12]。MSTN基因自然突變會(huì)使牛表現(xiàn)出“雙肌”性狀[12]，而寧鄉(xiāng)花豬在自然情況下不存在MSTN基因有益突變。研究發(fā)現(xiàn)，人為敲除MSTN基因會(huì)導(dǎo)致豬背膘厚度下降，脂肪含量減少[13]，證明了運(yùn)用基因編輯的方法進(jìn)行遺傳改良是有效的。因此，本研究利用單堿基編輯技術(shù)編輯寧鄉(xiāng)花豬的MSTN基因，利用CBE在基因編碼區(qū)定向引入終止密碼子，建立基因敲除的單堿基編輯體系，為培育MSTN堿基編輯豬奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

寧鄉(xiāng)花豬來(lái)源于湖南楚溈香農(nóng)牧股份有限公司保種場(chǎng)。單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈(zèng)送。pMLM3636-puro由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所合成保存；DNA Ladder和Premix酶均購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Scientific公司；嘌呤霉素由Biosharp提供；DMEM和DPBS均購(gòu)自HyClone公司；血清購(gòu)自Invigentech公司。

1.2 方法

1.2.1 寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 取7日齡寧鄉(xiāng)花豬，用靜脈注射法致死，75%乙醇溶液消毒全身，酒精棉球擦拭腹部后，用手術(shù)刀割開豬腹部，取出腎組織，用生理鹽水清洗5～6次，再用含1%雙抗(青霉素和鏈霉素混合溶液)的DPBS清洗，將組織放入培養(yǎng)皿中，剪去表面膜，將腎組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，用槍頭吸取將組織塊均勻鋪在6孔板中。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱倒置1 h后，加入2 mL完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1%雙抗)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換一次液，5～7 d后去除組織塊。

1.2.2 sgRNA及檢測(cè)引物設(shè)計(jì) 在寧鄉(xiāng)花豬MSTN基因第2外顯子(Chromosome 15，GeneID:399534)處設(shè)計(jì)sgRNA。sgRNA的設(shè)計(jì)滿足以下條件：①sgRNA的長(zhǎng)度為20 bp，PAM序列為NGG；②遠(yuǎn)離PAM位點(diǎn)的4—8 bp處，正義鏈需要有C，反義鏈需要有G；③轉(zhuǎn)變后的堿基(C→T或G→A)與相鄰堿基可以將原有氨基酸轉(zhuǎn)變成終止密碼子(TAA、TAG、TGA)；④sgRNA的GC含量在40%～60%之間。以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)sgRNA(表1)，并在正義鏈的5′-端添加ACACC酶切位點(diǎn)，反義鏈5′-端添加AAAAC保護(hù)堿基。根據(jù)MSTN基因序列，運(yùn)用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)MSTN基因擴(kuò)增序列引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3 sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建 將sgRNA插入多克隆位點(diǎn)5′-BsmBI-3′之間，pMLM3636-puro質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BsmBⅠ酶切后，用膠回收試劑盒回收切割成功的酶切產(chǎn)物。將合成的sgRNA稀釋成10 μmol/L后退火形成雙鏈，反應(yīng)體系20 μL：sgRNA-F 1 μL，sgRNA-R 1 μL，10×NEB Buffer 2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；37 ℃，1 h；4 ℃保存。將線性化的pMLM3636-puro載體與雙鏈sgRNA連接，反應(yīng)體系10 μL：線性化pMLM3636-puro 1 μL，sgRNA 3 μL，Solution Ⅰ 5 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。置于37 ℃恒溫水浴鍋中連接5 h，構(gòu)建PMLM3636-puro-MSTN;將連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，活化后均勻涂布在含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)皿上，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，搖菌后將菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證；利用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，通過(guò)凝膠電泳判斷pMLM3636-puro和pMLM3636-puro-MSTN大小。

1.2.4 電轉(zhuǎn)液配制 配制10×電轉(zhuǎn)液：KCl 4.473 g，CaCl20.0083425 g，Hepes 2.9787 g，EDTA 0.37224 g，無(wú)水MgCl20.238 g，K2HPO41.14 g，調(diào)節(jié)pH為7.6，加ddH2O定容至50 mL，于4 ℃保存。使用前用ddH2O稀釋為1×電轉(zhuǎn)液，0.22 μm濾器過(guò)濾，分裝后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 電轉(zhuǎn)染寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細(xì)胞 將寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細(xì)胞復(fù)蘇并置于6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，1 min后，加入適量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞，至細(xì)胞分散，收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中；1 000 r/min離心2 min，棄去上清液，依次用DPBS和電轉(zhuǎn)液吹打洗滌，離心后棄去上清液，將提前準(zhǔn)備好的質(zhì)粒(YE1-BE3-FNLS：6 μg，pMLM3636-puro-MSTN：3 μg)、細(xì)胞沉淀和電轉(zhuǎn)液共100 μL轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)條件：220 V，3 ms，1 pulse；電轉(zhuǎn)完成后將電轉(zhuǎn)杯中的液體全部吸取接種于100 mm的培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)加入嘌呤霉素進(jìn)行藥篩，并觀察熒光表達(dá)情況。利用Image J軟件計(jì)算不同視野下帶有紅色熒光的細(xì)胞占該視野下所有細(xì)胞的比例，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率(整體平均值)。

1.2.6 單克隆細(xì)胞挑取和Sanger測(cè)序分析 藥篩72 h后，更換新鮮含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每3 d換一次液，培養(yǎng)7 d后，挑取單克隆細(xì)胞至48孔板，待48孔板長(zhǎng)滿后，傳代至24孔板，分別取200 μL單克隆細(xì)胞和野生型細(xì)胞懸液，用細(xì)胞裂解液裂解后直接作為PCR模板，使用檢測(cè)引物擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PremixTaq12.5 μL，DNA模板 1 μL，MSTN-F 1 μL，MSTN-R 1 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 min，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.7 Western blotting檢測(cè)MSTN蛋白的表達(dá)情況 將野生型細(xì)胞和陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞，離心后加入蛋白裂解液，冰浴30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液。測(cè)定蛋白濃度后按比例加入適量SDS和RIPA混勻，95 ℃ 10 min，蛋白變性后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?20 V、1.5 h條件下進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF固態(tài)膜上，再經(jīng)5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后滴加顯色液后顯影。采用Image J軟件對(duì)Western blotting結(jié)果進(jìn)行量化分析，以β-tubulin作為內(nèi)參對(duì)照。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)分析差異顯著性，以P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

采用組織貼壁法分離寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)3 d后可以明顯觀察組織塊周圍有細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞以紡錘形為主，形態(tài)不均一，生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)7 d后，除去組織塊，將剩余細(xì)胞傳代至6孔板中，2 d后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，邊緣清晰，形態(tài)均一，生長(zhǎng)力旺盛(圖1)，說(shuō)明成功分離獲得寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細(xì)胞。

A，原代培養(yǎng)；B，F(xiàn)2傳代培養(yǎng)A，Primary culture;B，F(xiàn)2 subculture圖1 寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.1 Morphology of kidney fibroblasts in Ningxiang pig (100×)

2.2 構(gòu)建sgRNA表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細(xì)胞

測(cè)序結(jié)果顯示，pMLM3636-puro-MSTN質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。采用電轉(zhuǎn)染的方法將單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS和重組表達(dá)載體pMLM3636-puro-MSTN共轉(zhuǎn)染至腎成纖維細(xì)胞，24 h后觀察紅色熒光表達(dá)情況(圖3)，利用Image J軟件計(jì)算轉(zhuǎn)染效率為67.4%。

2.3 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞篩選和基因靶位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)挑取至24孔板中培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，MSTN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為346 bp(圖4A)。Sanger測(cè)序結(jié)果表明，55個(gè)單克隆細(xì)胞中，有3個(gè)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生突變，目標(biāo)位點(diǎn)突變率為5.5%(3/55)(圖4A)，其中僅10號(hào)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)附近無(wú)脫靶現(xiàn)象。另外，有9個(gè)在非目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生突變，非目標(biāo)位點(diǎn)突變率為16.4%(9/55)(圖4B)，其中非目標(biāo)突變位點(diǎn)在第3位，并不在傳統(tǒng)的堿基編輯窗口(4—8 bp)之內(nèi)。

2.4 Western blotting檢測(cè)MSTN蛋白的表達(dá)

為進(jìn)一步確定MSTN基因敲除的可靠性，選擇僅含目標(biāo)突變的10號(hào)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。由圖5可知，以β-tubulin為內(nèi)參，與野生型相比，試驗(yàn)組10號(hào)單克隆細(xì)胞MSTN蛋白表達(dá)量下降約60%。說(shuō)明在MSTN第2外顯子產(chǎn)生的終止密碼子能夠有效降低MSTN蛋白水平。

M，15000 bp DNA Marker；1，pMLM3636-puro；2，pMLM3636-puro-MSTN圖2 pMLM3636-puro-MSTN質(zhì)粒的電泳圖(A)和測(cè)序峰圖(B)Fig.2 Electropherogram (A) and sequencing map (B) of pMLM3636-puro-MSTN plasmid

圖3 電轉(zhuǎn)染24 h后紅色熒光表達(dá)情況(100×)Fig.3 Expression of red fluorescence after electransfection for 24 h (100×)

①A，目標(biāo)突變單克隆細(xì)胞電泳圖和測(cè)序峰圖；B，非目標(biāo)突變單克隆細(xì)胞測(cè)序峰圖。②M，100 bp DNA Ladder；WT，野生型；數(shù)字10、25、51、3、6、7、9、15、20和36，突變單克隆細(xì)胞編號(hào)①A，Electrophoretogram and sequencing map of target mutant monoclonal cells；B,Sequencing map of non-target mutant monoclonal cells.②M，100 bp DNA Ladder；WT，Wild type；Numbers 10,25,51,3,6,7,9,15,20 and 36，The mutant monoclonal cell number,respectively圖4 靶位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.4 Sequencing map of target sites

①WT，野生型；10，10號(hào)單克隆細(xì)胞。②**，差異極顯著(P<0.01)①WT，Wild type;10，No.10 single clone.②**，Extremely significant difference (P<0.01)圖5 Western blotting檢測(cè)MSTN蛋白表達(dá)量Fig.5 MSTN protein expression levels detected by Western blotting

3 討 論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于畜禽的改良育種方面，但該技術(shù)也面臨著一些問(wèn)題，Cas9蛋白可以在不依賴sgRNA的情況下突變基因組，引起DSB的產(chǎn)生，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定；其次，CRISPR/Cas9技術(shù)導(dǎo)致DSB而誘發(fā)的同源重組修復(fù)途徑需要同源模板的參與才能實(shí)現(xiàn)堿基的精準(zhǔn)替換，而如何選擇供體模板形式和遞送方式是目前存在的難題[14]。2016年，Komor等[5]利用dCas9蛋白，結(jié)合脫氨酶開發(fā)了單堿基編輯器，該工具能在避免雙鏈DNA斷裂且無(wú)需供體DNA的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA進(jìn)行精確的點(diǎn)突變，具有更高的精確度和安全性。

本研究使用單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS在MSTN基因第2外顯子上人為引入終止密碼子。目標(biāo)位點(diǎn)G(C)→A(T)為C6和C7，編輯效率為5.5%。研究發(fā)現(xiàn)，利用“all-in-one”修飾的CBE得到的1個(gè)使MSTN基因提前終止的巴馬豬的單克隆細(xì)胞系，編輯效率為5.6%[15]，與本試驗(yàn)結(jié)果相近。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，利用YE1-BE3-FNLS編輯HEK 293T細(xì)胞，在C5～C7位點(diǎn)的平均編輯效率為78.3%[16]。因此，將堿基編輯器用于編輯哺乳動(dòng)物體細(xì)胞時(shí)，應(yīng)該注意細(xì)胞類型對(duì)編輯效率的影響。

除此之外，在目標(biāo)位點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)了脫靶現(xiàn)象，C3位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了G(C)→A(T)突變，編輯效率為16.4%，高于目標(biāo)位點(diǎn)。推測(cè)可能與目標(biāo)突變位點(diǎn)的序列有關(guān)。本研究目標(biāo)突變位點(diǎn)的序列為5′-C(G)-GG(CC)-T(A)-3′(CC為突變位點(diǎn))，C之前的堿基為G，而非目標(biāo)突變位點(diǎn)的序列為5′-A(T)-G(C)-A(T)-3′，且C之前堿基為T，該編輯器使用的脫氨酶是rAPOBEC1，其脫氨酶脫氨效率為TC>CC>GC[5]，這解釋了C3的編輯效率大于目標(biāo)位點(diǎn)C6和C7的原因。因此，在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)應(yīng)該注意目標(biāo)位點(diǎn)附近的堿基序列，減少脫靶現(xiàn)象發(fā)生。研究證明，腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor，ABE)的特異性高于CBE[17]，Jeong等[18]通過(guò)改造ABE得到的ABE7.10(P48R)變體，發(fā)現(xiàn)其具有更高的脫氨率和較低的腺嘌呤編輯率，它還可以實(shí)現(xiàn)TC→TT或TC→TG的替換，因此，利用ABE引入終止密碼子是降低脫靶率的潛在方法之一。綜上所述，針對(duì)CBE堿基編輯器在體細(xì)胞中編輯效率較低且在高C位點(diǎn)易脫靶的問(wèn)題，筆者認(rèn)為，鑒于ABE比CBE具有更高編輯效率和較低的脫靶率，因此可以利用ABE堿基編輯器人工創(chuàng)造終止密碼子。

4 結(jié) 論

本研究利用電轉(zhuǎn)染的方法將pMLM3636-puro-MSTN和YE1-BE3-FNLS共轉(zhuǎn)入寧鄉(xiāng)花豬的腎成纖維細(xì)胞中，在紅色熒光和嘌呤霉素雙篩選的情況下，獲得了陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。結(jié)果顯示，在MSTN基因第2外顯子處成功引入終止密碼子，且目標(biāo)位點(diǎn)G→A的編輯效率為5.5%。與野生型相比，試驗(yàn)組10號(hào)單克隆細(xì)胞MSTN蛋白的表達(dá)量降低約60%。本研究成功運(yùn)用了單堿基編輯技術(shù)在寧鄉(xiāng)花豬MSTN基因編碼區(qū)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)編輯，為后期生產(chǎn)瘦肉率高的堿基突變豬奠定基礎(chǔ)。