王 晶,朱 喆,張 鵬,畢延震
(1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢 430074;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物胚胎工程與分子育種湖北重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064)
中國(guó)豬種質(zhì)資源豐富,占全世界1/3左右。寧鄉(xiāng)花豬是中國(guó)本土著名品種,具有肌內(nèi)脂肪含量高、繁殖力高、抗病抗逆性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),但其生長(zhǎng)速度、飼料報(bào)酬和瘦肉率低等缺點(diǎn)限制了該品種在市場(chǎng)中的發(fā)展。因此,如何在規(guī)避缺點(diǎn)的同時(shí)最大化利用其內(nèi)在優(yōu)勢(shì),對(duì)寧鄉(xiāng)花豬乃至整個(gè)地方豬養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展有著重要意義。
傳統(tǒng)豬遺傳育種周期長(zhǎng)且成本高。目前,以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良性狀的研究,該方法在豬種質(zhì)資源創(chuàng)新中具有重要意義[1-2]。在CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)中,sgRNA與Cas9蛋白形成的復(fù)合物會(huì)切割靶DNA,導(dǎo)致靶DNA雙鏈斷裂(double strand breaks,DSB),DSB是最嚴(yán)重的DNA損傷形式之一,可能會(huì)引起染色體結(jié)構(gòu)異?;蛉笔?,擾亂細(xì)胞正常功能,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3-4]。因此,如何能在不產(chǎn)生DSB的情況下進(jìn)行精準(zhǔn)編輯成為亟需解決的難題。2016年,以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的單堿基編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,該技術(shù)在不造成DSB的情況下精準(zhǔn)突變單個(gè)堿基,其原理是將失去切割活性的核酸酶Cas9蛋白(deactiaved Cas9,dCas9)和作用于單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)堿基的脫氨酶融合,依靠sgRNA將堿基編輯酶錨定到靶位點(diǎn)上,從而使局部ssDNA上的胞嘧啶(cytosine,C)或腺嘌呤(adenine,A)脫氨,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)C→T或A→G替換[5],其中,胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor,CBE)可以將密碼子(CAA、CAG、CGA或TGG)精準(zhǔn)轉(zhuǎn)換成終止密碼子(TAG、TAA或TGA)來(lái)阻止翻譯[6]。與傳統(tǒng)CRISPR/Cas9技術(shù)相比,單堿基編輯器能在避免發(fā)生DSB及堿基缺失或增加的情況下實(shí)現(xiàn)基因突變,減少DNA損傷和細(xì)胞死亡[5]。近年來(lái),科學(xué)家致力于改進(jìn)堿基編輯器,已經(jīng)產(chǎn)生了具有高編輯效率[7]、窄編輯窗口和廣泛前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)識(shí)別位點(diǎn)的多種變體[8],且應(yīng)用于多種動(dòng)物基因編輯[9-11]。
肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin,MSTN)又稱生長(zhǎng)分化因子8,主要在骨骼肌中表達(dá),對(duì)肌肉發(fā)育和再生具有負(fù)調(diào)控作用[12]。MSTN基因自然突變會(huì)使牛表現(xiàn)出“雙肌”性狀[12],而寧鄉(xiāng)花豬在自然情況下不存在MSTN基因有益突變。研究發(fā)現(xiàn),人為敲除MSTN基因會(huì)導(dǎo)致豬背膘厚度下降,脂肪含量減少[13],證明了運(yùn)用基因編輯的方法進(jìn)行遺傳改良是有效的。因此,本研究利用單堿基編輯技術(shù)編輯寧鄉(xiāng)花豬的MSTN基因,利用CBE在基因編碼區(qū)定向引入終止密碼子,建立基因敲除的單堿基編輯體系,為培育MSTN堿基編輯豬奠定基礎(chǔ)。
寧鄉(xiāng)花豬來(lái)源于湖南楚溈香農(nóng)牧股份有限公司保種場(chǎng)。單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈(zèng)送。pMLM3636-puro由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所合成保存;DNA Ladder和Premix酶均購(gòu)自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Scientific公司;嘌呤霉素由Biosharp提供;DMEM和DPBS均購(gòu)自HyClone公司;血清購(gòu)自Invigentech公司。
1.2.1 寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 取7日齡寧鄉(xiāng)花豬,用靜脈注射法致死,75%乙醇溶液消毒全身,酒精棉球擦拭腹部后,用手術(shù)刀割開豬腹部,取出腎組織,用生理鹽水清洗5~6次,再用含1%雙抗(青霉素和鏈霉素混合溶液)的DPBS清洗,將組織放入培養(yǎng)皿中,剪去表面膜,將腎組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊,用槍頭吸取將組織塊均勻鋪在6孔板中。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱倒置1 h后,加入2 mL完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+1%雙抗),繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2 d換一次液,5~7 d后去除組織塊。
1.2.2 sgRNA及檢測(cè)引物設(shè)計(jì) 在寧鄉(xiāng)花豬MSTN基因第2外顯子(Chromosome 15,GeneID:399534)處設(shè)計(jì)sgRNA。sgRNA的設(shè)計(jì)滿足以下條件:①sgRNA的長(zhǎng)度為20 bp,PAM序列為NGG;②遠(yuǎn)離PAM位點(diǎn)的4—8 bp處,正義鏈需要有C,反義鏈需要有G;③轉(zhuǎn)變后的堿基(C→T或G→A)與相鄰堿基可以將原有氨基酸轉(zhuǎn)變成終止密碼子(TAA、TAG、TGA);④sgRNA的GC含量在40%~60%之間。以此為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)sgRNA(表1),并在正義鏈的5′-端添加ACACC酶切位點(diǎn),反義鏈5′-端添加AAAAC保護(hù)堿基。根據(jù)MSTN基因序列,運(yùn)用Primer Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)MSTN基因擴(kuò)增序列引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 引物信息
1.2.3 sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建 將sgRNA插入多克隆位點(diǎn)5′-BsmBI-3′之間,pMLM3636-puro質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BsmBⅠ酶切后,用膠回收試劑盒回收切割成功的酶切產(chǎn)物。將合成的sgRNA稀釋成10 μmol/L后退火形成雙鏈,反應(yīng)體系20 μL:sgRNA-F 1 μL,sgRNA-R 1 μL,10×NEB Buffer 2 μL,用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃,5 min;37 ℃,1 h;4 ℃保存。將線性化的pMLM3636-puro載體與雙鏈sgRNA連接,反應(yīng)體系10 μL:線性化pMLM3636-puro 1 μL,sgRNA 3 μL,Solution Ⅰ 5 μL,ddH2O補(bǔ)足至10 μL。置于37 ℃恒溫水浴鍋中連接5 h,構(gòu)建PMLM3636-puro-MSTN;將連接好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,活化后均勻涂布在含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)皿上,37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng),挑取單菌落,搖菌后將菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證;利用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒,通過(guò)凝膠電泳判斷pMLM3636-puro和pMLM3636-puro-MSTN大小。
1.2.4 電轉(zhuǎn)液配制 配制10×電轉(zhuǎn)液:KCl 4.473 g,CaCl20.0083425 g,Hepes 2.9787 g,EDTA 0.37224 g,無(wú)水MgCl20.238 g,K2HPO41.14 g,調(diào)節(jié)pH為7.6,加ddH2O定容至50 mL,于4 ℃保存。使用前用ddH2O稀釋為1×電轉(zhuǎn)液,0.22 μm濾器過(guò)濾,分裝后,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 電轉(zhuǎn)染寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細(xì)胞 將寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細(xì)胞復(fù)蘇并置于6孔板中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí),用0.25%胰酶消化細(xì)胞,1 min后,加入適量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,吹打細(xì)胞,至細(xì)胞分散,收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中;1 000 r/min離心2 min,棄去上清液,依次用DPBS和電轉(zhuǎn)液吹打洗滌,離心后棄去上清液,將提前準(zhǔn)備好的質(zhì)粒(YE1-BE3-FNLS:6 μg,pMLM3636-puro-MSTN:3 μg)、細(xì)胞沉淀和電轉(zhuǎn)液共100 μL轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中,電轉(zhuǎn)條件:220 V,3 ms,1 pulse;電轉(zhuǎn)完成后將電轉(zhuǎn)杯中的液體全部吸取接種于100 mm的培養(yǎng)皿中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基,同時(shí)加入嘌呤霉素進(jìn)行藥篩,并觀察熒光表達(dá)情況。利用Image J軟件計(jì)算不同視野下帶有紅色熒光的細(xì)胞占該視野下所有細(xì)胞的比例,并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率(整體平均值)。
1.2.6 單克隆細(xì)胞挑取和Sanger測(cè)序分析 藥篩72 h后,更換新鮮含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,每3 d換一次液,培養(yǎng)7 d后,挑取單克隆細(xì)胞至48孔板,待48孔板長(zhǎng)滿后,傳代至24孔板,分別取200 μL單克隆細(xì)胞和野生型細(xì)胞懸液,用細(xì)胞裂解液裂解后直接作為PCR模板,使用檢測(cè)引物擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL:2×PremixTaq12.5 μL,DNA模板 1 μL,MSTN-F 1 μL,MSTN-R 1 μL,補(bǔ)充ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 min,72 ℃延伸1 min,共32個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸7 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。
1.2.7 Western blotting檢測(cè)MSTN蛋白的表達(dá)情況 將野生型細(xì)胞和陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),收集細(xì)胞,離心后加入蛋白裂解液,冰浴30 min后,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,收集上清液。測(cè)定蛋白濃度后按比例加入適量SDS和RIPA混勻,95 ℃ 10 min,蛋白變性后,-20 ℃保存?zhèn)溆?。?20 V、1.5 h條件下進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白,聚丙烯酰胺凝膠濃度為10%,電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF固態(tài)膜上,再經(jīng)5%脫脂奶粉常溫封閉2 h,一抗孵育2 h,二抗孵育1 h,最后滴加顯色液后顯影。采用Image J軟件對(duì)Western blotting結(jié)果進(jìn)行量化分析,以β-tubulin作為內(nèi)參對(duì)照。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)分析差異顯著性,以P<0.01表示差異極顯著。
采用組織貼壁法分離寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)3 d后可以明顯觀察組織塊周圍有細(xì)胞生長(zhǎng),細(xì)胞以紡錘形為主,形態(tài)不均一,生長(zhǎng)旺盛,培養(yǎng)7 d后,除去組織塊,將剩余細(xì)胞傳代至6孔板中,2 d后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞呈現(xiàn)梭形,邊緣清晰,形態(tài)均一,生長(zhǎng)力旺盛(圖1),說(shuō)明成功分離獲得寧鄉(xiāng)花豬腎原代成纖維細(xì)胞。
A,原代培養(yǎng);B,F(xiàn)2傳代培養(yǎng)A,Primary culture;B,F(xiàn)2 subculture圖1 寧鄉(xiāng)花豬腎成纖維細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.1 Morphology of kidney fibroblasts in Ningxiang pig (100×)
測(cè)序結(jié)果顯示,pMLM3636-puro-MSTN質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。采用電轉(zhuǎn)染的方法將單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS和重組表達(dá)載體pMLM3636-puro-MSTN共轉(zhuǎn)染至腎成纖維細(xì)胞,24 h后觀察紅色熒光表達(dá)情況(圖3),利用Image J軟件計(jì)算轉(zhuǎn)染效率為67.4%。
對(duì)挑取至24孔板中培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示,MSTN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為346 bp(圖4A)。Sanger測(cè)序結(jié)果表明,55個(gè)單克隆細(xì)胞中,有3個(gè)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生突變,目標(biāo)位點(diǎn)突變率為5.5%(3/55)(圖4A),其中僅10號(hào)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞在目標(biāo)位點(diǎn)附近無(wú)脫靶現(xiàn)象。另外,有9個(gè)在非目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生突變,非目標(biāo)位點(diǎn)突變率為16.4%(9/55)(圖4B),其中非目標(biāo)突變位點(diǎn)在第3位,并不在傳統(tǒng)的堿基編輯窗口(4—8 bp)之內(nèi)。
為進(jìn)一步確定MSTN基因敲除的可靠性,選擇僅含目標(biāo)突變的10號(hào)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。由圖5可知,以β-tubulin為內(nèi)參,與野生型相比,試驗(yàn)組10號(hào)單克隆細(xì)胞MSTN蛋白表達(dá)量下降約60%。說(shuō)明在MSTN第2外顯子產(chǎn)生的終止密碼子能夠有效降低MSTN蛋白水平。
M,15000 bp DNA Marker;1,pMLM3636-puro;2,pMLM3636-puro-MSTN圖2 pMLM3636-puro-MSTN質(zhì)粒的電泳圖(A)和測(cè)序峰圖(B)Fig.2 Electropherogram (A) and sequencing map (B) of pMLM3636-puro-MSTN plasmid
圖3 電轉(zhuǎn)染24 h后紅色熒光表達(dá)情況(100×)Fig.3 Expression of red fluorescence after electransfection for 24 h (100×)
①A,目標(biāo)突變單克隆細(xì)胞電泳圖和測(cè)序峰圖;B,非目標(biāo)突變單克隆細(xì)胞測(cè)序峰圖。②M,100 bp DNA Ladder;WT,野生型;數(shù)字10、25、51、3、6、7、9、15、20和36,突變單克隆細(xì)胞編號(hào)①A,Electrophoretogram and sequencing map of target mutant monoclonal cells;B,Sequencing map of non-target mutant monoclonal cells.②M,100 bp DNA Ladder;WT,Wild type;Numbers 10,25,51,3,6,7,9,15,20 and 36,The mutant monoclonal cell number,respectively圖4 靶位點(diǎn)測(cè)序峰圖Fig.4 Sequencing map of target sites
①WT,野生型;10,10號(hào)單克隆細(xì)胞。②**,差異極顯著(P<0.01)①WT,Wild type;10,No.10 single clone.②**,Extremely significant difference (P<0.01)圖5 Western blotting檢測(cè)MSTN蛋白表達(dá)量Fig.5 MSTN protein expression levels detected by Western blotting
CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于畜禽的改良育種方面,但該技術(shù)也面臨著一些問(wèn)題,Cas9蛋白可以在不依賴sgRNA的情況下突變基因組,引起DSB的產(chǎn)生,導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定;其次,CRISPR/Cas9技術(shù)導(dǎo)致DSB而誘發(fā)的同源重組修復(fù)途徑需要同源模板的參與才能實(shí)現(xiàn)堿基的精準(zhǔn)替換,而如何選擇供體模板形式和遞送方式是目前存在的難題[14]。2016年,Komor等[5]利用dCas9蛋白,結(jié)合脫氨酶開發(fā)了單堿基編輯器,該工具能在避免雙鏈DNA斷裂且無(wú)需供體DNA的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA進(jìn)行精確的點(diǎn)突變,具有更高的精確度和安全性。
本研究使用單堿基編輯器YE1-BE3-FNLS在MSTN基因第2外顯子上人為引入終止密碼子。目標(biāo)位點(diǎn)G(C)→A(T)為C6和C7,編輯效率為5.5%。研究發(fā)現(xiàn),利用“all-in-one”修飾的CBE得到的1個(gè)使MSTN基因提前終止的巴馬豬的單克隆細(xì)胞系,編輯效率為5.6%[15],與本試驗(yàn)結(jié)果相近。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,利用YE1-BE3-FNLS編輯HEK 293T細(xì)胞,在C5~C7位點(diǎn)的平均編輯效率為78.3%[16]。因此,將堿基編輯器用于編輯哺乳動(dòng)物體細(xì)胞時(shí),應(yīng)該注意細(xì)胞類型對(duì)編輯效率的影響。
除此之外,在目標(biāo)位點(diǎn)附近發(fā)現(xiàn)了脫靶現(xiàn)象,C3位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了G(C)→A(T)突變,編輯效率為16.4%,高于目標(biāo)位點(diǎn)。推測(cè)可能與目標(biāo)突變位點(diǎn)的序列有關(guān)。本研究目標(biāo)突變位點(diǎn)的序列為5′-C(G)-GG(CC)-T(A)-3′(CC為突變位點(diǎn)),C之前的堿基為G,而非目標(biāo)突變位點(diǎn)的序列為5′-A(T)-G(C)-A(T)-3′,且C之前堿基為T,該編輯器使用的脫氨酶是rAPOBEC1,其脫氨酶脫氨效率為TC>CC>GC[5],這解釋了C3的編輯效率大于目標(biāo)位點(diǎn)C6和C7的原因。因此,在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)應(yīng)該注意目標(biāo)位點(diǎn)附近的堿基序列,減少脫靶現(xiàn)象發(fā)生。研究證明,腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor,ABE)的特異性高于CBE[17],Jeong等[18]通過(guò)改造ABE得到的ABE7.10(P48R)變體,發(fā)現(xiàn)其具有更高的脫氨率和較低的腺嘌呤編輯率,它還可以實(shí)現(xiàn)TC→TT或TC→TG的替換,因此,利用ABE引入終止密碼子是降低脫靶率的潛在方法之一。綜上所述,針對(duì)CBE堿基編輯器在體細(xì)胞中編輯效率較低且在高C位點(diǎn)易脫靶的問(wèn)題,筆者認(rèn)為,鑒于ABE比CBE具有更高編輯效率和較低的脫靶率,因此可以利用ABE堿基編輯器人工創(chuàng)造終止密碼子。
本研究利用電轉(zhuǎn)染的方法將pMLM3636-puro-MSTN和YE1-BE3-FNLS共轉(zhuǎn)入寧鄉(xiāng)花豬的腎成纖維細(xì)胞中,在紅色熒光和嘌呤霉素雙篩選的情況下,獲得了陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。結(jié)果顯示,在MSTN基因第2外顯子處成功引入終止密碼子,且目標(biāo)位點(diǎn)G→A的編輯效率為5.5%。與野生型相比,試驗(yàn)組10號(hào)單克隆細(xì)胞MSTN蛋白的表達(dá)量降低約60%。本研究成功運(yùn)用了單堿基編輯技術(shù)在寧鄉(xiāng)花豬MSTN基因編碼區(qū)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)編輯,為后期生產(chǎn)瘦肉率高的堿基突變豬奠定基礎(chǔ)。