三種牙膏配方的防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

邢叢衍 陳玉玲

(云南諾特金參口腔護(hù)理用品有限公司 云南 昆明 650212)

引言

在牙膏監(jiān)管越來(lái)越嚴(yán)的今天，添加中藥提取物、草本成分的牙膏越來(lái)越多，但植物類提取物質(zhì)量控制較難，特別是微生物經(jīng)常超標(biāo)。為了更好地了解牙膏成品的微生物警戒線，防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)是比較直觀有效的方法。但牙膏還沒(méi)有專門的防腐體系檢測(cè)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，只能參考現(xiàn)行的化妝品防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，再完成牙膏的防腐試驗(yàn)方法。對(duì)于試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)的難點(diǎn)在于代表性牙膏類型、培養(yǎng)基、中和劑、自選菌種的選擇，防止培養(yǎng)基的不適應(yīng)、假陰性等造成結(jié)果的誤差，試驗(yàn)前需先做好相關(guān)驗(yàn)證工作，本研究不討論試驗(yàn)前驗(yàn)證工作。

選用苯甲酸鈉為防腐劑是因?yàn)樵谘栏嘀械膽?yīng)用已經(jīng)比較成熟，一般添加量在0.2%～0.5%，其防腐效能受pH值影響較大，殺菌和抑菌效力隨介質(zhì)的酸度增高而增強(qiáng)，不適合用于碳酸鈣牙膏[1]。

經(jīng)常年牙膏用中藥提取物的檢測(cè)，其帶菌量比較大，液體提取物中微生物繁殖快，在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有芽孢存在。經(jīng)過(guò)SN/T 0178-2011嗜熱菌芽孢標(biāo)準(zhǔn)和SN/T 2206.2-2009需氧芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)和驗(yàn)證，證明大多數(shù)提取物帶菌為革蘭氏陽(yáng)性蠟樣芽孢桿菌，兼性厭氧。其形態(tài)為白蠟狀，表面扁平、不規(guī)則、帶有光澤的近似圓形質(zhì)地柔軟的菌毯，挑起來(lái)呈現(xiàn)絲狀，有很強(qiáng)的蔓延能力，對(duì)外界有害因子抵抗力強(qiáng)，會(huì)產(chǎn)生防御性內(nèi)芽孢[2]。特選取蠟樣芽孢桿菌通過(guò)GB/T 4789.14-2014分離、純化，為自選菌種。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

卵磷脂-吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、SCDLP液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基均為北京三藥)、生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

菌種：黑曲霉CMCC(F)98003、大腸埃希氏菌CMCC(B)44102、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、銅綠假單胞菌CMCC(B)10104、白色假絲酵母菌ATCC10231。廣東環(huán)凱微生物科技有限公司制造。

自選菌種：蠟樣芽孢桿菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)用牙膏

防腐劑均為苯甲酸鈉，用量均為0.2%，基礎(chǔ)配方中發(fā)泡劑均為十二烷基硫酸鈉，增稠劑均為CMC、黃原膠，保濕劑、香精、甜味劑等均一致。樣品無(wú)菌，不含氟。

樣品1：磷酸氫鈣與二氧化硅復(fù)配。

樣品2：二氧化硅透明兒童牙膏。

樣品3：功效牙膏，磷酸氫鈣，含中藥提取物。

1.4 中和劑選擇

依據(jù)《T/SHRH 017-2019》附錄B常見(jiàn)中和劑參考表，苯甲酸類防腐劑無(wú)對(duì)應(yīng)中和劑。但存在K12等表活性物質(zhì)，牙膏又屬于親水性膏體，培養(yǎng)基里已有卵磷脂和吐溫80，所以不再添加中和劑。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 菌種復(fù)蘇和傳代

菌種：用注射器全部吸出配套的復(fù)蘇液，再注入凍干菌種所在的瓶?jī)?nèi)，搖勻，吸取100微升菌液于培養(yǎng)皿中，細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)48h，真菌、酵母接種于SDA培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱28℃±2℃培養(yǎng)2～5天。

將復(fù)蘇后菌種傳代至第3代，細(xì)菌傳代培養(yǎng)基使用TSA，真菌、酵母使用SDA培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)條件與復(fù)蘇條件相同。

2.2 菌種懸濁液制備

將第3代菌種培養(yǎng)與于試管斜面，用10ml無(wú)菌生理鹽水沖洗菌苔至單獨(dú)的無(wú)菌試管中搖勻，細(xì)菌、真菌分別等比例混合，自選菌種單獨(dú)使用。

菌量選用：CTFA推薦量為霉菌10000CFU/ml，細(xì)菌1000000CFU/ml。

T/SHRH 017-2019中國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)為108CFU/ml。

2.3 試驗(yàn)方法

依照不同標(biāo)準(zhǔn)有不同的方法，在此選用一次加菌28天試驗(yàn)，同時(shí)監(jiān)控pH數(shù)值。根據(jù)微生物數(shù)量變化來(lái)評(píng)價(jià)產(chǎn)品的防腐效果。

2.4 試驗(yàn)步驟

3種樣品各取300g，每個(gè)樣品平均分裝于3個(gè)無(wú)菌錐形瓶中并編號(hào)，每個(gè)瓶中加入1種菌懸液1ml攪拌均勻，加了蠟樣芽孢桿菌、細(xì)菌懸濁液試樣培養(yǎng)在36℃±1℃，真菌、酵母懸濁液試樣培養(yǎng)在28℃±2℃。在試驗(yàn)的第0、3、7、14、21、28天取樣試驗(yàn)；使用含無(wú)菌玻璃球的90ml生理鹽水的錐形瓶，稱取10g樣品攪拌均勻，做8個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度做平行樣，每次試驗(yàn)的第一個(gè)稀釋度取10ml置于90ml已滅菌的SCDLP中觀察是否出現(xiàn)假陰性，細(xì)菌使用卵磷脂-吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌、酵母使用SDA培養(yǎng)基。計(jì)數(shù)按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)第五章進(jìn)行。

2.5 評(píng)價(jià)方法選擇

根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)，目前有3種評(píng)價(jià)方法見(jiàn)表1。

表1 CTFA所用一次加菌的微生物防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表2 T/SHRH 017-2019，T/GDCDC 010-2019防腐效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

防腐效果可以以菌落數(shù)的對(duì)數(shù)減少值(RX)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

計(jì)算方式見(jiàn)式(1)。

RX =lgNO-lgNX

(1)

式中：NO——菌液在樣品中的初始濃度；

NX——樣品在不同檢測(cè)時(shí)間的菌落數(shù)。

表3 國(guó)內(nèi)參照CTFA加菌防腐挑戰(zhàn)性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

其中表1、3相似，所以選擇CTFA一次加菌的微生物防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，和中國(guó)團(tuán)體防腐效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)和對(duì)比。

3 結(jié)果與評(píng)價(jià)

3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用中國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果(見(jiàn)表4、表5、表6)。

表4 細(xì)菌檢測(cè)數(shù)據(jù)表

表5 自選菌檢測(cè)數(shù)據(jù)表

表6 真菌、酵母檢測(cè)數(shù)據(jù)表

pH值變化見(jiàn)表7。

表7 pH值檢測(cè)數(shù)據(jù)表

從表中可以看出細(xì)菌、真菌、酵母混懸液在剛加入時(shí)，防腐劑就開(kāi)始起效，牙膏pH值也在逐步降低，細(xì)菌在第21天以后，真菌、酵母在第14天以后可以保持不大于10cfu/g，在以上3種牙膏類型中苯甲酸鈉防腐劑效果無(wú)太大偏差，對(duì)不同配方體系的影響不大。對(duì)于蠟樣芽孢桿菌，其能在牙膏中呈現(xiàn)增殖和自然減少的規(guī)律，可見(jiàn)苯甲酸鈉防腐劑和牙膏體系對(duì)其無(wú)任何防腐效果。

選用CTFA菌種濃度的所有樣品的結(jié)果為，霉菌第0～28天全未檢出，細(xì)菌第3～28天為0cfu/g，通過(guò)SCDLP培養(yǎng)后無(wú)假陰性存在，蠟樣芽孢桿菌第0～28天仍然存在104cfu/g。

3.2 評(píng)價(jià)對(duì)比

選用CTFA一次加菌評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看全部?jī)?yōu)秀通過(guò)，但通過(guò)結(jié)果可以看出CTFA的加菌量和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不適用苯甲酸鈉作為防腐劑的牙膏。

使用對(duì)數(shù)減少值(RX)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用最嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ計(jì)算(表8)。

表8

如表8所示，全部通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ，但團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)方法也不太適用于牙膏，缺少T0、T3時(shí)間段的對(duì)數(shù)差評(píng)判。

4 結(jié)論

上述試驗(yàn)表明，國(guó)內(nèi)外防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)方法可以基本滿足牙膏防腐試驗(yàn)，但防腐效能評(píng)價(jià)方法對(duì)于牙膏來(lái)說(shuō)，在評(píng)價(jià)時(shí)間上需要再細(xì)分T7以前的時(shí)間，來(lái)細(xì)化標(biāo)準(zhǔn)。

在上述配方中，苯甲酸鈉為防腐劑，其防腐效果差別不大，能通過(guò)防腐試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)微生物的警戒線做判斷。但對(duì)于蠟樣芽孢桿菌的抑制效果來(lái)看，防腐體系是有重大缺陷的，往后在質(zhì)量控制中，應(yīng)盡量使用無(wú)菌的中藥、植物類提取物，研發(fā)也應(yīng)盡快找到能包含蠟樣芽孢桿菌抗菌譜的防腐劑組合或單一防腐劑。