肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠影響的初步研究

唐胡婷 母煒浩 向渝靜 安永

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院胸心外科/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一類以肺動(dòng)脈漸進(jìn)性閉塞導(dǎo)致肺血管阻力逐漸升高繼而誘發(fā)右心室衰竭的一種惡性肺血管疾病，臨床上因缺氧而引起的低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPAH）最為常見(jiàn)［1］。目前治療HPAH手段有限且效果不佳，因此研究新的治療方法很有必要?，F(xiàn)有研究表明在PAH動(dòng)物模型中，PAH的進(jìn)展程度與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）體內(nèi)濃度呈負(fù)相關(guān)，在該動(dòng)物模型肺部所檢測(cè)到的HGF激活物有所下降［2］。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是肺動(dòng)脈高壓形成的始動(dòng)因素［3］，因此修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞，可有效抑制PAH對(duì)肺血管的持續(xù)影響。已有研究發(fā)現(xiàn)在受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍，存在高表達(dá)的HGF及促血管生成的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）［4］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已表明，移植高表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（hepatocyte growth factor/mesenchymal-epithelial transition factor，HGF/c-Met）軸 的EPCs，可 使EPCs定向遷移至HPAH動(dòng)物模型受損的肺血管處，改善肺血管重構(gòu)，降低肺動(dòng)脈壓力［5］。由此猜測(cè)：直接提高體內(nèi)HGF濃度后是否可直接治療受損的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，繼而逆轉(zhuǎn)PAH對(duì)機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的影響，以達(dá)到治療PAH的目的。所以本研究采用提高HPAH小鼠體內(nèi)HGF含量，與未有任何處理的HPAH小鼠進(jìn)行比較分析，為HPAH的治療方法提供新思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器試劑

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠30只，體重12~16 g，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［合格證號(hào)：SYXK（渝）：2012-0001］。

主要試劑及儀器：重組小鼠HGF（美國(guó)PEPROTECH公司），小動(dòng)物超聲儀（飛依諾科技有限公司，型號(hào)：VINNO 6 LAB），內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）ELISA檢測(cè)試劑盒（南京森貝伽生物科技公司），一氧化氮（nitric oxide，NO）Griess試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），透射電鏡（日本日立公司，型號(hào)：HT7700）。

1.2 模型建立與分組

將30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、HPAH組和HGF治療組，每組10只。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的前4周，正常組小鼠（共10只）置于獨(dú)立通氣籠盒（individual ventilated cages，IVC）間正常飼養(yǎng)；其余2組（共20只）小鼠置于自制缺氧箱內(nèi)，氧氣濃度10%（體積分?jǐn)?shù)），每天持續(xù)低氧8 h，每周更換水、墊料，給予充足的食物［6-7］。待成功建立HPAH小鼠模型后，給予HGF治療組小鼠尾靜脈注射重組小鼠HGF，劑量為1 mg/kg；同時(shí)正常組及HPAH組小鼠給予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液尾靜脈注射。而后將3組小鼠置于IVC間正常飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到第5周時(shí)觀測(cè)3組小鼠肺動(dòng)脈壓及血管重構(gòu)情況。

1.3 PAH嚴(yán)重程度相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第5周時(shí)，稱量各組小鼠體重（body weight，BW），將各組小鼠胸腹部脫毛后給予小鼠吸入異氟烷氣體進(jìn)行麻醉，動(dòng)物心臟彩超檢測(cè)小鼠右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）、三尖瓣峰值流速。

分離出小鼠心臟，剪去心耳，再沿室間隔剪下右心室，用濾紙吸去其水分，分別稱量右心室（right ventricle，RV）、左 心 室（left ventricle，LV）+室間隔（interventricular septum，S）的質(zhì)量，最后計(jì)算RV/BW比值和右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）=RV/（LV+S）×100%。

1.4 透射電鏡觀察肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)

小鼠經(jīng)10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，固定于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上，用手術(shù)器械打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟后，分離出肺動(dòng)脈?？焖偌羧》蝿?dòng)脈，放入2.5%戊二醛中固定，透射電鏡觀察肺動(dòng)脈血管超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.5 血清NO及ET-1濃度的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)第5周時(shí)，取小鼠眶動(dòng)脈和眶靜脈血，于室溫下自然凝固30 min，3 000 r/min離心20 min，取上清液。依NO試劑盒及ET-1檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RVHI及RV/BW比值的比較

各組RVHI及RV/BW比值的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HPAH組RVHI及RV/BW比值均顯著高于正常組及HGF治療組，而HGF治療組RVHI及RV/BW比值均高于正常組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組RVHI及RV/BW比值的比較 （±s，n=10）

表1 各組RVHI及RV/BW比值的比較 （±s，n=10）

注：［RVHI］右心室肥厚指數(shù)；［RV/BW］右心室/體重。a示與正常組比較，P<0.05；b示與HPAH組比較，P<0.05。

組別正常組HPAH組HGF治療組F值P值RVHI(%)19.6±1.4 23.2±0.8a 21.1±1.3a,b 21.478<0.001 RV/BW(%)2.96±0.22 3.36±0.21a 3.00±0.24a,b 10.080<0.001

2.2 各組血流動(dòng)力學(xué)比較

HPAH可表現(xiàn)出肺動(dòng)脈血流異常。心臟彩超結(jié)果顯示各組三尖瓣峰值流速及RVSP比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HPAH組及HGF治療組三尖瓣峰值流速均大于正常組，而HGF治療組三尖瓣峰值流速小于HPAH組（P<0.05）。HPAH組RVSP顯著高于HGF治療組和正常組，HGF治療組RVSP高于正常組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組三尖瓣峰值流速及RVSP比較 （±s，n=10）

表2 各組三尖瓣峰值流速及RVSP比較 （±s，n=10）

注：［RVSP］右心室收縮壓。a示與正常組比較，P<0.05；b示與HPAH組比較，P<0.05。

組別正常組HPAH組HGF治療組F值P值三尖瓣峰值流速(cm/s)46.7±2.3 66.5±3.0a 51.0±1.5a,b 202.808<0.001 RVSP(mm Hg)20.5±1.2 26.6±1.2a 21.0±1.3a,b 75.467<0.001

2.3 各組肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下可觀察到正常組血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜結(jié)構(gòu)正常，線粒體正常無(wú)腫脹。HPAH組可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞被大量破壞，未見(jiàn)完整的內(nèi)皮細(xì)胞，小動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜排列紊亂，有斷裂及缺失。HGF治療組血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜結(jié)構(gòu)基本正常，偶見(jiàn)有斷裂，較正常組有輕微水腫現(xiàn)象。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)（透射電鏡，×5 000） 正常組與HGF治療組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜未見(jiàn)明顯破壞；HPAH組肺動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)被破壞，未見(jiàn)完整的內(nèi)皮細(xì)胞。箭頭所示為小鼠肺動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜位置。

2.4 各組血清NO及ET-1水平的比較

通過(guò)Griess法測(cè)定各組小鼠血清中NO水平，結(jié)果顯示HGF治療組血清中NO水平高于正常組，而HPAH組血清中NO水平顯著高于HGF治療組與正常組（P<0.05）。ELISA法檢測(cè)血清中ET-1水平，結(jié)果顯示HPAH組血清中ET-1水平顯著高于HGF治療組與正常組，HGF治療組血清中ET-1水平高于正常組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組血清NO及ET-1水平的比較 （±s，n=10）

表3 各組血清NO及ET-1水平的比較 （±s，n=10）

注：［NO］一氧化氮；［ET-1］內(nèi)皮素-1。a示與正常組比較，P<0.05；b示與HPAH組比較，P<0.05。

組別正常組HPAH組HGF治療組F值P值NO(μmol/L)50.7±1.8 69.4±2.0a 56.1±1.8a,b 267.733<0.001 ET-1(pg/mL)183.2±1.4 201.7±1.6a 186.9±3.3a,b 187.025<0.001

3 討論

PAH是由于不同病因引起肺小動(dòng)脈病變最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力升高的疾病，病理表現(xiàn)為肥厚遠(yuǎn)端肺血管重構(gòu)、炎癥和血栓形成等。而肺血管重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓形成的始動(dòng)因素，故研究血管重構(gòu)發(fā)生的機(jī)制，是研究治療PAH靶向藥物的重點(diǎn)［3］。目前臨床上常見(jiàn)的PAH患者多因肺部疾病或生活壞境等導(dǎo)致長(zhǎng)期供氧不足，處于低氧狀態(tài)下最終形成HPAH，由于其發(fā)生發(fā)展機(jī)制不明和在疾病發(fā)展過(guò)程中氣短、右心衰等癥狀出現(xiàn)較晚，使得患者進(jìn)行臨床治療時(shí)的病情已經(jīng)進(jìn)展到中晚期，導(dǎo)致該疾病治療效果不佳［8］，且現(xiàn)有治療藥物不能預(yù)防和逆轉(zhuǎn)該疾病的發(fā)生發(fā)展。故為提高臨床療效，改善患者預(yù)后，研究新的靶向治療藥物具有重要意義。

目前有關(guān)PAH的治療藥物多數(shù)為血管活性物質(zhì)［9-10］，這類藥物雖然可以在短時(shí)間內(nèi)緩解PAH對(duì)心血管系統(tǒng)的損害，但未能修復(fù)受損的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，故PAH的發(fā)生發(fā)展仍會(huì)持續(xù)?，F(xiàn)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞，保證其完整性，可有效緩解炎癥機(jī)制對(duì)血管內(nèi)膜的損害，進(jìn)而改善肺血管重構(gòu)現(xiàn)象，治療肺動(dòng)脈高壓疾?。?1-12］。HGF是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的特異性分子，它可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和新生血管形成［13］。結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)，過(guò)表達(dá)HGF/c-Met軸的EPCs確實(shí)參與受損血管的修復(fù)［14-15］。為探討HGF是否可直接參與修復(fù)受損血管進(jìn)而達(dá)到治療HPAH的目的，本研究通過(guò)使小鼠缺氧4周建立HPAH小鼠模型，此模型可用來(lái)評(píng)價(jià)治療HPAH藥物效果［7］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HPAH組較正常組三尖瓣峰值流速、RVSP、RVHI、RV/BW均顯著增加，表明本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建HPAH動(dòng)物模型成功。而后向已構(gòu)建成功的HPAH小鼠體外注射HGF，以此達(dá)到提高小鼠體內(nèi)HGF濃度的目的［16-17］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)提高體內(nèi)HGF濃度，透射電鏡下可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜結(jié)構(gòu)未見(jiàn)破壞，說(shuō)明體內(nèi)HGF濃度的升高有助于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)，保證肺血管內(nèi)膜的完整性。HGF治療組小鼠血清中NO及ET-1濃度較HPAH組降低，表明內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的收縮和舒張血管因子趨向于平衡狀態(tài)，其分泌功能得到改善，肺血管的舒縮功能趨向于正常，其可能與HGF具有促進(jìn)新生血管生成、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫失衡及抗炎等作用有關(guān)［18-19］。有研究表明，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞與過(guò)表達(dá)HGF基因的間充質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，由于間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌大量的HGF作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其通透性降低，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整［20］，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相一致。其原因可能是HGF激活mTOR/STAT-3通路，增加緊密連接閉鎖蛋白的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞增殖，降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞［2，20-22］。且mTOR/STAT-3通路被證實(shí)可抑制肺組織細(xì)胞的凋亡、炎癥及應(yīng)激反應(yīng)［23］，促進(jìn)新生血管的生成［24］，進(jìn)而抑制PAH所致的血管重構(gòu)現(xiàn)象，這些均有利于修復(fù)受損的血管，結(jié)合本課題組前期實(shí)驗(yàn)，故推測(cè)HGF可能參與了肺血管的修復(fù)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，HGF治療組三尖瓣峰值流速、RVSP、RVHI、RV/BW均較HPAH組有明顯降低，其可能與HGF修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜結(jié)構(gòu)完整，抑制血管重構(gòu)現(xiàn)象［25］，從而改善肺動(dòng)脈高壓小鼠的血流動(dòng)力學(xué)有關(guān)。這些結(jié)果提示HGF可能為治療HPAH提供新思路。目前HGF/c-Met軸也正逐漸成為研究治療腫瘤、內(nèi)分泌及心血管疾病的靶向藥物的重點(diǎn)［26-28］。有研究表明通過(guò)抑制HGF/c-Met軸的促進(jìn)新生血管生成、減弱細(xì)胞炎癥、應(yīng)激反應(yīng)及減少細(xì)胞凋亡等作用，可有效治療癌癥［29］，相反，是否可以選擇促進(jìn)其作用來(lái)治療HPAH，以及其作用的信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示，體內(nèi)高濃度的HGF，可修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞恢復(fù)其功能，維護(hù)血管動(dòng)脈內(nèi)膜及彈力膜的完整性，改善血管重構(gòu)現(xiàn)象，降低HPAH對(duì)循環(huán)系統(tǒng)的損害，為治療HPAH提供一種新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。