嗜吡啶紅球菌Rp3生長及降解糞臭素特性研究

吳玉洪，郭榮君，馬桂珍，李世東

（1.江蘇海洋大學環(huán)境與化學工程學院，江蘇連云港 222005；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193）

糞臭素（3-甲基吲哚）是含氮雜環(huán)有機物，具有刺激性臭味[1-4]，主要為色氨酸在動物消化系統(tǒng)中的產(chǎn)物[5-7]，并隨動物糞便排出體外，進而污染環(huán)境。糞臭素會損傷人體機能，引發(fā)肺相關(guān)疾病，并導致動物出現(xiàn)急性肺水腫等疾病[8]。近年來，利用微生物降解氮雜環(huán)類化合物已成為研究熱點，乳酸菌、不動桿菌、惡臭假單胞菌、綠膿桿菌等均對氮雜環(huán)類化合物具有降解作用[9-11]。本課題組前期分離鑒定出1株糞臭素高效降解菌——嗜吡啶紅球菌Rp3，該菌株在無機鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h能夠?qū)?00 mg·L-1糞臭素完全降解，是非常有潛力的降解菌株[12]。因此進一步明確適宜Rp3菌株生長的碳氮源及不同因素對其降解糞臭素的影響，對該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)及堆肥污染環(huán)境的修復(fù)具有重要意義。

微生物對污染物的降解作用通常受到碳氮營養(yǎng)、溫度、金屬離子等因素的影響。Kohda等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PYG培養(yǎng)液中蛋白胨、葡萄糖、酵母粉等營養(yǎng)供給有利于馬來提名梭菌（Clostridiummalenominatum）對糞臭素的降解；添加葡萄糖可提高芽孢桿菌（Bacillus）L1對吲哚的降解速度[14]；Fukuoka等[15]研究發(fā)現(xiàn)，以甘油為原料時，土壤細菌 貪銅菌（Cupriavidus）KK10在24 h內(nèi) 可 將100 mg·L-1的糞臭素完全降解。溫度和pH影響乳鏈球菌（Streptococcuslactis）6020對糞臭素的降解[16]，芽孢桿菌L1則在30℃時對吲哚降解率最高[14]。Zn2+可明顯促進產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenessp.）WUST-qu菌株對喹啉的降解[17]。此外，菌株傳代可能影響微生物的降解功能，如α-苯乙胺降解菌P2在多次傳代后，其對α-苯乙胺的降解能力出現(xiàn)退化[18]。目前有關(guān)紅球菌對烷烴、芳香烴、原油、有機腈、熒蒽等化合物的轉(zhuǎn)化及降解研究較多[19-21]。本研究旨在探究適宜嗜吡啶紅球菌Rp3菌株生長的碳氮源及不同因素對其生長和糞臭素降解效率的影響，以期對該菌株的大量培養(yǎng)和實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 供試菌株 嗜吡啶紅球菌（Rhodococcuspyridinivorans）Rp3由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基L2[12]：KH2PO40.5 g、K2HPO41.5 g、MgSO40.5 g、（NH4）2SO41.5 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2。LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、酵母提取物5 g，蒸餾水定容至1 L。

1.1.3 實驗儀器 Flexstion3全波長掃描多功能讀數(shù)儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；LC-20A高效液相色譜儀購自日本島津日本島津株式會社；HCY-123B恒溫振蕩搖床購自太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糞臭素對Rp3菌株生長的影響 將Rp3菌株分別接種于含0（CK）、100 mg·L-1糞臭素的L2培養(yǎng)液中，28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)48 h，每處理設(shè)3次重復(fù)，測定OD600值。

1.2.2 Rp3菌株活菌數(shù)與OD600對應(yīng)的標準曲線建立 將Rp3菌株接種于LB培養(yǎng)液中，28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)液，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，用0.9%NaCl溶液重懸，再離心洗滌，該過程重復(fù)3次。將菌懸液稀釋至OD600分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8，將不同OD600的菌懸液稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，設(shè)3次重復(fù)。以Rp3菌株菌懸液OD600為橫坐標，以菌落形成單位（colony forming unit，CFU）為縱坐標，繪制細菌活菌數(shù)與OD600的標準曲線。

1.2.3 正交試驗 以L2為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)計蔗糖[12（A1）、14（A2）、16 g·L-1（A3）]、牛肉膏[10（B1）、12（B2）、14 g·L-1（B3）]、酵母浸粉[2（C1）、4（C2）、6 g·L-1（C3）]三因素三水平正交試驗L9（34）。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)48 h，測定OD600值，計算培養(yǎng)液中Rp3的活菌數(shù)，確定適宜Rp3菌株生長的碳氮源用量。判斷標準：依據(jù)不同因素在水平1（K1）、水平2（K2）和水平3（K3）的實驗結(jié)果總和計算各因子的k1（K1/3）、k2（K2/3）、k3（K3/3）值以及極差值Ri（同列k1、k2、k3中最大值與最小值的差）。

1.2.4 碳氮源對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響 以正交實驗獲得的適宜碳氮源為待測碳氮源，分別配制L2+適宜碳氮源（L2-N）和L2培養(yǎng)液，并加入糞臭素，使其終含量為100 mg·L-1。按5%的接種量加入Rp3菌懸液（OD600=0.8），以相同含量糞臭素但不接種Rp3菌液的培養(yǎng)液為CK，每處理設(shè)3次重復(fù)。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液的OD600和糞臭素含量。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromato-graphy，HPLC）檢測糞臭素的條件[12]：色譜 柱 為Hypersill BDSC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫為室溫（25℃），紫外檢測波長為254 nm；流動相設(shè)置甲醇∶水為90∶10（體積比），流速為1 mL·min-1，進樣量10μL。計算糞臭素的降解率。

1.2.5 金屬離子對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響 參照鄧秀瓊[22]的方法測定不同金屬離子對糞臭素降解的影響。L2培養(yǎng)液中糞臭素含量為100 mg·L-1，金屬離子含量：Fe2+25 mg·L-1、Mn2+50 mg·L-1、Zn2+50 mg·L-1、Mg2+100 mg·L-1，以只加糞臭素的L2培養(yǎng)液為對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)48 h，測定OD600和糞臭素含量，并計算糞臭素的降解率（公式1）。

1.2.6 溫度對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響無機鹽培養(yǎng)液L2中添加100 mg·L-1的糞臭素，分別在28、35、40℃及180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24 h，測定OD600和糞臭素含量，計算糞臭素的降解率（公式1）。

1.2.7 傳代對Rp3菌株生長和降解糞臭素的影響將Rp3初始菌株Rp3-0接種于60 mL LB培養(yǎng)液中，28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，以7 d為1個傳代周期，連續(xù)傳代5代（Rp3-5）、10代（Rp3-10）。分別取Rp3-0、Rp3-5和Rp3-10菌懸液，于12 000 r·min-1離心2 min，棄上清，用無菌水重懸3次，調(diào)整OD600=0.8，按5%的接種量接種于L2培養(yǎng)液中，其中糞臭素含量為100 mg·L-1，裝液量為20 mL，各處理以不接種Rp3為對照，標記為CK-0、CK-5和CK-10。28℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)。分別于24、48 h取樣，測定OD600和糞臭素含量，計算糞臭素的降解率（公式1）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 24軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)值采用平均值±標準差表示，采用Excel 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rp3菌株在糞臭素為唯一碳源培養(yǎng)液中的生長量

如圖1所示，Rp3菌株在未添加糞臭素的L2培養(yǎng)液中基本不生長，在添加100 mg·L-1糞臭素的L2培養(yǎng)液中生長量顯著高于CK（P＜0.05），表明Rp3通過降解糞臭素為其生長提供碳源。

圖1 Rp3菌株在糞臭素為唯一碳源培養(yǎng)液中的生長量Fig.1 Growth of strain Rp3 cultured in broth with skatole as sole carbon

2.2 最適生長碳氮源正交試驗結(jié)果

Rp3菌株懸液OD600與其活菌數(shù)CFU之間的標準曲線方程為y=3×109x-5×108，R2=0.971 3。對蔗糖、牛肉膏和酵母浸粉的正交試驗結(jié)果表明，各組分對Rp3菌株的活菌數(shù)影響排序為酵母浸粉＞牛肉膏＞蔗糖，經(jīng)計算最優(yōu)組合為A3B3C3，適宜Rp3菌株生長的碳氮源及用量為蔗糖16.0 g·L-1、牛肉膏14.0 g·L-1、酵母浸粉6.0 g·L-1（表1）。

表1 培養(yǎng)基各組分配比優(yōu)化的正交試驗統(tǒng)計結(jié)果Table 1 Statistical results of orthogonal test for the optimization of the medium components

2.3 影響Rp3菌株生長和糞臭素降解的因素

2.3.1 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的碳氮源由圖2可知，Rp3菌株在L2-N培養(yǎng)液中的生長量顯著高于L2培養(yǎng)液（P＜0.05）；在L2-N和L2培養(yǎng)液中，Rp3菌株與100 mg·L-1糞臭素共培養(yǎng)24 h時，對糞臭素的降解率分別為81.5%±1.19%和85.9%±2.78%，差異不顯著（P＞0.05），說明在該糞臭素含量下，外源營養(yǎng)不影響Rp3菌株對糞臭素的降解。

圖2 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的碳氮源Fig.2 Carbon and nitrogen sources for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.2 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的金屬離子如圖3所示，在含有100 mg·L-1糞臭素但去除Mg2+的L2培養(yǎng)液（CK）中，Rp3菌株基本不生長（OD600=0.13±0.01），顯著低于Mg2+存在時的生長量（P＜0.05），說明Mg2+為Rp3菌株降解糞臭素所必需的金屬離子。用Fe2+、Mn2+或Zn2+替換Mg2+時，Rp3菌株生長量顯著降低（P＜0.05），其中Rp3菌株在含有Zn2+的處理中生長量最低。在含有Mg2+的處理中，糞臭素的降解率高達95.5%，替換為Fe2+、Mn2+或Zn2+時3個處理糞臭素含量差異不顯著（P＞0.05），降解率均顯著低于加入Mg2+的處理（P＜0.05）。上述結(jié)果說明Mg2+對Rp3菌株降解糞臭素有重要作用，F(xiàn)e2+、Mn2+、Zn2+這3種金屬離子雖然對糞臭素降解能力相似，但對Rp3菌株生長的影響不同，且50 mg·L-1的Zn2+明顯抑制了Rp3的生長。

圖3 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的金屬離子Fig.3 Metal ions for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.3 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的溫度如圖4所示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，Rp3菌株的生長量也隨之逐漸升高，呈顯著正相關(guān)趨勢（P＜0.05）；隨著溫度的升高，未接種Rp3菌株的L2培養(yǎng)液中糞臭素含量也有所下降，說明糞臭素有一定的揮發(fā)；但接種Rp3菌株后，隨著培養(yǎng)溫度升高，各處理中糞臭素降解率逐漸提高，溫度為28、35、40℃時，糞臭素的降解率分別為82.9%、93.2%和95.5%。

圖4 適宜Rp3菌株生長及糞臭素降解的溫度Fig.4 Optical temperature for strain Rp3 growth and skatole degradation

2.3.4 Rp3菌株多次傳代后生長及降解糞臭素能力對初始菌株Rp3-0和傳代菌株Rp3-5、Rp3-10降解糞臭素能力進行測定，結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h時，初始菌株Rp3-0和傳代菌株Rp3-5、Rp3-10對糞臭素的降解率均在80%以上，差異不顯著（P＞0.05）；培養(yǎng)48 h時，初始株菌Rp3-0和傳代菌株Rp3-5、Rp3-10對糞臭素的降解率均達100%（表3），說明糞臭素含量為100 mg·L-1時，傳代基本不影響Rp3菌株對糞臭素的降解能力。

3 討論

糞臭素是畜牧堆肥及廢水中臭氣形成的主要化合物之一[23]。近年來，利用微生物降解糞臭素已成為研究熱點，但不同因素對不同菌株降解效率的影響存在差異[15]。以往研究表明，外源營養(yǎng)物質(zhì)是影響微生物降解有害物質(zhì)的重要因素，外源營養(yǎng)物質(zhì)缺乏常限制微生物生長及有機物的降解[24]。本研究中Rp3菌株不但能夠以糞臭素為唯一碳源，通過降解糞臭素為其自身生長提供碳源，而且在有適宜的外源營養(yǎng)供應(yīng)時，仍能夠高效降解糞臭素，說明Rp3菌株對營養(yǎng)要求不苛刻，此特點非常有利于該菌株的開發(fā)和應(yīng)用。除碳氮源外，金屬離子也影響微生物對有機物的降解效率[25]。鄧秀瓊[22]研究表明，金屬離子Fe2+、Mn2+和Zn2+能促進無色桿菌（Ach romobacter）DN-06對吡啶的降解；Ma等[26]研究表明，F(xiàn)e2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+對IDO3菌株降解糞臭素無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)Mg2+在Rp3菌株降解糞臭素過程中起著重要作用，F(xiàn)e2+、Zn2+、Mn2+不能替代Mg2+，該結(jié)果與前人研究結(jié)果不一致[22,26]，分析原因可能與菌株降解酶特性有關(guān)，尚需進一步深入研究。

表2 Rp3初始菌株與傳代菌株生長和降解糞臭素能力比較Table 2 Comparison of the growth and skatole degrading ability between the initial and subculture strain Rp3

培養(yǎng)條件在有機污染物微生物降解過程中起著重要作用，其中溫度是重要的影響因子，但不同微生物降解糞臭素的適宜溫度不同，如伯克霍爾德菌屬（Burk h older i asp.）IDO3降解糞臭素的最佳溫度為30～35℃[26]，而短乳桿菌在37℃時對糞臭素的降解效果最好[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Rp3菌株在35和40℃時對糞臭素的降解能力優(yōu)于28℃。雖然溫度升高時，糞臭素本身有一定揮發(fā)，但Rp3菌株處理的糞臭素含量下降更為顯著。一般情況下，細菌生長會隨溫度的升高而升高，但Rp3菌株在不添加糞臭素的L2培養(yǎng)液中不生長，因此推測Rp3菌株在35～40℃時生長量增加并不是因為溫度升高促進了Rp3的生長，而是因為該菌株隨著溫度的升高對糞臭素的降解能力提升，從而獲得了更多的碳源所致。紅球菌Rp3為本課題組前期從堆肥土壤中分離獲得的，而堆肥溫度通常高于正常環(huán)境，因此推測該菌株對高溫有一定的適應(yīng)性，且溫度較高時，Rp3對糞臭素的降解率提高可能與該菌株本身的降解酶特性有關(guān)[12]。

微生物連續(xù)傳代培養(yǎng)后功能退化是工業(yè)生產(chǎn)中常見的問題，因此傳代穩(wěn)定性常作為評價菌株是否具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的重要指標，不同菌株的傳代穩(wěn)定性因菌株特性而存在差異，如α-苯乙胺降解菌P2在多次傳代后，其降解能力出現(xiàn)明顯的退化[18]；而干酪乳桿菌在去選擇壓力連續(xù)傳代培養(yǎng)后，其耐藥性并未發(fā)生改變[27]。本研究中Rp3菌株連續(xù)傳代10次后的降解能力并未出現(xiàn)退化，說明該菌株傳代穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用潛力。

綜上所述，本研究獲得了利于糞臭素降解菌Rp3生長的碳氮源為蔗糖、牛肉膏和酵母浸粉，金屬離子為Mg2+；明確了傳代不影響Rp3菌株對糞臭素的降解，說明Rp3菌株是易培養(yǎng)并具有良好傳代穩(wěn)定性的糞臭素降解菌。研究結(jié)果為推動Rp3菌株應(yīng)用于生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。