基于二氰基異佛爾酮近紅外熒光探針的合成及其可視化檢測銅離子特性研究

王 洋鄧振鵬鄧蘭蘭霍淑慧周鵬鑫黃現(xiàn)強

(1.西北師范大學 化學化工學院，甘肅 蘭州 730070；2.聊城大學 化學化工學院，山東 聊城 252059)

0 引言

銅作為人體不可或缺的一種微量元素，人們通常由日常飲食攝入[1]。銅離子對于人體的正常代謝、發(fā)育等有著非常重要的影響[2]，但是當銅離子含量超過人體細胞的需要時，過量的銅離子也會引起蛋白質(zhì)的沉淀，破壞細胞的原生質(zhì)[3]，并且細胞中過量的銅離子也會破壞人體的神經(jīng)系統(tǒng)，導致人體患上阿爾茨海默病、帕金森病等[4]。而Cu2＋易通過食物鏈富集，最終嚴重危害人體健康。因此，對于環(huán)境中和人體內(nèi)Cu2＋的檢測很有必要。傳統(tǒng)的檢測方法包括電感耦合等離子體法(ICP-MS)，原子吸收光譜法(AAS)、電化學法等[5]。這些方法需要依賴大型儀器，使得Cu2＋的檢測成本高昂；且操作復雜，無法迅速地檢測Cu2＋。熒光探針具有易操作、成本低廉、專一識別、肉眼可見等優(yōu)點，近年來被廣泛應用于Cu2＋的檢測[6]。科學家們在設計熒光探針時，由于具有近紅外發(fā)射的熒光探針分子具有細胞毒性低、良好的生態(tài)環(huán)境和生物兼容性、強的組織穿透力、小的細胞組織損傷性等優(yōu)點，都希望探針分子擁有近紅外的發(fā)射[7，8](＞600 nm)；且為了避免吸收光譜和發(fā)射光譜之間光譜重疊較大，科學家們盡可能地追求大的Stokes位移，從而使得探針分子在熒光發(fā)射中盡可能地提高熒光輻射在能量耗散中的比例。其中，二氰基異佛爾酮是一種良好的熒光母體，具有Stokes位移大、近紅外發(fā)光、易合成等特點，近年來被廣泛應用于各種離子(分子)的檢測[9]。目前的Cu2＋探針雖然取得了較大的進展，但是存在選擇性差，其他金屬離子對Cu2＋的檢測具有一定的干擾性；Stokes位移小，導致探針分子的吸收光譜和發(fā)射光譜之間有重疊，致使探針分子的熒光輻射比例降低；發(fā)射波長短，使得探針分子的細胞毒性高、生物兼容性差，難以應用于生物體體內(nèi)內(nèi)源性和外源性Cu2＋的檢測[10]。因此，合成了一種基于二氰基異佛爾酮母體用于專一識別Cu2＋的探針W1，探針W1擁有近紅外的熒光發(fā)射、大的Stokes位移；多個N、O 原子，可以很好的與Cu2＋配位，從而傳遞熒光信號且不受其他金屬離子干擾。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

所用試劑均為分析純，購買自上海泰坦科技股份有限公司，金屬離子溶液均來自于相應的硝酸鹽，以二級去離子水定容。核磁測定:Varian Mercry 400plus超導核磁共振波譜儀，400/600 MHz for1H NMR，150 MHz for13C NMR)，以四甲基硅烷(TMS)做內(nèi)標.在氘代溶劑中測定。質(zhì)譜:HP5989B質(zhì)譜儀。紫外可見吸收光譜(UV):Shimadzu Model 3 100 UV-vis紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。熒光發(fā)射光譜:F97 pro熒光分光光度計熒光光譜儀(南京諾泰施格科學儀器有限公司)。激發(fā)波長為416 nm，激發(fā)狹縫寬度和發(fā)射狹縫寬度為10 nm。掃描速度:1 000 nm/min。

1.2 化合物1的合成

化合物1的合成按照已經(jīng)報道的方法合成[11]:在100 m L的兩口瓶中，將異佛爾酮(1.38 g，10 mmol)和丙二腈(0.66 g，10 mmol)溶解于8 m L DMF中，再分別加入300μL哌啶和250μL乙酸酐以及150μL冰醋酸，混合體系在室溫下攪拌6 h，然后將混合物在氮氣保護下回流(120 ℃)4 h，反應結(jié)束后，將混合物倒入1 000 m L冰水中，有大量黑色沉淀析出，過濾收集沉淀，置于真空烘箱中干燥過夜；接著，用異丙醇/水重結(jié)晶得到黃色固體1.39 g，產(chǎn)率:75%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:6.60(d，J＝1.2 Hz，1H)，2.50(s，2H)，2.16(s，2H)，2.02(s，2H)，1.00(s，6H).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:170.05，159.46，120.25，112.86，77.92，45.6，42.32，32.05，27.50，24.99。

1.3 化合物2的合成

化合物2的合成參照文獻報道的方法[12]，具體如下:在100 m L 的兩口瓶中，將化合物2-1(372 mg，2 mmol)和對羥基苯甲醛(244 mg，2 mmol)溶于10 m L乙醇中，分別加入100μL 哌啶和冰醋酸作為催化劑，混合體系在氮氣保護下回流(80 ℃)6 h，冷至室溫后，減壓下除去溶劑，用二氯甲烷/水萃取，收集有機并用無水硫酸鈉干燥過夜，粗產(chǎn)品用硅膠柱色譜純化(洗脫劑:二氯甲烷)，得到紅色固體化合物435 mg，產(chǎn)率:75%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:9.87(s，1H)，9.87(s，1H)，7.81(d，J＝8.7 Hz，2H)，7.42(d，J＝8.7 Hz，2H)，6.96(d，J＝8.6 Hz，2H)，6.86(d，J＝8.6 Hz，2H)，2.59(s，4H)，1.07(s，6H).13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ:170.32，159.41，156.76，138.35，129.94，127.19，126.32，121.44，115.95，114.20，113.38，74.89，42.40，38.28，31.74，27.52。

1.4 化合物3的合成

化合物3的合成參照文獻報道的方法[13]:將化合物2(360 mg，1.24 mmol)溶解于5 m L 三氟乙酸中，再加入烏洛托品(348 mg，1.2 mmol)，混合物加熱回流，用TLC法檢測至原料點消失(約2 h)，反應完成后，倒入大量冰水中，有固體析出，收集并干燥固體，用硅膠色譜柱純化(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯＝20/1，v/v)，得到黃色固體化合物241 mg，產(chǎn)率:61%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.18(s，1 H)，9.94(s，1H)，7.72(s，1H)，7.05(d，J＝8.5 Hz，1H)，7.00(s，1 H)，6.92(d，J＝16.2 Hz，1 H)，6.85(s，1 H)，2.61(s，2 H)，2.46(s，2 H)，1.09(s，6H).13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:196.23，169.04，162.54，153.33，135.31，134.73，132.93，128.36，128.02，123.53，120.69，118.70，112.63，42.93，39.20，32.01，27.99。

1.5 化合物4的合成

在50 m L單口瓶中，將水楊醛(244 mg，2 mmol)溶于10 m L 乙醇中，攪拌下加入水合肼(500 mg，10 mmol)，然后加入100μL冰醋酸，混合物攪拌回流(80 ℃)過夜，反應完成后，減壓除去溶劑，粗品用二氯甲烷重結(jié)晶得到198 mg白色細針狀晶體，產(chǎn)率:70%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.41(s，1H)，8.72(s，1 H)，7.39(dd，J＝18.2，7.9 Hz，2 H)，7.04(d，J＝8.2 Hz，1 H)，6.98(d，J＝7.5 Hz，1H)，1.26(s，2H)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:164.69，159.80，133.43，132.99，119.72，117.21。

1.6 探針W1的合成

在50 m L單口瓶中，將化合物3(32 mg，0.01 mmol)和化合物4(14 mg，0.01 mmol)溶解于20 m L乙醇中，再加入3滴冰醋酸，接著，混合物在80℃下回流至原料點消失(約14 h)，反應完成后，待混合物冷至室溫后，將混合物倒入100 m L碎冰中，有紅色沉淀析出，收集并干燥粗品，用硅膠色譜柱純化(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯＝10/1，v/v)，得到21 mg紅色固體，產(chǎn)率38%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:11.70(s，1H)，11.31(s，1 H)，8.74(s，2H)，7.60(d，J＝8.1 Hz，1 H)，7.50(s，1 H)，7.46～7.36(m，2 H)，7.12～7.03(m，2H)，7.02～6.96(m，2H)，13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:153.99，140.63，134.29，133.11，132.95，129.32，129.29，129.20，128.26，128.04，109.99，55.99，40.30，33.31，29.66，18.66。HRMS(ESI):calculated for C27H24N4O2:[M＋H＋]:437.1971；Found:437.197 2。

1.7 探針檢測限的計算

采用熒光分析法測定檢測限.連續(xù)測定空白樣品(W1，10μmol/L；VDMF/VPBS＝7/3，p H ＝7.4)的熒光強度11次，計算得到空白樣品的標準偏差，再用下式計算求得檢測限

式中XLOD是檢測限，σ是連續(xù)十一次空白樣品的標準偏差，k是線性方程的斜率。

2 結(jié)果與討論

2.1 測試條件的優(yōu)化

為了更好的研究探針分子對Cu2＋的識別體系，測試了探針分子在N，N 二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、乙腈(ACN)、四氫呋喃(THF)這幾種能和水以任意比互溶的溶劑中探針分子的熒光發(fā)射，從圖1(a)可看出，探針分子在DMF溶劑中熒光發(fā)射最強，這是由于探針W1在DMF中擁有良好的溶解性，其作為極性非質(zhì)子溶劑不會干擾探針分子本身存在的激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)，且DMF 溶劑極性相對較強，探針分子本身存在分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，DMF 溶劑中能促進這種分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移且分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的激發(fā)態(tài)在大極性溶劑中更加穩(wěn)定，因而探針W1在DMF溶劑中熒光更強。除此之外，探針分子擁有席夫堿結(jié)構(gòu)，應該存在聚集誘導發(fā)光(AIE)效應，為此，我們研究了探針分子在良溶劑(DMF)，不良溶劑(H2O)不同比例下的熒光發(fā)射，如圖2(b)所示那樣，結(jié)果表明，在DMF/H2O(7/3，v/v)體系下熒光發(fā)射最強，當水分數(shù)從10%增加到30%時，探針分子的熒光發(fā)射逐漸增強，這是由于不良溶劑的增加致使探針分子逐漸聚集，亞胺鍵的異構(gòu)化被抑制，使得非輻射能量耗散降低[14](AIE 效應)；而當探針分子從30%增加到90%時，熒光逐漸降低，這是由于水分的進一步增加，導致探針分子更加聚集，形成了H-聚集體[15]。因此，我們之后的熒光測試都在DMF/PBS(7/3，v/v)體系中進行。

圖1 探針W1的合成

圖2 (a) 探針W1在不同溶劑中的熒光發(fā)射; (b) 探針W1在不同DMF/H 2 O 比例體系中的熒光發(fā)射

2.2 探針W1對Cu2+的選擇性識別

如圖3所示，進一步研究了探針W1對金屬離子的響應，在(DMF/PBS，7/3，v/v)體系中，分別加入十倍Cu2＋當量的金屬離子(Ag＋、Na＋、K＋、Mg2＋、Fe3＋、Al3＋、Ca2＋、Zn2＋、Cr3＋、Pb2＋、Hg2＋、Ba2＋、Co2＋、Ni2＋)，可以看出，探針分子對上述金屬離子幾乎沒有響應，而1倍當量Cu2＋的加入?yún)s使得探針W1的熒光降至原來的十分之一。表明這些金屬離子與探針分子存在的相互作用力非常弱，對探針分子檢測Cu2＋幾乎沒有干擾，所以探針W1對Cu2＋的識別具有良好的選擇性。

圖3 (a) 探針W1與不同金屬離子響應的熒光曲線; (b) 探針W1與不同金屬離子響應的柱形圖

2.3 探針W1對Cu2+的時間響應及其在不同p H 下對Cu2+的識別探究

按照1.1節(jié)實驗條件，在(DMF/PBS，7/3，v/v)體系中探究了過量Cu2＋加入探針W1探針溶液中時的熒光發(fā)射光譜圖4(a)，由圖4可見，在加入Cu2＋后熒光迅速猝滅，僅120 s后探針分子的熒光強度已經(jīng)降至穩(wěn)定且不再變化，這表明探針W1可以迅速識別Cu2＋。為了研究不同p H 下探針分子對Cu2＋的識別，用不同比例的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉調(diào)節(jié)PBS緩沖體系的p H 為3～11，在(DMF/PBS，7/3，v/v)體系中測試了不同p H 下的探針分子及加入1當量Cu2＋后的熒光發(fā)射，結(jié)果表明，在p H 4～10的范圍內(nèi)，探針W1對Cu2＋的識別良好，而p H＝3時由于酸效應的影響導致其識別效果略微降低，p H＝11時則由于Cu2＋部分水解導致熒光不能完全猝滅。

圖4 (a) 探針W1對Cu2＋的時間響應; (b) 探針W1在不同p H 下對Cu2＋的識別

2.4 探針W1對Cu2+的熒光滴定實驗

圖5和圖6為探針W1對Cu2＋的熒光滴定得到的曲線，從圖5可看出，在0～12μmol/L的Cu2＋中，探針W1的熒光發(fā)射逐漸降低，當Cu2＋濃度與探針分子濃度接近1∶1時，熒光強度的改變變得非常小。圖6(a)為W1與Cu2＋滴定的線性擬合曲線，在Cu2＋濃度0～6×10－6mol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為y＝－4.91x＋367.49，R2＝0.9921。由連續(xù)11次空白探針W1的熒光強度標準偏差算出探針W1對Cu2＋的檢測限為2.9×10－8mol/L；圖6(b)是用等摩爾連續(xù)遞變法測定探針W1與Cu2＋的配位比，首先，固定探針W1與Cu2＋的總濃度為20μL，改變二者的比例來測定探針W1與Cu2＋的配位比，結(jié)果表明，探針W1與Cu2＋在1∶1時熒光已經(jīng)降至最低，說明其配位比為1∶1。

圖5 (a) 探針W1對Cu2＋的熒光滴定曲線; (b)Cu2＋滴定的非線性擬合曲線

2.5 探針W1對Cu2+的可視化檢測

在探針W1的DMF溶液中加入不同當量的Cu2＋時，如圖7(a)所示那樣，探針W1溶液的顏色也隨之改變，探針W1可以很好地用于Cu2＋的可視化檢測。同時，制備了探針W1的濾紙條用以快速檢測Cu2＋，將干凈的濾紙條浸泡在探針W1的DMF溶液中(10－4mol/L)，待其充分附著后，放入真空烘箱中干燥，向上滴加Cu2＋，發(fā)現(xiàn)試紙迅速變?yōu)樽睾稚?，且無需在紫外燈的照射下即可肉眼識別，表明該法成本低廉、識別迅速，具有良好的實用價值。

圖7 (a) 探針W1加入不同當量Cu2＋時的溶液顏色變化(10－5 mol/L); (b) 探針W1的顯色試紙用于可視化檢測Cu2＋

同時，將制備好的濾紙條在365 nm 紫外燈下照射，發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)紅色熒光，然后，向上滴加不同的金屬離子(10－4mol/L)。當?shù)渭覥u2＋后發(fā)現(xiàn)，探針W1的濾紙條熒光發(fā)射猝滅，且在365 nm 的照射下的濾紙條顏色發(fā)生明顯的改變，同樣也證明了探針W1具有成本低廉、專一高效可視化檢測Cu2＋的能力。

圖8 探針W1的濾紙條加入不同金屬離子時在365 nm 下對Cu2＋的專一性可視化識別

2.6 探針W1識別Cu2+的機理

Cu2＋具有強順磁性，而探針W1分子存在分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，當探針W1分子與Cu2＋配位后，由于Cu2＋的順磁性能夠使探針分子的電荷轉(zhuǎn)移至Cu2＋(配體-金屬電荷轉(zhuǎn)移，LMCT)，導致熒光團從S1到T1態(tài)的系間竄越(ISC)速度加快，并由雙分子非輻射過程(順磁效應)失活，使得探針分子熒光團的ICT 激發(fā)態(tài)猝滅[16，17]，同時酚羥基到亞胺鍵的激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)也被抑制，所以產(chǎn)生了螯合熒光猝滅[18](CHEQ)。

3 結(jié)論

以二氰基異佛爾酮為母體，設計合成了高靈敏、高選擇性響應Cu2＋的近紅外熒光探針W1，W1擁有大的Stokes位移(252 nm)和近紅外的熒光發(fā)射(668 nm)，對Cu2＋的檢測限低至2.9×10－8mol/L，并且探針W1還能在自然光下肉眼識別Cu2＋，濾紙條實驗也證明了其擁有肉眼快速可視化檢測Cu2＋的實用價值。