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    大型迪慶藏豬不同生長階段肌內脂肪沉積差異表達基因及其調控通路分析

    2022-08-23 02:39:26聶靖茹嚴達偉劉金橋董新星
    中國畜牧獸醫(yī) 2022年8期
    關鍵詞:胰島素差異

    聶靖茹,馬 黎,嚴達偉,鄧 俊,張 浩,張 博,劉金橋,董新星

    (1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院,昆明 650201;2.中國農業(yè)大學動物科學技術學院,北京 100193;3.云南農業(yè)職業(yè)技術學院畜牧獸醫(yī)學院,昆明 650212;4.云南省畜牧總站,昆明 650224)

    肌內脂肪(intramuscular fat,IMF)含量是肉質評定的首選指標,影響豬肉的風味、嫩度和多汁性[1],篩選調控豬肌內脂肪沉積的功能基因并解析其調控機制,對豬肉品質的遺傳改良具有重要意義。隨著高通量測序技術的發(fā)展,一些影響豬脂肪沉積的功能基因和轉錄調控因子被發(fā)現(xiàn)。李明洲等[2]研究發(fā)現(xiàn),太湖豬在不同月齡脂肪細胞體積、肌內脂肪含量均高于長白豬,且在3月齡后差距逐漸明顯;Wood等[3]研究發(fā)現(xiàn),維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)通過抑制CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteins alpha,C/EBPα)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma,PPARγ)抑制脂肪生成;Tang等[4]研究發(fā)現(xiàn),轉錄因子Sp1基因是前脂肪細胞向脂肪細胞分化所必需的關鍵基因;Huang等[5]研究發(fā)現(xiàn),XLOC_046142、XLOC_004398和XLOC_015408可能分別以絲裂原激活蛋白激酶激活蛋白激酶2(MAPK-activated protein kinase 2,MAPK-APK2)、核受體亞家族1D組成員2(nuclear receptor subfamily 1 group D member 2,NR1D2)和醛酮還原酶家族1成員C4(aldo-keto reductase family 1 member C4,AKR1C4)為靶點,在豬肌內脂肪生成和脂質積累中起重要調節(jié)作用;Xing等[6]研究發(fā)現(xiàn)了脂質運載蛋白2(lipocalin 2,LCN2)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,PCK1)、過氧化物酶體增殖激活受體γ輔激活因子1β(peroxisome proliferative activated receptor,gamma,coactivator 1 beta,PPARGC1B)、腺苷一磷酸脫氨酶1(adenosine monophosphate deaminase 1,AMPD1)和線粒體肌酸激酶2(creatine kinase,mitochondrial 2,CKMT2)5個影響脂肪沉積的候選基因;Ana等[7]研究發(fā)現(xiàn),Retinto伊比利亞豬脂肪酸結合蛋白3(fatty acid binding protein 3, FABP3)、FABP5、長鏈脂肪酸轉運蛋白1(solute carrier family 27 member 1,SLC27A1)等基因上調能夠加速脂肪沉積,Torbiscal伊比利亞豬脂聯(lián)素(adiponectin,C1Q and collagen domain containing,ADIPOQ)和肉毒堿棕櫚?;D移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)基因上調會抑制脂肪沉積。迪慶藏豬是中國特有的高原型豬種之一,具有沉脂能力強、肉質好等特點[8],目前關于迪慶藏豬的研究主要在起源與馴化[9]、遺傳多樣性[10-12]、低氧適應[13]、肉質[14-16]、雜交利用[17]等方面,迪慶藏豬肌內脂肪沉積遺傳調控機制尚不明晰。本研究采用RNA-Seq技術篩選大型迪慶藏豬不同生長階段肌內脂肪沉積差異的關鍵基因并分析其調控途徑,以期為大型迪慶藏豬肉品質的遺傳改良提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗動物

    選擇胎次相同、出生日期及體重相近的純種大型迪慶藏豬36頭,隨機分為3組,每組12頭,在云南省香格里拉市綠源生態(tài)種養(yǎng)專業(yè)合作社藏豬養(yǎng)殖基地進行育肥試驗,分別在體重達40、80、120 kg左右時屠宰,每組采集3頭豬的背最長肌(S1-3LD、S2-3LD、S3-3LD),液氮速凍運回實驗室,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 主要試劑及儀器

    動物組織總RNA提取試劑盒、反轉錄-熒光定量試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。NanoDrop 2000核酸濃度測定儀購自ThermoFisher Scientific公司;熒光定量PCR儀(FQD-96A)購自杭州博日科技股份有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 RNA提取和質量檢測 參考王志秀[18]采用TRIzol法結合動物組織總RNA提取試劑盒提取背最長肌總RNA,去除rRNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取總RNA的質量,以確定RNA是否存在降解及污染等情況;利用NanoDrop 2000測定儀對總RNA的純度(D260 nm/D280 nm)進行測定,利用Qubit對總RNA進行精確定量,利用Agilent 2100核酸分析儀檢測RNA的完整性,檢測合格的總RNA用于轉錄組測序。

    1.3.2 去核糖體鏈特異性文庫構建及測序 從9個檢測合格的樣本RNA中各取3 μg建庫,對測序文庫進行質檢,文庫濃度要求不低于1 ng/μL,電泳觀察構建的文庫條帶大小在350~450 bp;按照cBot User Guide(Part#15006165,Rev.F,Illumina)流程,在Illumina Hiseq 2000測序儀配套的cBot上完成Cluster的生成和第一向測序引物雜交;按照Hiseq 2000 User Guide(Part#15011190_H,Illumina)要求備好測序試劑,將攜有cluster的flow cell上機,按程序進行Paired End 2×100 nt Multiplex測序,并進行數(shù)據(jù)的收集和實時數(shù)據(jù)分析。將mRNA進行Oligo(dT)磁珠富集,反轉錄合成cDNA文庫。使用NlaⅢ內切酶產(chǎn)生標簽5′-端,該內切酶可識別并切斷cDNA上的CATG位點,利用磁珠純化帶有cDNA 3′-端片段,將其5′-端連接到Illumina接頭1上;Illumina接頭1與CATG位點的結合處是MmeⅠ內切酶的識別位點,該內切酶可將識別位點與酶切位點分離,酶切位置在CATG位點下游17 bp處,從而產(chǎn)生帶有接頭1的Tag;采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純化,利用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-time PCR System對構建好的文庫進行質檢,質檢合格的文庫用Illumina Hiseq 2000上機測序。

    1.3.3 測序數(shù)據(jù)處理及差異表達基因聚類分析 對測序獲得的原始數(shù)據(jù)(raw reads),去除污染和低質量片段后獲得過濾后的有效數(shù)據(jù)(clean reads),采用HISAT2軟件將clean reads與豬的參考基因組(Susscrofa11.1)進行比對,對比對到基因組各染色體上的clean reads進行統(tǒng)計,以log2|FoldChange|>1且P<0.05作為篩選條件,將片段每百萬堿基碎片數(shù)(fragments per kilobase million,FPKM)值歸一化進行差異表達基因分析。將3個生長階段分為3個比較組(S1vsS2:40 kgvs80 kg;S2vsS3:80 kgvs120 kg;S1vsS3:40 kgvs120 kg),對每個比較組的陽性共表達基因聚類分析。

    1.3.4 差異表達基因功能富集分析 對篩選出的差異表達基因進行GO功能和KEGG通路富集分析,篩選與迪慶藏豬脂肪沉積相關的差異表達基因,按富集度count≥2且校正P<0.05作為顯著富集基因的閾值。

    1.3.5 差異表達基因STEM分析 采用短時間序列表達分析(short time-series expression miner,STEM)對差異表達基因進行趨勢分析,數(shù)據(jù)過濾標準為3個時間節(jié)點兩兩比較的組內表達差異倍數(shù)在2倍以上且P<0.05,對顯著差異表達的模塊進行GO功能和KEGG通路富集分析。

    1.3.6 差異表達基因互作網(wǎng)絡分析 利用Cytoscape 3.9.1軟件挖掘差異表達基因間的互作關系,構建差異表達基因的互作網(wǎng)絡。

    1.3.7 實時熒光定量PCR 用Primer Premier 5.0軟件設計實時熒光定量PCR引物(表1),利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,以GAPDH作為內參基因,采用ABI HT7900定量PCR儀對篩選到的差異表達基因進行實時熒光定量PCR檢測。PCR擴增體系20 μL:2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green Ⅰ) 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 7.4 μL。PCR擴增條件:95 ℃預變性1 min;95 ℃變性15 s,退火15 s(退火溫度見表1),72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán);循環(huán)結束后開始熔解曲線分析:95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,溫度以0.11 ℃/s的速率從60 ℃遞增到95 ℃。每個樣本設3個重復,根據(jù)2-ΔΔCt值計算定量結果。

    表1 引物信息

    2 結 果

    2.1 大型迪慶藏豬背最長肌RNA提取質量及測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量,樣品總RNA的28S和18S條帶清晰,28S的亮度約為18S的2倍,質量達到RNA-Seq上機測序的要求。由表2可知,每個樣品的raw reads數(shù)都在48 Mb以上,clean reads比例均超過88%,有效Q30比例均在94%以上,比對率均在95%以上,測序數(shù)據(jù)符合生物信息學分析要求。

    表2 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    2.2 大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因聚類分析

    對3個比較組的陽性共表達基因進行聚類發(fā)現(xiàn),每個組內部聚為一類,組間明顯分開(圖1),可進行后續(xù)分析。

    A,S1 vs S2;B,S2 vs S3;C,S1 vs S3。圖2同A,S1 vs S2;B,S2 vs S3;C,S1 vs S3.The same as fig.2圖1 大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因聚類熱圖Fig.1 Clustering heat map of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

    2.3 不同體重階段大型迪慶藏豬背最長肌顯著差異基因篩選

    以log2|FoldChange|>1且P<0.05為篩選顯著差異基因的閾值,S1vsS2階段共篩選到730 個基因顯著差異表達,其中,上調基因341個,下調基因389個(圖2A);S2vsS3階段共篩選到981個基因顯著差異表達,其中,530個基因上調,451個基因下調(圖2B);S1vsS3階段共篩選到735個基因顯著差異表達,其中,364個基因上調,371個基因下調(圖2C)。

    2.4 不同體重階段大型迪慶藏豬背最長肌顯著差異表達基因功能富集分析

    S1vsS2階段,GO功能分析結果顯示,差異表達基因主要富集在凋亡過程調控、胰島素應答、脂肪細胞分化等過程(圖3A);KEGG通路分析結果顯示,差異表達基因主要富集在FOXO信號通路、脂肪細胞因子信號通路、胰島素抵抗等通路(圖3B)。S2vsS3階段,GO功能分析結果顯示,差異表達基因主要富集在葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂肪墊發(fā)育、脂肪酸氧化正調控等過程(圖3C);KEGG通路分析結果顯示,差異表達基因主要富集在胰島素信號通路、PPAR信號通路、脂肪細胞因子信號通路等(圖3D)。S1vsS3階段,GO功能富集分析顯示,差異表達基因主要富集在葡萄糖應答、脂肪細胞分化、能量穩(wěn)態(tài)等過程(圖3E);KEGG通路富集分析顯示,差異表達基因主要富集在胰島素信號通路、胰島素抵抗信號通路等(圖3F)。

    圖2 大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因火山圖Fig.2 Volcanic map of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

    A、C、E,S1 vs S2、S2 vs S3和S1 vs S3 GO功能富集圖;B、D、F,S1 vs S2、S2 vs S3和S1 vs S3 KEGG通路富集圖A,C and E,GO function enrichment histograms of S1 vs S2,S2 vs S3 and S1 vs S3,respectively;B,D and F,KEGG pathway enrichment histograms of S1 vs S2,S2 vs S3 and S1 vs S3,respectively圖3 大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因GO功能和KEGG通路富集分析圖Fig.3 GO function and KEGG pathway enrichment histograms of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

    2.5 大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因STEM分析

    對篩選到的顯著差異表達基因進行STEM分析,共有4個差異顯著模塊(圖4),模塊11和14的差異表達基因聚為一類,先表達上調后呈現(xiàn)輕微表達下調;模塊9和10的差異表達基因聚為一類,先表達上調后表達下調;其余模塊差異不顯著。模塊11和14的基因集GO功能分析顯示,差異表達基因主要富集到BMP信號通路的負調控、JUN激酶活性激活等過程(圖5A),KEGG通路分析顯示,差異表達基因主要富集到PI3K-Akt信號通路、ECM受體相互作用等通路(圖5B);模塊9和10基因集GO功能主要富集到細胞對脂多糖反應、T細胞凋亡過程的正調控(圖5C),KEGG通路主要富集到Ⅱ型糖尿病、T細胞受體信號通路等通路(圖5D)。

    顏色背景表示趨勢顯著(P<0.05),相同顏色表示模塊內所包含的基因表達趨勢相似;白色背景模塊表示趨勢不顯著(P>0.05)The trend of color background is significant (P<0.05),the same color indicates that the gene expression trend contained in the module is similar;The trend of white background module is not significant (P>0.05)圖4 大型迪慶藏豬背最長肌STEM分析Fig.4 STEM analysis of longissimus dorsi muscle in large Diqing Tibetan pigs

    A、B,模塊11、14的GO功能和KEGG通路富集圖;C、D,模塊9及10的GO功能和KEGG通路富集圖A and B,GO function and KEGG pathway enrichment histograms of module 11 and 14,respectively;C and D,GO function and KEGG pathway enrichment histograms of module 9 and 10,respectively圖5 大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因顯著富集模塊GO功能和KEGG通路富集分析圖Fig.5 GO function and KEGG pathway enrichment histograms of differentially expressed genes of significant enrichment modules in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

    2.6 不同體重階段大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因互作網(wǎng)絡

    2.6.1 S1vsS2 選擇S1vsS2階段顯著富集通路中的基因繪制網(wǎng)絡圖,結果見圖6。由圖6可知,轉錄激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)、核受體亞家族4A組成員3(nuclear receptor subfamily 4 group A member 3,NR4A3/NOR-1)、AMP激活蛋白激酶γ2調節(jié)亞單位(protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2,PRKAG2)、早期生長應答因子1(early growth response 1,EGR1)、早期生長應答因子2(early growth response 2,EGR2)基因位于網(wǎng)絡核心,其中ATF3、NOR-1、PRKAG2基因表達上調,ATF3基因與脂聯(lián)素表達有關,NOR-1和PRKAG2基因會影響胰島素敏感性;EGR1、EGR2基因表達下調,這2個基因與脂質代謝、脂肪生成有關。

    圖6 S1 vs S2階段差異表達基因互作網(wǎng)絡Fig.6 Interaction network diagram of differentially expressed genes at S1 vs S2 stage

    2.6.2 S2vsS3 選擇S2vsS3階段顯著富集通路中的基因繪制網(wǎng)絡圖,結果見圖7。由圖7可知,過氧化物酶體增殖物激活受體δ(peroxisome proliferator activated receptor delta,PPARD)、丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4)、叉頭盒O1(forkhead box O1,FOXO1)、過氧化物酶體增殖激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferative activated receptor,gamma,coactivator 1 alpha,PPARGC1A/PPARGC-1)、ATF3、信號轉導和轉錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)、脂肪酶E(lipase E,LIPE)基因位于網(wǎng)絡中心,其中,LIPE、ATF3基因表達上調,LIPE基因參與抗脂分解、脂質穩(wěn)態(tài)等過程,ATF3基因可調控脂聯(lián)素表達;PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因表達下調,PPARD基因在脂肪代謝中發(fā)揮作用,PDK4和FOXO1基因可相互作用影響葡萄糖攝取及游離脂肪酸含量,PPARGC-1基因在脂肪儲存中起調控作用,STAT1基因可在脂肪細胞分化過程中起作用。

    2.6.3 S1vsS3 選擇S1vsS3階段顯著富集通路中的基因繪制基因網(wǎng)絡圖,結果見圖8。由圖8可知,ATF3、NOR-1、EGR1、EGR2、STAT1基因位于網(wǎng)絡中心,其中,ATF3、NOR-1基因表達上調,ATF3基因可調控脂聯(lián)素表達,NOR-1基因影響胰島素敏感性;EGR1、EGR2、STAT1基因表達下調,EGR1、EGR2基因影響脂質代謝,STAT1基因與脂肪細胞分化有關。

    圖7 S2 vs S3階段差異表達基因互作網(wǎng)絡Fig.7 Interaction network diagram of differentially expressed genes at S2 vs S3 stage

    圖8 S1 vs S3階段差異表達基因互作網(wǎng)絡Fig.8 Interaction network diagram of differentially expressed genes at S1 vs S3 stage

    2.7 大型迪慶藏豬背最長肌脂肪沉積差異表達基因實時熒光定量驗證

    隨機挑選了EGR1、FOXO1等10個差異表達基因進行實時熒光定量PCR驗證,EGR1、FOXO1、PDK4、PPARD、PPARGC-1、STAT1基因表達下調,ATF3、LIPE、NOR-1、PRKAG2基因表達上調,與RNA-Seq結果一致(圖9)。

    圖9 大型迪慶藏豬背最長肌差異表達基因實時熒光定量PCR驗證結果Fig.9 Real-time quantitative PCR verification results of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle of large Diqing Tibetan pigs

    3 討 論

    3.1 大型迪慶藏豬S1 vs S2背最長肌脂肪沉積差異表達基因

    大型迪慶藏豬40 kgvs80 kg階段,ATF3、NOR-1、PRKAG2基因表達上調,EGR1、EGR2基因表達下調。ATF3、NOR-1和PRKAG2基因均在胰島素抵抗信號通路中富集,當誘發(fā)胰島素抵抗時,脂肪細胞、肌肉細胞對正常濃度的胰島素反應不足,使得胰島素作用的敏感性降低,促進葡萄糖攝取和利用效率下降,能量攝入過多[19],脂肪分解減少[20]。而脂聯(lián)素能夠激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK),減少丙二酰輔酶A生成,促使脂肪酸進入線粒體得到氧化[21]。當發(fā)生脂聯(lián)素抵抗時,脂聯(lián)素對AMPK的刺激減弱,骨骼肌中脂肪酸氧化的作用減弱,從而促進胰島素抵抗[22]。ATF3基因是脂聯(lián)素基因表達的負調節(jié)因子,脂聯(lián)素基因低表達會導致肥胖和胰島素抵抗[23]。NOR-1基因在骨骼肌和脂肪組織中大量表達,參與肌內脂肪形成[24],NOR-1基因過度表達會導致循環(huán)兒茶酚胺濃度降低,引起胰島素敏感性降低[25],導致脂肪分解減少,脂肪沉積增加[20]。PRKAG2基因編碼AMP活化蛋白激酶γ2亞單位,該基因上調導致AMPK活性增加,糖原合成激活、葡萄糖攝取增加,誘發(fā)胰島素抵抗,脂肪沉積增多[26]。本試驗中,ATF3基因表達上調,引起脂聯(lián)素基因下調,可能導致脂肪含量增加;NOR-1基因上調引起胰島素敏感性降低,導致脂肪分解減少;PRKAG2基因上調導致糖原合成激活、葡萄糖攝取增加,脂肪沉積增多。

    EGR1和EGR2基因屬于早期生長反應因子家族,與脂質代謝、脂肪生成、胰島素及膽固醇生物合成有關,在脂肪細胞分化信號通路中富集。EGR1基因是3T3-L1脂肪細胞分化的負調節(jié)因子,敲除EGR1基因能增強脂肪細胞分化[27]。EGR2基因是脂肪細胞分化負調節(jié)因子miR-224-5p的直接靶點,miR-224-5p在早期脂肪形成中調節(jié)EGR2基因表達[28]。本試驗中,EGR1和EGR2基因表達下調,可能促進脂肪細胞分化和脂肪形成。

    3.2 大型迪慶藏豬S2 vs S3背最長肌脂肪沉積差異表達基因

    大型迪慶藏豬80 kgvs120 kg階段,LIPE、ATF3基因表達上調,PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因表達下調。LIPE和ATF3基因均富集到葡萄糖穩(wěn)態(tài)信號通路中,影響肌肉組織對葡萄糖的吸收與利用及脂肪組織對胰島素的敏感性[29]。LIPE基因參與游離脂肪酸的動員[30]、抗脂分解及脂質穩(wěn)態(tài),導致高肌內脂肪含量[31]。ATF3基因通過負調控脂聯(lián)素基因而引起肥胖和胰島素抵抗[23]。本試驗中,LIPE基因表達上調可能減少脂肪分解、提高肌內脂肪含量,ATF3基因表達上調可引起脂聯(lián)素基因表達下調,可能導致肌內脂肪含量增加。

    PPARD基因在Wnt和PPAR信號通路中富集,參與脂肪代謝、能量調控,進而影響脂肪細胞的分化[32]。研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號通路能夠調節(jié)脂肪沉積[33],同時能維持前脂肪細胞向脂肪成熟細胞分化的狀態(tài),Wnt信號通路減弱時,可分化大量脂肪細胞[34]。PPARD基因是胰島素敏感和脂肪代謝的關鍵調節(jié)因子,在脂肪代謝中發(fā)揮作用,主要參與脂肪酸分解[35],增強脂肪酸運輸、氧化、能量解偶聯(lián)、線粒體呼吸、產(chǎn)熱等相關基因的轉錄[36],上調脂肪酸氧化相關基因,降低體重、脂滴數(shù)量和脂滴大小[35]。豬PPARD基因定位在7號染色體一個脂肪沉積的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL)附近,可促進膽固醇和血清高密度脂蛋白積累[37]。PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因均在葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素受體及胰島素信號通路過程中富集,通過影響脂聯(lián)素及胰島素作用的敏感性,進而影響葡萄糖攝取和利用效率及能量代謝,從而影響肌內脂肪含量。FOXO1基因會對脂聯(lián)素受體的表達及脂聯(lián)素敏感性的調節(jié)產(chǎn)生影響[38],同時FOXO1基因在調節(jié)胰島素信號轉導的糖異生和糖原分解中發(fā)揮重要作用,通過抑制細胞周期蛋白依賴激酶而阻止脂肪生成轉錄因子表達[39],在終末分化開始時,F(xiàn)OXO1基因被激活并轉移到前脂肪細胞的細胞核,與PPARG基因的啟動子結合,導致有絲分裂后細胞生長停滯,負調控脂肪生成[40]。此外,F(xiàn)OXO1與PDK4基因的啟動子區(qū)結合,增加肌肉中PDK4基因mRNA的表達[41],減少丙酮酸脫氫酶復合物(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)通量,減弱碳水化合物氧化和葡萄糖攝取,并減少游離脂肪酸[42]。PPARGC-1是一種轉錄共激活因子,可調控能量代謝,在米色和棕色脂肪組織中對脂肪代謝、脂肪細胞增殖、脂肪儲存起重要調控作用[43],脂肪組織中缺乏PPARGC-1基因的小鼠會產(chǎn)生胰島素抵抗[44]。STAT1基因位于PPARG基因下游,在脂肪細胞分化中通過級聯(lián)調節(jié)負調控脂肪形成[45]。本試驗中,PPARD、FOXO1、PPARGC-1、STAT1、PDK4基因表達下調,PPARD基因表達下調可能使脂肪酸運輸、氧化等相關基因的轉錄下調,脂肪酸分解減少、脂肪酸積累增多、脂滴變大。FOXO1基因表達下調導致與PPARG基因的啟動子結合減少,脂肪生成增多;另外,F(xiàn)OXO1與PDK4基因的啟動子結合減少,葡萄糖攝取增加,游離脂肪酸增多。PPARGC-1基因表達下調可能使骨骼肌對胰島素的敏感性降低,肌內脂肪含量增加。STAT1基因位于PPARG基因下游,PPARG基因通過級聯(lián)調控引起STAT1基因表達下調,促進脂肪生成。

    3.3 大型迪慶藏豬S1 vs S3背最長肌脂肪沉積差異表達基因

    大型迪慶藏豬40 kgvs120 kg階段,ATF3、NOR-1基因表達上調,STAT1、EGR1、EGR2基因表達下調。ATF3和NOR-1基因富集到胰島素信號通路中,通過影響肌肉組織和脂肪組織中胰島素敏感性來影響葡萄糖攝取及能量代謝效率,增加肌內脂肪含量[19-20]。STAT1基因在能量穩(wěn)態(tài)、胰島素抵抗信號通路中富集,通過級聯(lián)調節(jié)負調控脂肪形成[45]。EGR1、EGR2基因屬于立早基因(immediate early genes,IEGs),參與細胞生長、分化,富集到脂肪細胞分化信號通路。EGR1和EGR2為脂肪細胞分化的負調節(jié)因子[27-28],其表達下調促進脂肪形成。

    4 結 論

    ATF3、NOR-1、PRKAG2、EGR1、EGR2、LIPE、PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1作為核心基因調控大型迪慶藏豬肌內脂肪沉積;不同生長階段參與調控的核心基因并不完全相同,40 kgvs80 kg階段,ATF3、NOR-1、PRKAG2基因表達上調,EGR1、EGR2基因表達下調;80 kgvs120 kg階段,LIPE、ATF3表達上調,PPARD、PDK4、FOXO1、PPARGC-1、STAT1基因表達下調;40 kgvs120 kg階段,ATF3、NOR-1基因表達上調,EGR1、EGR2、STAT1基因表達下調。

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