烤煙上部煙葉成熟生理特性研究進(jìn)展

賈中林，尹啟生，戴華鑫，梁太波，張艷玲，劉 陽，張仕祥

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

煙葉成熟度是決定烤煙品質(zhì)的核心要素，田間煙葉成熟采收是優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，直接影響烤后煙葉品質(zhì)。左天覺［1］、宮長(zhǎng)榮［2］認(rèn)為田間煙葉成熟采收對(duì)煙葉品質(zhì)的貢獻(xiàn)占整個(gè)烤煙生產(chǎn)環(huán)節(jié)的1/3?？緹熒喜繜熑~包括上二棚和頂葉在內(nèi)的5～6片葉，占單株總產(chǎn)量的30%～40%，優(yōu)質(zhì)的上部煙葉對(duì)卷煙香味和風(fēng)格有很大影響，是生產(chǎn)高檔卷煙的重要原料，在煙葉生產(chǎn)中占有重要地位。長(zhǎng)期以來，我國許多煙區(qū)上部煙葉存在成熟度不夠、葉片僵硬、化學(xué)成分不協(xié)調(diào)、刺激性大、雜氣重以及工業(yè)可用性差等問題，導(dǎo)致多數(shù)上部煙葉不能直接用于一、二類卷煙配方中［3］。自2009年朱尊權(quán)院士提出烤煙上部4～6片煙葉一次性成熟采收技術(shù)后，許多產(chǎn)區(qū)相繼開展了提高上部煙葉可用性的技術(shù)研究與應(yīng)用，并取得了顯著效果，部分上部煙葉已應(yīng)用到高端卷煙品牌配方中［4-5］。然而，目前關(guān)于烤煙上部煙葉成熟進(jìn)程中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化規(guī)律和相關(guān)作用機(jī)理等仍不明確，這在一定程度上限制了相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用。為此，從煙葉物質(zhì)代謝、生物酶活性、基因表達(dá)和蛋白功能等方面綜述了近年來烤煙上部煙葉成熟生理特性的研究進(jìn)展，旨在為煙葉成熟度調(diào)控和優(yōu)質(zhì)上部煙葉開發(fā)提供參考。

1 上部煙葉成熟過程中物質(zhì)代謝規(guī)律

1.1 碳水化合物

1.1.1 碳水化合物種類及測(cè)定方法

煙葉碳代謝產(chǎn)物主要是碳水化合物（糖類），按結(jié)構(gòu)組成分為單糖、低聚糖和多糖。20世紀(jì)60年代起，國外開始關(guān)注煙葉中的碳水化合物，主要采用酸水解法測(cè)定煙葉淀粉含量，Somogyi法測(cè)定煙葉中可溶性糖含量，離子交換色譜法來分離煙葉中的糖組分［6-7］。20 世紀(jì)80 年代起，國內(nèi)也開始相關(guān)研究，起初采用二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖和總糖含量，酸水解-二硝基水楊酸比色法或酸水解-碘比色法測(cè)定淀粉含量［8-9］。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了光譜法、液相色譜法、氣相色譜法、離子色譜法和電泳法等更加快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法［10-11］，目前行業(yè)內(nèi)對(duì)煙葉中總糖和淀粉的測(cè)定一般采用連續(xù)流動(dòng)分析法，測(cè)定糖組分一般采用高效液相色譜法（表1）。

表1 煙葉中碳水化合物的檢測(cè)方法Tab.1 Detection methods for carbohydrates in tobacco leaves

1.1.2 碳水化合物與煙葉成熟度的關(guān)系

煙葉成熟過程中碳代謝產(chǎn)物的研究主要集中于總糖、還原糖和淀粉（表2）。在煙葉成熟過程中，葉片光合生理功能開始衰退，碳水化合物合成減弱而降解增強(qiáng)，物質(zhì)含量逐漸降低［12］。國外研究表明，隨煙葉成熟度增加，淀粉、總糖和可溶性糖含量大致呈拋物線形變化，國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律，并認(rèn)為煙葉淀粉含量的最大值出現(xiàn)在煙葉工藝成熟時(shí)期，之后進(jìn)入過熟階段，煙葉淀粉含量逐漸降低［13-14］。煙葉成熟過程中物質(zhì)含量的變化可為生產(chǎn)上煙葉成熟度的判斷提供參考，如美國通過提前1周測(cè)定煙葉中化學(xué)成分含量來判斷煙葉的成熟度，以此來確定煙葉采收期［15］。20世紀(jì)80年代起，國內(nèi)學(xué)者也提出將淀粉含量作為煙葉成熟度的判斷指標(biāo)，淀粉含量達(dá)到最高值的時(shí)間即為煙葉工藝成熟期［18］。煙葉碳代謝產(chǎn)物在成熟過程中的變化受品種、地域環(huán)境等因素的影響。不同品種烤煙成熟過程中，煙葉淀粉和還原糖含量雖然整體上表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(shì)，但達(dá)到峰值的時(shí)間存在差異［22］。同一烤煙品種在不同地域環(huán)境下，煙葉糖含量在成熟過程中呈現(xiàn)的變化規(guī)律也略有差異［23］。目前對(duì)煙葉成熟過程中糖含量的研究主要集中在總糖和還原糖總量方面，而對(duì)糖組分如葡萄糖、果糖、蔗糖和麥芽糖等的關(guān)注相對(duì)較少。

表2 國內(nèi)外煙葉成熟過程中碳代謝產(chǎn)物的變化主要研究結(jié)果Tab.2 Domestic and foreign researches on variations of carbon metabolites during tobacco leaf ripening

1.2 含氮化合物

1.2.1 含氮化合物種類及測(cè)定方法

煙葉中氮代謝產(chǎn)物主要是含氮化合物，包括蛋白質(zhì)、游離氨基酸和生物堿等，含氮化合物對(duì)煙葉的感官質(zhì)量和吸食者健康有重要影響。國外對(duì)煙葉含氮化合物的研究始于20世紀(jì)60年代，最初主要采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)，該方法具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，也是較長(zhǎng)一段時(shí)期國內(nèi)測(cè)定蛋白質(zhì)的常用方法。目前，行業(yè)內(nèi)總氮的測(cè)定主要采用連續(xù)流動(dòng)分析法［24］。1958 年，Moore 等［25］發(fā)明了氨基酸自動(dòng)分析的方法，逐漸成為國內(nèi)外測(cè)定氨基酸的常用方法。隨著研究的深入和分析儀器的發(fā)展，出現(xiàn)了電泳法、光譜法、色譜法、質(zhì)譜聯(lián)用等更加快速準(zhǔn)確檢測(cè)煙葉游離氨基酸的方法［26-27］（表3）。國外對(duì)生物堿的測(cè)定方法研究較早，Bertrand 和Javillier 采用硅鎢酸重量法測(cè)定了煙堿；之后Markw 提出了1種煙堿比色測(cè)定的方法［28］。國內(nèi)對(duì)煙堿含量的測(cè)定最初采用酸堿滴定法，之后出現(xiàn)了光度法、電泳法、液相色譜、氣相色譜、液質(zhì)聯(lián)用或氣質(zhì)聯(lián)用等更精準(zhǔn)的測(cè)定方法［28-30］，目前行業(yè)內(nèi)主要采用連續(xù)流動(dòng)分析法大批量檢測(cè)樣品中生物堿含量（表4）。

表3 煙葉中游離氨基酸的檢測(cè)方法Tab.3 Detection methods for free amino acids in tobacco leaves

1.2.2 含氮化合物與煙葉成熟度的關(guān)系

煙葉成熟過程中氮代謝產(chǎn)物的研究多集中在總氮、蛋白質(zhì)、氨基酸和生物堿（表5）。隨著煙葉成熟度增加，總氮、蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量逐漸降低，這一變化與煙葉衰老過程中氮素的再分配和再利用有關(guān)［31］。葉片中的氮素大部分以蛋白質(zhì)形式存在于葉綠體中，在葉片進(jìn)入衰老階段，蛋白水解酶活性顯著增強(qiáng)，蛋白質(zhì)被水解為氨基酸等物質(zhì)，然后通過韌皮部輸送到新生器官中以維持其生長(zhǎng)，因此蛋白質(zhì)等含氮化合物含量在煙葉成熟衰老過程中逐漸降低［32］。在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中，生物堿在葉片中逐漸積累，各組分（煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿）含量均隨成熟度增加而呈上升趨勢(shì)［33］。游離氨基酸可作為前體物參與煙堿的生物合成，隨著煙葉葉齡的增加，氮在游離氨基酸中的分配比例逐漸降低，而在煙堿中的分配比例逐漸提高，成熟后期煙葉游離氨基酸含量降低，也可能與其參與了煙堿的生物合成有關(guān)［31，34］。有研究表明在煙葉成熟后期，煙堿含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于煙葉達(dá)到了過熟狀態(tài)，葉片開始衰老，導(dǎo)致部分內(nèi)含物質(zhì)發(fā)生降解而損耗［35］。有研究認(rèn)為，煙葉游離氨基酸含量與煙葉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，在煙葉成熟過程中游離氨基酸含量呈先降低后升高的變化規(guī)律，最低值出現(xiàn)在煙葉工藝成熟時(shí)期，煙葉中游離氨基酸含量可以作為判斷煙葉成熟度的依據(jù)之一［18］。與碳水化合物相似，煙葉成熟過程中含氮化合物的變化規(guī)律在不同品種、生態(tài)環(huán)境和栽培條件下也略有差異。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)針對(duì)產(chǎn)區(qū)特點(diǎn)，探究煙葉成熟過程中化學(xué)成分與成熟度的關(guān)系，確定煙葉最佳采收期，將煙葉化學(xué)成分控制在適宜范圍內(nèi)。

表5 國內(nèi)外煙葉成熟過程中含氮化合物的變化主要研究結(jié)果Tab.5 Domestic and foreign researches on variations of nitrogen metabolites during tobacco leaf ripening

1.3 致香物質(zhì)

1.3.1 致香物質(zhì)的種類及測(cè)定方法

煙葉致香物質(zhì)含量是衡量烤煙品質(zhì)的重要因素之一。國外早在20 世紀(jì)50 年代就已經(jīng)從烤煙中分離鑒定出多種重要的香味成分如茄尼醇、新植二烯和揮發(fā)性脂肪酸等［41］。1976年，Lloyd等［42］借助蒸餾萃取和氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）從烤煙煙絲中分離鑒定出酮類、羧酸類、醇類、醛類、酚類和氮雜環(huán)類等共計(jì)323 種化合物。國內(nèi)對(duì)烤煙致香成分的研究較晚，1989年，李云等［43］利用氣相色譜技術(shù)從烤煙中鑒定出12種低級(jí)脂肪酸；1992年，冼可法等［44］從云南烤煙中鑒定出129 種中性致香成分。隨著前處理技術(shù)以及檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，同時(shí)蒸餾萃取、固相微萃取、液液微萃取、超臨界CO2萃取、加速溶劑萃取以及基于氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用的代謝組學(xué)分析手段逐漸應(yīng)用到煙葉致香成分分析中，大量致香成分被分離和鑒定出來［45］。

1.3.2 致香物質(zhì)與煙葉成熟度的關(guān)系

一般認(rèn)為在煙葉成熟過程中，類胡蘿卜素、類西柏烷和苯丙氨酸等致香前體物的降解產(chǎn)物以及棕色化反應(yīng)產(chǎn)物含量總體呈升高趨勢(shì)，達(dá)到最大值后開始下降，但由于煙葉致香物質(zhì)受生態(tài)因素影響較大，不同產(chǎn)區(qū)的研究結(jié)果存在較大差異，例如在四川省攀西地區(qū)，隨著成熟度增加，煙葉棕色化產(chǎn)物含量逐漸降低［46］，而在陜西省延邊地區(qū)，煙葉棕色化產(chǎn)物總量則呈上升趨勢(shì)［47］。此外，不同品種的致香物質(zhì)成分組成也存在差異，在烤煙NC89煙葉成熟過程中檢測(cè)到糖苷類香氣成分共28種，包括醛、酮、醇、內(nèi)酯和酚類等成分，而在云煙87煙葉中僅分離鑒定出21種糖苷類香氣成分，主要由脂肪醇、芳香族成分、倍半萜類和多酚類物質(zhì)組成，兩個(gè)烤煙品種煙葉中糖苷類香氣成分總量均隨成熟度的提升而增加［48-49］。目前，關(guān)于煙草致香物質(zhì)的研究大多集中在烤后煙葉中，對(duì)于田間鮮煙葉尤其是上部煙葉成熟過程中的變化研究較少，雖然在煙葉烘烤過程中致香物質(zhì)含量還會(huì)發(fā)生新的變化，但田間采收煙葉中致香物質(zhì)及前體物的基礎(chǔ)含量對(duì)煙葉品質(zhì)起著決定性作用。因此，選擇合理的采收期，保持適宜的煙葉致香物質(zhì)及前體物含量，對(duì)改善烤后煙葉香氣品質(zhì)具有重要意義。

1.4 質(zhì)體色素

煙葉成熟過程中最直觀的變化是顏色的改變，生產(chǎn)上葉片顏色是判斷成熟度的重要依據(jù)。煙葉顏色的變化實(shí)質(zhì)上是質(zhì)體色素含量變化的外在表現(xiàn)，質(zhì)體色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素等。葉綠素含量下降而導(dǎo)致的葉片失綠被認(rèn)為是植物衰老最顯著的特征，其與葉綠體中類囊體膜逐漸崩解有關(guān)［50］。觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（圖1）發(fā)現(xiàn)，在煙葉成熟過程中，細(xì)胞內(nèi)葉綠體首先出現(xiàn)衰老癥狀，具體表現(xiàn)為細(xì)胞空隙變大，葉綠體腫脹呈不規(guī)則形狀，基粒個(gè)數(shù)和類囊體數(shù)量逐漸減少，類囊體膜結(jié)構(gòu)喪失，淀粉粒和嗜鋨顆粒數(shù)量增多、體積增大，并向細(xì)胞中部游離［50-51］。

在煙葉成熟過程中，葉綠素、類胡蘿卜素和質(zhì)體色素總量均隨成熟度增加而逐漸降低，其中葉綠素較類胡蘿卜素含量下降速率更快，降解量更大，二者之間的比例變化使不同成熟度煙葉顏色產(chǎn)生差異［52］。由于煙葉葉綠素含量在成熟過程中變化顯著且易于測(cè)定，所以常被作為衡量煙葉成熟度的重要指標(biāo)。葉綠素儀可以快速檢測(cè)葉片中葉綠素相對(duì)含量（Soil and Plant Analyzer Development，SPAD），生產(chǎn)上可將煙葉田間SPAD值與其外觀顏色特征相結(jié)合，作為判斷煙葉成熟度的依據(jù)［53-54］。然而，SPAD儀雖然操作簡(jiǎn)單、使用方便，但只能進(jìn)行單點(diǎn)測(cè)量，測(cè)量誤差和樣本代表性的缺陷，限制了其大范圍推廣使用。近年來，多種現(xiàn)代信息獲取技術(shù)如計(jì)算機(jī)視覺技術(shù)、無人機(jī)遙感技術(shù)、高光譜技術(shù)和近紅外光譜技術(shù)等逐漸在煙草生產(chǎn)中得到應(yīng)用，通過建立光譜信息與煙葉成熟度的關(guān)系模型，可以實(shí)現(xiàn)煙葉成熟度的可視化分析［55-57］。無人機(jī)遙感和高光譜等技術(shù)雖然具有測(cè)量范圍大、精準(zhǔn)度高等優(yōu)勢(shì)，但技術(shù)門檻和成本較高，現(xiàn)階段并未廣泛應(yīng)用于煙葉成熟度判斷。因此，根據(jù)田間煙葉理化指標(biāo)的變化選擇更加科學(xué)合理的成熟度量化指標(biāo)和便捷高效的檢測(cè)方法、檢測(cè)設(shè)備，將是今后需重點(diǎn)解決的問題。

2 上部煙葉成熟過程中生物酶活性變化

2.1 碳代謝相關(guān)酶

植物的碳氮代謝過程離不開各種生物酶的參與，在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過程中，參與碳代謝的生物酶有淀粉合成酶（Starch synthase，SS）、淀粉酶（Amylase，AM）、蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，INV）和蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SUS）等［58］。AM 是碳水化合物積累代謝過程中的關(guān)鍵酶，可以將煙葉中積累的淀粉降解為麥芽糖和少量葡萄糖，目前關(guān)于煙葉AM 活性在成熟過程中的變化主要有3 種觀點(diǎn)：①雙峰變化，但達(dá)到峰值的時(shí)間還存在分歧［9，12］；②先升高后降低的單峰變化［58-59］；③先降低后升高的“U”形曲線變化，最低值時(shí)間與淀粉含量達(dá)到最高值的時(shí)間相吻合［21］，結(jié)果的差異主要與烤煙品種、生態(tài)環(huán)境及取樣標(biāo)準(zhǔn)等不同有關(guān)。蔗糖是植物體中碳水化合物運(yùn)輸?shù)闹饕问?，INV 可以催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，其活性大小反映了煙葉對(duì)光合產(chǎn)物的利用程度。楊志曉等［59］研究表明，煙葉INV 活性在成熟前期較低，呈緩慢增加趨勢(shì)，在成熟期活性迅速上升，不同品種間INV活性存在較大差異。INV活性前期較低，可能是因?yàn)闊熑~前期氮代謝活動(dòng)占主導(dǎo)，碳代謝活動(dòng)強(qiáng)度較弱，進(jìn)入葉片功能盛期后，氮代謝活動(dòng)開始減弱，轉(zhuǎn)為以碳代謝為主，轉(zhuǎn)化酶活性增強(qiáng)有利于促進(jìn)光合產(chǎn)物的合理分配。

2.2 氮代謝相關(guān)酶

植物的氮代謝包括氮素的吸收、同化、轉(zhuǎn)運(yùn)、利用和調(diào)節(jié)等過程。參與氮代謝的生物酶有硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）、谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）和谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）等［59］。1952 年，Evans 等［60］在紅色鏈孢霉中首次發(fā)現(xiàn)NR，次年又在高等植物中發(fā)現(xiàn)。NR 是植物氮代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，其作用是將植物吸收的硝態(tài)氮還原為亞硝態(tài)氮以供后續(xù)利用。2000年，Becker等［61］將植物GS分為2 類，細(xì)胞質(zhì)型（GS1）存在于根部細(xì)胞質(zhì)中，主要同化植物根系系統(tǒng)中硝酸還原作用產(chǎn)生的氨；質(zhì)體型（GS2）存在于綠色組織質(zhì)體中，負(fù)責(zé)同化硝酸還原和光呼吸所產(chǎn)生的氨。GS 與GOGAT 聯(lián)合作用下，將植物吸收的無機(jī)態(tài)氮同化為有機(jī)態(tài)的谷氨酰胺和谷氨酸，其活性大小可反映植物對(duì)氮素的同化利用情況［62］。隨著煙葉成熟度增加，NR活性先升高后降低，在移栽后30～60 d活性較強(qiáng)，在60～70 d后活性逐漸減弱，亞硝酸還原酶活性與NR活性變化規(guī)律大致相同［40］。賈保順等［63］研究發(fā)現(xiàn)，烤煙K326 和NC71的GS活性在移栽后70～110 d內(nèi)呈先升高后下降的變化，最高值出現(xiàn)在移栽后80 d，葉片中GDH活性、NH4+濃度與GS活性變化趨勢(shì)相同。氮代謝相關(guān)酶活性前期升高可能與葉片正處在功能盛期有關(guān)，此時(shí)氮代謝活動(dòng)較強(qiáng)，后期碳代謝活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，氮代謝活動(dòng)開始減弱。在煙葉成熟進(jìn)程中，碳氮代謝的強(qiáng)度、協(xié)調(diào)程度以及動(dòng)態(tài)變化會(huì)直接影響煙葉中各類化學(xué)成分的含量和比例，進(jìn)而影響煙葉品質(zhì)。優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的關(guān)鍵是在適當(dāng)發(fā)育時(shí)期，及時(shí)由以氮代謝為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐蕴挤e累代謝為主。因此，生產(chǎn)上可采用生物、化學(xué)和農(nóng)藝等措施有針對(duì)性地對(duì)碳氮代謝相關(guān)酶活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，以協(xié)調(diào)碳氮代謝進(jìn)程，提高上部煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)性，改善煙葉品質(zhì)。

2.3 衰老相關(guān)酶

衰老是植物發(fā)育過程中細(xì)胞、組織、器官和個(gè)體死亡的過程。在眾多衰老機(jī)制學(xué)說中，生物自由基導(dǎo)致衰老的學(xué)說比較受重視［64］。植物體內(nèi)的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）等是植物應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)重要的防御酶系，可以有效阻止活性氧自由基的積累［65］。SOD是生物體轉(zhuǎn)移清除超氧陰離子自由基（O2-·）的酶，能特異性地將O2-·歧化為H2O2和O2［66］。CAT 是一種包含血紅素的四聚體酶，在煙草中分離到的3個(gè)CAT同工酶中，Cat1主要負(fù)責(zé)清除光呼吸產(chǎn)生的H2O2，Cat2 則清除氧化脅迫產(chǎn)生的H2O2，而Cat3 主要清除乙醛酸循環(huán)體中產(chǎn)生的H2O2［67］。植物中的過氧化物酶有很多種，最常見的有抗壞血酸過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶和辣根過氧化物酶等。利用電泳法從辣根組織中分離出2 種不同的辣根過氧化物酶，在活性氧代謝過程中，POD可以清除光合作用過程中產(chǎn)生的過量H2O2，起到保護(hù)葉綠體的作用［68］。

植物衰老過程其實(shí)也是抗氧化酶活性下降、活性氧自由基積累、膜脂過氧化不斷加劇的過程。在煙葉衰老過程中，SOD、CAT和POD的活性一般呈逐漸降低的趨勢(shì)，但也有研究發(fā)現(xiàn)，在煙葉成熟前期抗氧化酶活性有短暫升高的現(xiàn)象［69-70］。此外，一些參與煙株防御體系的生物酶，如脂氧合酶和多酚氧化酶等在煙葉成熟過程中也呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)［70-71］。成熟前期煙株代謝旺盛，活性氧的少量積累對(duì)植物細(xì)胞損害較小，反而誘導(dǎo)了抗氧化酶活性的升高，但在成熟后期，煙株生理功能逐漸衰退，活性氧過量積累造成細(xì)胞大量損傷，抗氧化酶活性也隨之降低［72］。外界環(huán)境因素的改變會(huì)影響煙葉衰老進(jìn)程，如高溫、冷害、鹽脅迫等在一定程度上會(huì)加速煙葉衰老。噴施外源調(diào)節(jié)物質(zhì)，如水楊酸、硅、2，4-表油菜素內(nèi)酯等可以調(diào)節(jié)植物葉片抗氧化酶活性，完善植物體內(nèi)的防御體系，緩解惡劣環(huán)境脅迫對(duì)煙株造成的傷害［73-74］。因此，生產(chǎn)上遭遇環(huán)境脅迫條件時(shí)，可以根據(jù)大田煙株生長(zhǎng)實(shí)際情況，選擇適宜的外源調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)行噴施，以增強(qiáng)成熟期煙株的抗逆性。

3 上部煙葉成熟過程中基因表達(dá)變化

轉(zhuǎn)錄組是指細(xì)胞中所有參與蛋白質(zhì)翻譯的mRNA 總和，自20 世紀(jì)90 年代起，隨著分子生物技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)等的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)，科研人員在植物葉片衰老的分子機(jī)制方面取得了重大進(jìn)展。1995 年，Gan 等［75］將農(nóng)桿菌ipt基因在衰老啟動(dòng)子SAG12 的驅(qū)動(dòng)下在煙草中表達(dá)，延緩了煙葉衰老的進(jìn)程；2001 年，Yang 等［76］發(fā)現(xiàn)煙草中兩種堿性亮氨酸拉鏈（b-ZIP）家族的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)會(huì)促進(jìn)葉片衰老。目前，已從煙草和擬南芥等模式植物中克隆出大量與衰老相關(guān)的基因，根據(jù)這些基因在葉片衰老期間表達(dá)量的變化，可將其分為衰老上調(diào)基因和衰老下調(diào)基因［77］。相關(guān)基因在煙葉成熟過程中的功能主要集中在蛋白質(zhì)降解、碳氮代謝、色素代謝和激素代謝等方面。

3.1 蛋白降解相關(guān)基因

半胱氨酸蛋白酶是一種多功能水解蛋白酶，在植物衰老和細(xì)胞程序性死亡過程中起關(guān)鍵作用，煙草中NtCP1、NtCP2、NtCP23和MC是編碼半胱氨酸蛋白酶的基因［50］。2006 年，Beyene 等［78］從煙草衰老葉片和非衰老葉片中分離得到兩個(gè)與衰老相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶基因NtCP1和NtCP2，NtCP1是一種特異性表達(dá)基因，僅在自然衰老的葉片中表達(dá)，且不受外界不良條件的誘導(dǎo)，被認(rèn)為是煙草中良好的衰老標(biāo)記基因，NtCP2與NtCP1表達(dá)模式不同，其在成熟綠葉中表達(dá)量較高，而在衰老葉片中表達(dá)量顯著降低。在衰老葉片中，包括NTCP23在內(nèi)的許多編碼蛋白酶基因上調(diào)以參與氮素的轉(zhuǎn)移活動(dòng)。2000 年，Ueda等［79］從煙草中分離出編碼半胱氨酸蛋白酶的基因NtCP23，其表達(dá)模式與NtCP1相似，在衰老過程中上調(diào)表達(dá)，但在葉片生長(zhǎng)發(fā)育初期也能檢測(cè)到NtCP23的表達(dá)。PSA1是編碼26S 蛋白酶體的非催化型亞基，在煙葉衰老過程中其表達(dá)量逐漸降低，有學(xué)者推測(cè)蛋白酶體在植物細(xì)胞中的作用可能是調(diào)節(jié)蛋白水平來控制發(fā)育過程，而不是在衰老過程中降解蛋白質(zhì)［50］。在煙葉衰老過程中，NtCP1、NtCP23、PSA1和MC在不同烤煙品種中的變化規(guī)律基本一致，基因NtCP1和NtCP23在衰老過程中上調(diào)表達(dá)，PSA1和MC基因下調(diào)表達(dá)。不同烤煙品種之間的差異在于各基因表達(dá)量的不同，成熟落黃快的品種NtCP1和NtCP23的表達(dá)量較高，PSA1和MC的表達(dá)量較低［22］。

3.2 碳氮代謝相關(guān)基因

關(guān)于煙葉成熟過程中碳氮代謝相關(guān)基因的研究主要以編碼生物酶的基因?yàn)橹?。顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）和淀粉分支酶（SBE）是淀粉合成的關(guān)鍵酶，分別參與直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成，他們由相應(yīng)的淀粉合成酶基因GBSS1、SBE等編碼。在煙葉成熟過程中，GBSS1和SBE基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后下降的變化，與淀粉含量在成熟過程中的變化一致［22］。蔗糖合成酶基因（NtSS）、蔗糖磷酸合成酶基因（NtSPS）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因（NtINV）參與煙葉的糖代謝過程。在煙葉成熟過程中，NtINV表達(dá)量大致呈單峰曲線變化，NtSS和NtSPS表達(dá)量均有不同程度上調(diào)，且品種之間變化規(guī)律一致，說明煙葉進(jìn)入成熟期后糖代謝活動(dòng)逐漸增強(qiáng)［80］。在氮代謝方面，NR 是整個(gè)氮代謝過程中的限速酶和關(guān)鍵酶，其編碼基因在葉片衰老過程中表達(dá)量逐漸降低［81］。周健飛等［82］指出，在煙葉成熟過程中，NR 基因的表達(dá)豐度僅與NR 活性呈極顯著正相關(guān)，對(duì)成熟期氮效率影響較小，成熟期煙葉氮素運(yùn)籌主要受GS同工酶基因表達(dá)豐度的影響。在煙葉衰老過程中，GS1 調(diào)控氮素的轉(zhuǎn)移及再利用，GS2 負(fù)責(zé)氨同化作用［83］，GS1 編碼基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，GS2 編碼基因表達(dá)量則逐漸下降，表明隨著煙葉衰老其氮素轉(zhuǎn)移能力逐漸加強(qiáng)，而氮素同化能力逐漸減弱［22，82］。GDH在煙葉衰老過程中主要負(fù)責(zé)脫氫，編碼GDH的基因有GDH1和GDH2，它們的表達(dá)量在煙葉衰老過程中均增加，其轉(zhuǎn)錄水平在衰老后期最高［50］，但也有研究發(fā)現(xiàn)GDH1的相對(duì)表達(dá)量在衰老過程中呈先升高后降低的趨勢(shì)［81］，相關(guān)差異的原因還需進(jìn)一步研究。

3.3 色素代謝相關(guān)基因

在煙葉成熟過程中，與類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因GGPS、PSY、PDS、ZDS和CRTISO均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ORANGE、HY5、COP1和DET1也呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。與之相反，類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化基因NCED、ZEP、NXS以及與類胡蘿卜素降解相關(guān)的基因LOX、POD、CCD1則上調(diào)表達(dá)［84］。葉綠素酶是分解葉綠素的初始酶，CLH是編碼葉綠素酶的基因，在煙葉衰老過程中，CLH表達(dá)整體增強(qiáng)，說明在煙葉成熟過程中，葉綠素與類胡蘿卜素的分解代謝逐漸增強(qiáng)，類胡蘿卜素的合成逐漸減弱，這與煙葉中質(zhì)體色素含量降低的變化規(guī)律一致［85］。目前，從擬南芥和水稻中鑒定出6種葉綠素代謝酶［86］，相關(guān)基因在葉片衰老過程中的變化在其他作物上有較多研究［86-87］，而在上部煙葉成熟過程中的變化研究則相對(duì)較少。

3.4 激素代謝相關(guān)基因

內(nèi)源激素是植物體內(nèi)重要的信號(hào)物質(zhì)，對(duì)葉片的成熟衰老進(jìn)程起重要調(diào)控作用。煙葉成熟過程中，參與乙烯、脫落酸和茉莉酸合成的相關(guān)基因NtEFE26、NtNCED和NtPR1b表達(dá)量均呈升高趨勢(shì)，在衰老煙葉中達(dá)到最高值，與相應(yīng)激素含量的變化趨勢(shì)相同［88］。生長(zhǎng)素（IAA）和細(xì)胞分裂素（CTK）被認(rèn)為是延緩衰老的激素，在煙葉衰老過程中，IAA負(fù)調(diào)控因子AuX/IAA與SAUR家族蛋白的相關(guān)基因表達(dá)量均呈升高趨勢(shì)，IAA合成受到抑制，這與IAA含量在煙葉衰老過程中下降的變化相一致［89］。在衰老葉片中CTK含量顯著下降，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，與CTK降解有關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，而與CTK合成相關(guān)的基因則下調(diào)表達(dá)［90］。NtCHN50是水楊酸應(yīng)答基因，在煙葉成熟過程中其表達(dá)量逐漸降低，預(yù)示著水楊酸合成減弱［88］，但對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，在衰老葉片中水楊酸的濃度提高了4倍，衰老葉片中較高的水楊酸含量似乎與葉片衰老過程中幾種SAG的上調(diào)表達(dá)有關(guān)［91］，差異的原因還需進(jìn)一步研究。

4 上部煙葉成熟過程中蛋白表達(dá)變化

4.1 蛋白組學(xué)技術(shù)在煙草上的應(yīng)用

自20世紀(jì)90年代起，伴隨著蛋白組學(xué)技術(shù)體系的不斷發(fā)展，蛋白組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物不同生長(zhǎng)發(fā)育階段以及在各種環(huán)境因子和逆境脅迫下的蛋白表達(dá)差異研究中［92］。2008年，Hebeler等［93］用蛋白組學(xué)技術(shù)分析了擬南芥早期衰老葉片的蛋白豐度變化，鑒定出13個(gè)差異顯著的蛋白。2010年，Bai等［94］研究了牽?；ㄋダ线^程中蛋白組的變化，發(fā)現(xiàn)許多衰老上調(diào)蛋白參與了防御和應(yīng)激反應(yīng)等生物活動(dòng)。蛋白組學(xué)技術(shù)在煙草上的應(yīng)用起步相對(duì)較晚，目前主要集中在不同基因型、不同生態(tài)環(huán)境以及脅迫條件下差異蛋白的研究。2008 年，崔紅等［95］對(duì)濃香型和清香型典型生態(tài)區(qū)的煙葉進(jìn)行蛋白組學(xué)比較分析，發(fā)現(xiàn)有51個(gè)蛋白在兩個(gè)生態(tài)區(qū)發(fā)生了差異表達(dá)，在福建煙區(qū)高表達(dá)的蛋白主要參與葉綠體發(fā)育、色素代謝和光合作用，而在河南煙區(qū)高表達(dá)的蛋白主要參與糖代謝途徑，為從蛋白水平解釋不同生態(tài)區(qū)煙葉品質(zhì)差異提供了參考。2016 年，徐瑩等［96］對(duì)云煙87、K326和紅花大金元成熟期煙葉蛋白組分析發(fā)現(xiàn)，云煙87與烤煙K326煙葉中蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜相似，僅存在29 個(gè)差異表達(dá)蛋白，而云煙87 和紅花大金元之間則有160個(gè)蛋白質(zhì)差異表達(dá)，差異蛋白多與光合作用、物質(zhì)代謝和抗逆性有關(guān)。2019 年，Chen等［97］基于同位素相對(duì)標(biāo)記和絕對(duì)定量（iTRAQ）的蛋白組學(xué)分析研究表明，豫煙6號(hào)和云煙87 在水分脅迫下蛋白組表達(dá)水平存在差異，與云煙87相比，豫煙6號(hào)表現(xiàn)出更強(qiáng)的保水能力、更好的光合性能、更強(qiáng)的抗氧化防御能力，為研究煙草干旱脅迫反應(yīng)相關(guān)的遺傳調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4.2 煙葉成熟衰老過程中的蛋白組學(xué)研究

近年來，在蛋白水平上解釋煙葉成熟過程中的成分變化逐漸受到人們的關(guān)注。2014 年，張柳等［98］采用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)云南玉溪地區(qū)云煙87旺長(zhǎng)期、成熟期和成熟后期煙葉的蛋白組進(jìn)行了分析，共檢測(cè)到432 個(gè)差異表達(dá)蛋白，主要集中在以下幾個(gè)方面：（1）光合作用，如與光反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)（如PSⅠ和PSⅡ反應(yīng)中心蛋白等）和與暗反應(yīng)中CO2同化相關(guān)的蛋白（Rubisco及其活化酶等）在衰老過程中均呈下調(diào)表達(dá)。（2）糖酵解代謝，如α-葡聚糖焦磷酸化酶、α-葡萄糖苷酶類、與糖類轉(zhuǎn)化及糖核苷酸合成相關(guān)酶類均上調(diào)表達(dá)。（3）蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝，如天冬氨酸蛋白酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶等上調(diào)表達(dá)。（4）逆境反應(yīng)，如熱激蛋白和分子伴侶總體上調(diào)表達(dá)。（5）脂類代謝，如甘油酯水解酶類和磷脂類水解酶表達(dá)水平升高。這些現(xiàn)象表明，在煙葉衰老過程中葉片光合作用強(qiáng)度逐漸減弱，呼吸代謝、物質(zhì)分解代謝活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，同時(shí)抗逆相關(guān)蛋白表達(dá)的升高說明煙葉衰老對(duì)植物體本身也是一種逆境反應(yīng)。何聰蓮等［99-100］采用iTRAQ對(duì)烤煙K326未熟、適熟和過熟期煙葉的蛋白組進(jìn)行分析，共鑒定出86個(gè)共同差異表達(dá)蛋白，這些差異蛋白涉及代謝過程、細(xì)胞過程和應(yīng)激反應(yīng)等，最終篩選出 包 括Q1WL43、A0A1S4DCM1、A0A1S4C433、A0A1S4AKK6、A0A1S3ZQP6 和A0A140G1P2 在內(nèi)的6個(gè)差異蛋白，可能是煙葉衰老潛在靶標(biāo)蛋白。

5 總結(jié)與展望

目前，我國在上部煙葉成熟度研究和應(yīng)用方面仍存在一些問題：①關(guān)于成熟度與煙葉品質(zhì)關(guān)系的研究，主要集中在田間煙葉成熟度對(duì)烤后煙葉品質(zhì)的影響，而對(duì)成熟過程缺乏關(guān)注，田間煙葉成熟過程中物質(zhì)轉(zhuǎn)化規(guī)律和內(nèi)在生理生化研究不夠深入。②上部煙葉的采收成熟度判斷仍然靠主觀經(jīng)驗(yàn)，缺乏統(tǒng)一的特征指標(biāo)、判斷標(biāo)準(zhǔn)和便捷的測(cè)定方法，在生產(chǎn)操作中不易把控，上部煙葉采青現(xiàn)象仍然存在；部分產(chǎn)區(qū)由于過分強(qiáng)調(diào)成熟度，導(dǎo)致上部煙葉出現(xiàn)物質(zhì)消耗過度、品質(zhì)下降等問題。③國內(nèi)許多產(chǎn)區(qū)主要采用延遲采收技術(shù)提高煙葉成熟度，由于在煙葉生長(zhǎng)后期部分產(chǎn)區(qū)氣溫下降較快，導(dǎo)致煙葉表面易形成蠟質(zhì)層，使煙葉難以成熟，給烘烤帶來困難。煙葉生育后期降水增多帶來的病害問題也限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。④在外源調(diào)節(jié)劑調(diào)控上部煙葉開片和成熟度方面研究尚不深入，應(yīng)用也較少。

針對(duì)上述問題，未來可先從典型產(chǎn)區(qū)和主要栽培品種入手開展相關(guān)研究。①借助轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組學(xué)的相關(guān)技術(shù)手段，從關(guān)鍵酶活性、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)和生物小分子代謝物等多角度出發(fā)，系統(tǒng)研究上部煙葉成熟過程中的物質(zhì)代謝規(guī)律，篩選煙葉成熟過程中起重要調(diào)控作用的關(guān)鍵基因和代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行功能驗(yàn)證和機(jī)制解析。②深入開展烤煙上部煙葉成熟調(diào)控研究，研制篩選對(duì)烤煙上部煙葉成熟具有較好調(diào)控作用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并揭示其作用機(jī)理。③選擇適宜種植區(qū)域，保證煙株?duì)I養(yǎng)均衡，提高煙葉耐熟性，以煙株?duì)I養(yǎng)均衡+成熟采收為核心提高上部煙葉品質(zhì)。④在煙葉田間成熟度特征指標(biāo)、判斷標(biāo)準(zhǔn)、測(cè)定方法和測(cè)定設(shè)備等方面加強(qiáng)研究，針對(duì)不同的生態(tài)區(qū)域，形成上部煙葉成熟度判斷和采收標(biāo)準(zhǔn)，制定精準(zhǔn)的上部煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范。