人參根系分泌物中有機酸及皂苷對人參病原菌與生防菌的化感差異研究

楊莉，于俐，孫卓，張桐毓，張陽，楊利民*

（1.吉林農業(yè)大學生態(tài)恢復與生態(tài)系統(tǒng)管理省部共建國家重點實驗室培育基地，長春 130118；2.延邊特色產業(yè)發(fā)展中心，吉林延吉 133000）

植物根系分泌物是植物間化感作用重要的載體物質，也是植物和其他有機體之間信息傳遞的重要媒介[1]。越來越多的研究表明，根系分泌物不僅能夠影響植物生長，還可作為土壤微生物生長和繁殖的碳源、能源，進而影響根際微生物群落的種類與數量[2-3]。Bulgarelli等[4]總結了植物根系微生物區(qū)系的形成機理，認為植物可通過調整根面和內生菌的生長過程，形成植物所特有的根系核心微生物區(qū)系。并且，利用土壤微生物對根際分泌物的化學趨向響應，可誘導有益微生物在根際聚集，對防御病原微生物起到積極的作用[5-8]。

從根際分泌物的角度探討植物連作障礙成因的研究表明，植物根際釋放出的次生代謝產物中含有多種化學物質，不僅對植物具有直接的負面效應，還可誘導土壤中養(yǎng)分循環(huán)、微生物種群結構等生物或非生物因素改變[9-11]。根系分泌物介導的病原菌增加、土壤微生態(tài)失衡是導致后茬植物生長不良的主要原因，根系分泌物中化感物質是植物根際微生態(tài)災變的重要誘因[12-13]?？梢姡参锔滇尫诺姆置谖锟杀徊煌奈⑸镒R別并產生不同的影響，尤其是在防御和誘導病原微生物方面存在顯著差異，但由于土壤環(huán)境的復雜性以及目前對根系分泌物化學成分和關鍵活性物質認知的局限性，導致對上述差異形成原因的研究還存在很多空白，很多實質性問題未見報道。本研究基于課題組前期對人參主要土傳病原菌生防菌的分離鑒定結果，以人參主要病害病原菌及其天敵生防菌為研究對象，分析人參根系分泌物中初生代謝產生的酸性物質（根系分泌物中長期存在，對人參具有顯著自毒作用）與次生代謝合成的皂苷類物質（人參屬根系分泌物中典型的物質）[14-16]對二者的影響，為探討人參根系分泌物對病原菌、病原菌的天敵微生物的化感作用差異，研究人參根際分泌物對根際微生物群落變化的誘導效應奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

人參病原菌：以人參中常見的重大病害銹腐病、根腐病、黑斑病、菌核病的病原菌為受體。強壯土赤殼菌（Ilyonectria robusta，人參銹腐病病原菌）、腐皮鐮孢菌（Fusarum solani，人參根腐病病原菌）、鏈格孢菌（Alternaria panax，人參黑斑病病原菌）、人參核盤菌（Sclerotinia ginseng，人參菌核病病原菌）由吉林農業(yè)大學植保實驗室高潔老師惠贈。

人參生防菌：死谷芽孢桿菌（Bacillusvallismortis，SZ-4）、短波單胞菌（Brevundimonasterrae，SZ-22）、解 淀 粉 芽 孢 桿 菌（Bacillus amyloliquefaciens，SZ-60）均由本實驗室從人參根際土壤中分離得到，已證實對多種人參土傳病害具有拮抗作用[14]，目前已被保存于國家菌種保藏中心。

供體物質：苯甲酸、鄰苯二甲酸、丁二酸、己二酸，人參皂苷標準品Rb2(P15O10F94983)、Rd(Z13N8X48155)、Rc(M15O10S100110)、Rg1(G16S10Y9 7436)、Re(B04D9S76499)購自上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%）。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA）、NA培養(yǎng)基（購于北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 供試含藥培養(yǎng)基的配置

稱取一定質量的酸類物質（苯甲酸、鄰苯二甲酸、丁二酸、己二酸）、皂苷（Rb2、Rd、Rc、Rg1、Re）溶于甲醇中，配制成1 000.0、200.0、20.0、2.0、0.2 mg·L-1的母液。無菌條件下取100μL母液加入培養(yǎng)皿中，室溫揮發(fā)干溶劑后將20 mL滅菌PDA培養(yǎng)基少量分次加入，攪拌溶解均勻后形成5.000、1.000、0.100、0.010、0.001 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基，用于病原菌培養(yǎng)，以不添加外源物質的培養(yǎng)基為CK，每個處理5次重復。最高含量梯度參考土壤中實際含量[17]并略有調整。

無菌條件下取250μL上述母液加入培養(yǎng)瓶中，室溫揮發(fā)干溶劑后分次加入50 mL滅菌的NA培養(yǎng)液，攪拌均勻后形 成5.000、1.000、0.100、0.010、0.001 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基，用于生防菌培養(yǎng)，以不添加外源物質的培養(yǎng)基為CK，每個處理5次重復。

1.3 生物測定

1.3.1 病原菌作為受體 從生長狀態(tài)良好的真菌菌落邊緣取直徑為5 mm的菌塊接入培養(yǎng)基中央，放置在（25±2）℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待對照組菌落直徑達到培養(yǎng)基直徑的70%～80%時結束培養(yǎng)，用十字測量法測量菌落直徑，根據試驗組與對照組的菌落直徑計算化感物質的抑菌率。菌落抑制率計算公式如下。

式中，dc為對照組菌落直徑，dt為試驗組菌落直徑。抑菌率正值代表抑制作用，負值代表促進作用。

1.3.2 生防菌作為受體 待培養(yǎng)液冷卻后，用滅菌的移液器移取0.1 mL待測拮抗菌懸液，接種于含藥NA培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)24 h（180 r·min-1，28℃）后，測定波長600 nm下的吸光值，檢測拮抗菌生長狀況。拮抗菌生長抑制率計算方法如下。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

采用Excel對試驗數據進行整理，DPS 9.50對試驗數據進行差異顯著性分析，Origin 2018進行作圖。

2 結果與分析

2.1 酸性物質對人參病原菌及生防菌生長的影響

2.1.1 有機酸對人參病原菌的化感作用 由表1可見，強壯土赤殼菌（銹腐病病原菌）在有機酸處理下主要表現為生長受抑制，多數質量濃度處理與對照差異顯著（P＜0.05），其中丁二酸、鄰苯二甲 酸處理 分 別在0.010～1.000 mg·L-1、0.001～1.000 mg·L-1范圍內表現出顯著的抑制作用，作用強度7.96%～30.09%（P＜0.05），表明土壤中微量的該類物質即可對強壯土赤殼菌增長具有顯著的抑制作用。對比4種有機酸平均抑制率可知，鄰苯二甲酸對強壯土赤殼菌活性的抑制作用最大（14.11%），然后依次為己二酸（10.17%）、苯甲酸（6.65%）、丁二酸（4.57%）。

表1 有機酸對病原菌生長的影響Table 1 Influence of organic acids on the growth of pathogenic bacteria

分析有機酸對菌核病病原菌生長的影響可知，含有機酸的培養(yǎng)基刺激了人參核盤菌的生長，其菌落直徑多大于對照，表明人參根際存在的有機酸類物質可促進核盤菌的增殖。其中苯甲酸在0.010～1.000 mg·L-1、丁二酸在0.001～1.000 mg·L-1范圍內表現出對人參核盤菌活性的顯著促進（促進作用7.8%～21.8%（P＜0.05））。對比4種有機酸的平均作用強度可知，丁二酸對該菌種活性促進作用最大（12.77%），其次依次為己二酸（9.25%）、苯甲酸（8.29%）、鄰苯二甲酸（5.49%）。

分析有機酸對腐皮鐮孢菌的影響可知，苯甲酸、丁二酸、己二酸對腐皮鐮孢菌生長以促進為主（作用強度0.25%～9.41%）；鄰苯二甲酸對其生長存在抑制作用（作用強度2.80%～7.12%）；多數處理未見與對照有顯著差異。從人參鏈格孢菌測定結果可知，苯甲酸和丁二酸對其生長表現為低水平促進高水平抑制；己二酸與鄰苯二甲酸與之相反，為低水平抑制高水平促進；大部分處理與對照未見有差異顯著。上述分析表明腐皮鐮孢菌、人參鏈格孢菌的生長受有機酸類物質影響較小。

2.1.2 有機酸對生防菌的化感作用 從圖1可以看出，除鄰苯二甲酸部分處理外，其余處理對死谷芽孢桿菌（SZ-4）的生長以促進為主，作用強度在3.26%～18.57%。苯甲酸處理在0.010～5.000 mg·L-1、丁 二 酸0.001～5.000 mg·L-1、己 二 酸0.010～1.000 mg·L-1對該生防菌生長具有顯著的促進作用。

圖1 有機酸對生防菌生長的影響Fig.1 Influence of organic acids on the growth of biocontrol bacteria

分析有機酸對短波單胞菌（SZ-22）生長的影響發(fā)現，除苯甲酸外，其余3種有機酸均對該菌生長有強烈的促進活性，作用強度8.28%～132.94%，作用水平范圍介于0.001～5.000 mg·L-1，且大多數質量濃度處理與對照差異顯著，表明SZ-22對土壤中丁二酸、己二酸和鄰苯二甲酸敏感，這3種物質可在較大質量濃度范圍內促進其生長?？傮w比較發(fā)現，己二酸促進作用最強（88.38%），其次依次為丁二酸（57.13%）、鄰苯二甲酸（53.91%）。

分析4種有機酸對解淀粉芽孢桿菌（SZ-60）生長的影響可知，苯甲酸對其生長有促進作用；其余三者呈抑制作用，鄰苯二甲酸抑制作用最強。鄰苯二甲酸、苯甲酸各質量濃度梯度處理均與對照 差 異 顯 著（P＜0.05），前 者 平 均 抑 制 強 度29.96%，后者平均促進強度46.91%。

2.2 人參皂苷對病原菌及生防菌生長的影響

2.2.1 人參皂苷對病原菌的化感作用 由表2可見，5種人參皂苷對強壯土赤殼菌的增長呈抑制作用，抑制強度6.64%～44.07%。其中，人參皂苷Re、Rc、Rd可分別在0.001 mg·L-1的5 000倍、1 000倍、100倍范圍內對強壯土赤殼菌產生顯著的抑制作用；人參皂苷Rb2、Rg1可分別在0.010 mg·L-1的500倍、0.100 mg·L-1的50倍范圍內產生類似作用。

表2 人參皂苷對病原菌生長的影響Table 2 Influence of saponins on the growth of pathogenic bacteria

5種皂苷對人參核盤菌生長的影響以促進為主，作用強度1.32%～22.85%，影響最大的是Rg1，然后依次是Rc、Rd、Re、Rb2。其中，Rg1作用范圍為0.001 mg·L-1的5 000倍，其余皂苷作用質量濃度范圍較窄（5～50倍）。分析皂苷對腐皮鐮孢菌和人參鏈格孢菌生長的影響可見，皂苷對二者的生長以促進為主，促進作用分別為0.51%～8.91%、0.54%～9.83%，多數處理與對照無顯著差異，表明5種皂苷對腐皮鐮孢菌和人參鏈格孢菌生長影響較小。

2.2.2 人參皂苷對生防菌的化感作用 由圖2可見，除Rb2外其余4種皂苷可促進SZ-4的生長，其中Rc活性最強（平均強度15.92%），其次依次為Rd（6.52%）、Rg1（5.76%）、Re（4.87%）。5種皂苷中Rc、Re產生顯著影響的水平范圍分別為0.001 mg·L-1的5 000倍、100倍內，其余皂苷處理作用范圍較窄。5種皂苷對SZ-22的生長以促進為主，作用強度0.27%～11.29%，影響最大的是Rd、Rb2、Re，其中Rd顯著作用范圍為0.001 mg·L-1的100倍內，其余皂苷的顯著作用梯度分散。分析皂苷對SZ-60生長的影響可見，Rb2所有處理水平下SZ-60生長受抑，平均抑制率10.77%；Rc所有處理水平下SZ-60生長受激，平均促進強度15.74%；Rd、Re、Rg1對SZ-60生長均表現為低質量濃度促進高質量濃度抑制，其促進活性Rd（82.75%）＞Re（79.06%）＞Rg1（7.97%），抑制活性Re（28.91%）＞Rg1（20.89%）＞Rd（7.11%）。

圖2 皂苷對生防菌生長的影響Fig.2 Influence of saponins on the growth of biocontrol bacteria

2.3 兩類物質對土壤微生物化感作用的綜合分析

根據上述分析，將與對照具有顯著差異的處理及梯度匯總，結果如圖3所示。由于溶液較稀，1 mg·L-1溶液密度與水相似，故1 mg·L-1約等于1 ppm，據此將上述質量濃度處理轉換為ppm，以便表示微生物對物質的敏感程度。由圖3可見，每種物質可顯著影響4～5種土壤微生物，對強壯土赤殼菌以抑制為主，對人參核盤菌、SZ-4、SZ-22以促進為主；溶液水平為ppb級的己二酸、鄰苯二甲酸、Rd、Re可分別顯著影響5、4、4、4種受體生長，其余物質可影響1～3種，己二酸、鄰苯二甲酸、Rd、Re可在ppb～ppm（1 000倍）范圍對3～5種受體產生顯著影響，苯甲酸、丁二酸、Rb2、Rc、Rg1主要集中在10-2ppm～ppm（100倍）范圍內對受體產生顯著影響；ppb質量濃度的苯甲酸、Rc、Rd、Re具有抑制病原菌、促進生防菌的作用；在所有與對照差異顯著的處理中，70%以上處理作用強度低于20%，作用強度大于40%的處理僅占17%。

圖3 有機酸、皂苷對微生物影響的對比分析Fig.3 Comparative analysis of the effects of organic acids and saponins on microorganisms

2.4 兩類物質對土壤微生物化感作用的統(tǒng)計分析

2.4.1 菌種間比較分析 采用非參數Kruskal-Wallis檢驗對病原菌和生防菌間差異進行分析（圖4）發(fā)現，病原真菌組秩（113.44）＞生防細菌組秩（112.70），P=0.933，表明有機酸與皂苷類物質對病原菌影響略大于生防菌，但二者間無顯著差異。菌種間分析結果由圖4可見，SZ-60秩＞強壯土赤殼菌秩＞人參核盤菌秩＞SZ-22秩＞SZ-4秩，SZ-60秩與后三者差異顯著，表明有機酸與皂苷類物質對SZ-60生長影響最大。

2.4.2 物質間比較分析 采用非參數Kruskal-Wall is檢驗對有機酸與皂苷間差異進行分析（圖4）發(fā)現，有機酸組秩（120.22）＞皂苷組秩（109.39），P=0.239，表明有機酸對微生物影響略大于皂苷，但二者間無顯著差異。

對物質間進行差異分析顯示，9種物質對強壯土赤殼菌、人參核盤菌生長的影響差異不顯著（P=0.434、0.187），對生防菌的生長，物質間影響差異顯著，其成對比較結果如圖4?？梢钥闯觯瑢Z-4、SZ-22、SZ-60生長影響最大的物質分別是Rc、己二酸、Rd，三者均與最小秩組差異顯著，與其他組差異不顯著。

圖4 Kruskal-Wallis檢驗成對比較結果Fig.4 Pairwise comparison results of Kruskal-Wallis test

3 討論

近年來，研究者在不同植物根際分泌物中分離、鑒定了多種化感物質，包括酸類、萜類、黃酮類化合物等[18-19]。不同植物根系分泌物的組成及數量之間存在較大差異。如木麻黃根際土壤中檢測到香草酸、阿魏酸、沒食子酸、對香豆酸和水楊酸5種酚酸類物質，其含量介于24.86～412.56 mg·kg-1[20]；地黃根際土壤中可檢測到香豆酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸和阿魏酸等酸性物質，其含量介于1.020～398.812 mg·kg-1[21]。本課題組前期研究也發(fā)現酸性化合物是人參根系分泌物中的重要組成部分，其占比約為13.52%，主要成分為苯甲酸、鄰苯二甲酸酯、丁二酸等物質[22]。除酸性化合物外，萜類化合物也廣泛存在于人參、三七、地黃、太子參、半夏等藥用植物根系分泌物中[23-24]。有關萜類物質生理生態(tài)功能的研究發(fā)現，很多萜類物質具有活躍的化感活性，可通過影響植物的呼吸作用、改變營養(yǎng)循環(huán)速率而對植物的生長產生不利影響[25-26]；在三七、人參等植物的連作障礙中，皂苷還被視為一種主要的引誘劑，對微生物種群具有調控作用[27-28]。目前人參屬植物中已分離鑒定出Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rh1、Rg1、Rg2等10余種皂苷[23-24]。有關2類物質對植物的化感活性已有較多的報道，如香豆酸的含量可以顯著中斷大豆根的伸長[29]；鄰苯二甲酸、硬脂酸、棕櫚酸和苯甲酸對三七種子的萌發(fā)及幼苗的生長具有毒害作用[30]；丁二酸、己二酸等酸性物質對人參愈傷組織具有顯著的化感活性[22]等。但這些物質對植物根際微生物，尤其是致病微生物及其生防微生物之間化感作用的差異還缺乏更多深入的研究。本研究分析了有機酸及皂苷類物質對根際微生物生長的影響，結果發(fā)現上述物質對土壤微生物的化感作用與對植物的化感作用存在相似之處，即化感作用類型可分為不敏感（腐皮鐮孢菌、人參鏈孢菌）、抑制作用（強壯土赤殼菌）、促進作用（人參核盤菌、SZ-4、SZ-22）。2類物質對微生物的化感作用強度介于-132.94%～31.33%，總體表現為促進作用大于抑制作用，處理水平間存在隨著供試物質質量濃度增加促進活性減弱或轉為抑制作用的變化趨勢，但未見明顯的水平效應，這與以植物受體的研究結果存在較大差異[31]。

其次，比較酸性物質與皂苷二者間化感活性差異發(fā)現，有機酸與皂苷均可顯著影響4～5種土壤微生物，二者均可在極低的水平條件下（ppb～ppm級）對受體產生顯著影響，符合化感物質微量（微克到皮克級）、高效的特點[32]，證明二者均是影響人參根際微生態(tài)的重要化感物質。Kruskal-Wallis檢驗顯示，有機酸對微生物影響略大于皂苷，但二者間無顯著差異，這可能與試驗水平設置有關。考慮到植物根系代謝物分泌是動態(tài)、微量的，土壤微生物對其存在轉化和降解以及實驗室提取技術的富集作用，故本試驗設置水平均低于土壤中實測的動態(tài)水平，這可能是導致二者之間差異不顯著的主要原因。此外人參根際7種微生物生長可受到酚酸與皂苷類物質的共同影響，其效果可能與中藥的“活性物質群”類似[11]，有研究稱這類物質為“化感功能物質團”[38]。本研究中己二酸、鄰苯二甲酸、人參皂苷Rd、人參皂苷Re可對半數以上受體產生顯著影響，閾值低（ppb）、作用濃度廣（ppb～ppm），提示其可能是人參根系分泌物中主要的活性物質，其中ppb水平的Rd、Re具有抑制病原菌、促進生防菌的作用，表現出顯著的防御功能。

研究認為連作障礙植物根際土傳病害流行與某些根系分泌物對病原菌或生防菌具有偏利/偏害的作用有關，從而引起土壤微生物群落失衡[33-34]。本研究中發(fā)現有機酸及皂苷可抑制強壯土赤殼菌的生長，促進人參核盤菌、人參鏈格孢菌、腐皮鐮孢菌、SZ-4、SZ-22增殖，對生防菌的促進作用大于病原菌，表現出對生防菌的偏利作用。其次，鄰苯二甲酸對人參核盤菌和強壯土赤殼菌分別表現出促進與抑制作用，對生防菌SZ-4和SZ-60分別表現出促進與抑制作用，類似的現象還存在于己二酸、人參皂苷Rb2等物質處理中，說明化感物質對病原菌或生防菌組內菌種也存在偏利/偏害作用。推測當根系分泌物與復雜的微生物體系接觸時，具體表現為對微生物群落的正面或負面調節(jié)，可能還需要綜合考慮物質與菌種的識別速度、土壤溶液中有效含量等因素[12]。由于本試驗僅對供體與受體之間進行了一對一的研究，有關一對多、多對多以及復雜的土壤環(huán)境中人參根系分泌物對微生物群落的影響差異還需要更多的試驗加以說明。