馬鈴薯根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

王莉莉，殷叢培，李峰，楊志敏，劉芳明，林柏松，劉曉靜，劉海軍，孫靖，單東東，崔江慧，張振清，5*

（1.圍場(chǎng)滿(mǎn)族蒙古族自治縣馬鈴薯研究所，河北承德 068450；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北保定 071000；3.張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北張家口 075000；4.圍場(chǎng)滿(mǎn)族蒙古族自治縣馬鈴薯產(chǎn)業(yè)服務(wù)中心，河北承德 068450；5.河北省馬鈴薯種薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北承德 068450）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界上第一大非谷物作物，也是僅次于水稻（Oryza sativaL.）、小麥（Triticum aestivumL.）和玉米（Zea maysL.）的第四大糧食作物[1]。日常栽培中，馬鈴薯主要分布于地下30 cm以?xún)?nèi)耕層，易遭受干旱威脅。因此，干旱是制約馬鈴薯生產(chǎn)的主要問(wèn)題之一，研究馬鈴薯的抗旱響應(yīng)有助于保障馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

植物生長(zhǎng)過(guò)程中需要應(yīng)對(duì)各種生物和非生物脅迫，而干旱是影響植物地理分布、限制農(nóng)作物產(chǎn)量和威脅糧食安全的主要環(huán)境脅迫因子之一。干旱能夠引起植物高滲透脅迫，造成植物體內(nèi)膨壓降低、活性氧的積累和水分流失，破壞膜結(jié)構(gòu)，抑制光合作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞和植株死亡[2]。植物通過(guò)改變細(xì)胞或組織的大小和形狀、增加水分吸收或減少水分流失、增強(qiáng)細(xì)胞滲透能力、改善抗氧化酶活性等提高脫水耐受性，來(lái)適應(yīng)干旱脅迫造成的不良反應(yīng)[3]。

研究表明，根際微環(huán)境與植物抗旱[4]、耐鹽[5]、抗病[6]及生長(zhǎng)發(fā)育[7]關(guān)系密切，甚至植物的雜種優(yōu)勢(shì)也與根際微生物組的“優(yōu)勢(shì)”有關(guān)[8]。根際是根系周?chē)寥乐形⑸锏幕钴S區(qū)域，一般將根表約1 mm土壤視為根際土壤[9]，是植物脅迫反應(yīng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。植物根系向根際釋放各種化學(xué)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而吸引各種微生物，如細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)和原生動(dòng)物[10-11]；根際微生物具有與植物本身不同的代謝能力，包括養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)質(zhì)的分解等，在根際微生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，從而對(duì)植物的健康生長(zhǎng)產(chǎn)生正向效應(yīng)，并對(duì)植物適應(yīng)各種環(huán)境脅迫具有重要作用[11]。

在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，植物與根際微生物相互作用，以適應(yīng)其棲息地，這些生存于植物根部周?chē)芊置谥参锎偕镔|(zhì)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)的微生物被稱(chēng)為植物根際促生細(xì)菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）[12]。研究表明，在干旱脅迫下叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性來(lái)減少氧化脅迫對(duì)植物的危害，并提高植物水分利用效率和生物量來(lái)增加宿主植物的耐旱性[13]。在干旱條件下，PGPR和AMF的直接相互作用會(huì)誘導(dǎo)植物的抗旱性，但在嚴(yán)重或持續(xù)干旱脅迫下，這些相互作用有可能被打破[14]。

微生物群落成員通過(guò)為植物提供緩沖帶、產(chǎn)生各種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的激素和提高營(yíng)養(yǎng)利用率來(lái)增強(qiáng)植物的抗逆性[12]。Xu等[4]對(duì)干旱脅迫下高粱（Sorghum bicolorL.）根際微生物的研究發(fā)現(xiàn)，植物鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的損失會(huì)影響微生物群落組成，從而導(dǎo)致放線(xiàn)菌（Actinobacteria）在干旱脅迫下顯著富集。添加鏈霉菌（Streptomyces）會(huì)增加植物根系的生物量，但外源施加鐵會(huì)降低干旱條件下Streptomyces的適應(yīng)性?xún)?yōu)勢(shì)[15]。植物根系通過(guò)累積大量的甘油3-磷酸（glycerinum 3-phosphoglycerate，G3P）和應(yīng)激反應(yīng)因子哌啶酸（pipecolinicacid）招募土壤微生物，從而使革蘭氏陽(yáng)性菌能夠優(yōu)先定殖，以達(dá)到抗旱的目的[16]。

根際微生物群落的結(jié)構(gòu)因植物種類(lèi)、植物發(fā)育階段、土壤類(lèi)型和農(nóng)業(yè)管理措施等存在差異。因此，本研究通過(guò)分析土壤微生物16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果，探索種植馬鈴薯前后根際土壤微生物的變化，及干旱脅迫對(duì)馬鈴薯和馬鈴薯根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為利用根際微生物提高作物對(duì)干旱的抵御能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、干旱處理及樣品采集

選用冀張薯8號(hào)（Jizhangshu 8，JZS）和夏波蒂（Shepody，S）2個(gè)馬鈴薯品種為試驗(yàn)材料，由圍場(chǎng)滿(mǎn)族蒙古族自治縣馬鈴薯研究所提供。試驗(yàn)于2020年5—9月在河北省承德市圍場(chǎng)滿(mǎn)族蒙古族自治縣（41°58′1″N，117°45′69″E）進(jìn)行。

采用盆栽試驗(yàn)，取田間表層15—40 cm土壤，風(fēng)干后過(guò)60目篩裝盆。每個(gè)花盆（直徑35 cm，高40 cm）裝土25 kg，不同品種每個(gè)干旱處理種植20盆，馬鈴薯種植前取未種植馬鈴薯的土壤樣品作為對(duì)照土（CK soil），每盆播種微型薯3顆，播深5 cm。當(dāng)50%植株地上部分開(kāi)花時(shí)進(jìn)行干旱處理，分別設(shè)4種水分處理方式：正常栽培（T0，土壤最大持水量80%～85%）、輕度干旱（T1，土壤最大持水量60%～65%）、中度干旱（T2，土壤最大持水量40%～45%）和重度干旱脅迫（T3，土壤最大持水量20%～25%）。試驗(yàn)采用稱(chēng)重法和TPBAR-SM無(wú)線(xiàn)土壤水分傳感器（托普云農(nóng)）對(duì)土壤含水量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每2 d補(bǔ)水1次。

在馬鈴薯干旱脅迫處理14 d后，取各處理倒4～6葉，進(jìn)行葉片理化性狀的測(cè)定。葉片采樣完成后，采用抖土法去除根際附著不緊密的土壤,然后用無(wú)菌刷收集緊密附著的土樣（planted soil），每個(gè)處理取20個(gè)單株的根際土樣混合為1個(gè)生物學(xué)樣本重復(fù)，每處理均獲取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的根際土壤樣品，裝入無(wú)菌袋，置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80℃，用于根際土壤細(xì)菌16S rRNA基因高通量測(cè)序分析。冀張薯8號(hào)（Jizhangshu 8,JZS）和夏波蒂（Shepody,S）土壤樣品分別用JZS-T0、JZS-T1、JZS-T2、JZS-T3和S-T0、S-T1、S-T2、S-T3表示。

1.2 分析方法

1.2.1 馬鈴薯葉片理化性狀的測(cè)定 干旱脅迫14 d后，在樣品采集前使用LI-6400便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)（LI 6400，Li-Cor，Lincoln，NE，USA）測(cè)定各處理植株倒4～6葉的光合參數(shù)，每個(gè)處理測(cè)定3個(gè)單株，包括凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，Tr）；參照高玉坤等[17]方法測(cè)定葉片過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.2.2 土壤總DNA的提取、PCR擴(kuò)增及Illumina測(cè)序 采用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Biotek，Norcross，GA，U.S.）試劑盒提取馬鈴薯根際土壤細(xì)菌DNA。純化后使用NanoDrop 2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Thermo Scientific,Wilmington，USA）測(cè)定DNA濃度。采用引物338F（5’-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3’）[18]擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)。通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）進(jìn)行測(cè)序。對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)控后，用UPARSE（version 7.1，http://drive5.com/uparse/）將操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）以97%的相似度聚類(lèi)。基于UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 5.0,https://unite.ut.ee/）對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋。利用QIIME軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)。利用R語(yǔ)言中PCoA（principal coordinates analysis）分析根際土壤與對(duì)照土壤間、不同干旱處理間根際土壤的菌群結(jié)構(gòu)差異。通過(guò)選擇OTU或某一水平上分類(lèi)信息對(duì)應(yīng)的序列根據(jù)最大似然法（approximatelymaximum-likelihood ML）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，使用R語(yǔ)言作圖繪制進(jìn)化樹(shù)；采用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）方法將現(xiàn)有的16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)與COG（clusters of orthologous groups of proteins）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，比較功能基因在生物代謝通路上的豐度差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)馬鈴薯葉片光合作用的影響

隨著干旱脅迫的加劇，馬鈴薯葉片Pn、Tr、Gs呈下降趨勢(shì)；但Ci表現(xiàn)為上升趨勢(shì)（表1）。對(duì)于葉片Pn，T1處理Pn與T0處理差異不顯著；但T2處理Pn較T0處理顯著降低，JZS和S分別降低20.72%和47.41%。對(duì)于葉片Tr，干旱脅迫對(duì)馬鈴薯JZS葉片Tr無(wú)顯著影響；但對(duì)馬鈴薯S葉片Tr影響顯著（表1），T1、T2和T3處理較T0處理分別降低22.23%、43.37%和63.08%。對(duì)于葉片Gs，T2和T3處理顯著降低了馬鈴薯葉片Gs，與T0處理相比，JZS和S分別降低38.54%、35.54%和56.62%、65.12%。綜上所述，干旱脅迫顯著降低了馬鈴薯葉片的Pn、Tr和Gs，干旱敏感型品種的變化更加顯著。

表1 不同處理下馬鈴薯葉片的光合特性Table 1 Photosynthetic characteristics of potato leaves under different treatments

2.2 干旱脅迫對(duì)馬鈴薯葉片抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶活性與植物抗旱能力呈正相關(guān)，是評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要標(biāo)志之一[19-20]。對(duì)不同處理馬鈴薯葉片中SOD、POD和CAT活性進(jìn)行分析，結(jié)果（表2）表明，隨著干旱脅迫的加劇，SOD和POD活性逐漸升高，而CAT活性呈先升高后降低趨勢(shì)。干旱脅迫使2個(gè)馬鈴薯品種葉片SOD活性較對(duì)照均有不同程度的升高；T3處理下，JZS和S葉片SOD活性較T0處理分別顯著升高103.5%和48.9%。干旱脅迫下，2個(gè)品種葉片POD活性變化趨勢(shì)與SOD變化趨勢(shì)一致；T3處理下JZS和S葉片POD活性較T0處理顯著升高，分別升高64.2%和59.4%。JZS葉片CAT活性隨干旱脅迫程度的加劇表現(xiàn)為先升高后降低，T2處理葉片CAT活性較T0處理顯著提高48.9%；而S葉片CAT活性隨干旱脅迫程度的加劇而降低，其中，T3處理較T0處理顯著降低34.2%。在相同處理?xiàng)l件下，JZS葉片CAT活性是S的1.15（T0）、1.41（T1）、1.70（T2）和1.69倍（T3），表明JZS較S抗旱能力更強(qiáng)。

表2 干旱脅迫下馬鈴薯葉片保護(hù)酶的活性Table 2 Enzyme activities of potato leaves under different treatments

2.3 馬鈴薯根際細(xì)菌群落測(cè)序數(shù)據(jù)及Alpha多樣性分析

分析供試土壤樣品，共獲得有效序列1 263 889條，S-T3處理的有效序列數(shù)最高，為178 086條；S-T1處理最低，為125 549條；所有處理的序列平均長(zhǎng)度為416.60～419.36 bp（表3）。在相似度為97%條件下，共獲得6 785個(gè)OTUs，歸屬33個(gè)門(mén)、94個(gè)綱、267個(gè)目、462個(gè)科、919個(gè)屬、1 930個(gè)種。

表3 不同處理下根際細(xì)菌群落的測(cè)序質(zhì)量Table 3 Sequencing quantity of rhizosphere bacteria under different treatments

所有供試樣品測(cè)序深度指數(shù)（coverage）均在96%以上。樣品中細(xì)菌群落豐度的Sobs、Chao和ACE指 數(shù) 分 別 為2 914.33～3 123.00、4 154.81～4 409.18和4 209.69～4 412.31；Shannon和Simpson多樣性指數(shù)分別為6.45～6.75和0.003～0.010；Shannon和Simpson均勻度指數(shù)分別為0.802～0.846和0.036～0.117（表4）。其中，T1處理的Shannon指數(shù)最高；T3處理的Simpson指數(shù)最高，而T0處理的Simpson指數(shù)最低。對(duì)于A(yíng)CE、Chao和Sobs指數(shù)，馬鈴薯S中以T0處理較高；而在JZS中以T3處理較高；但不同處理間差異不顯著。綜上所述，種植馬鈴薯和干旱脅迫改變了馬鈴薯根際微生物群落多樣性和均勻度，但對(duì)群落豐度指數(shù)無(wú)顯著影響。

表4 各處理根際土壤樣本Alpha多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity index of rhizosphere soil samples in each treatment

2.4 樣本分組分析

按品種（A）、是否種植馬鈴薯（B：空白對(duì)照土與馬鈴薯根際土）和干旱脅迫（C）分組，通過(guò)相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）檢驗(yàn)組間差異是否顯著大于組內(nèi)差異，結(jié)果（圖1和表5）表明，組間差異均大于組內(nèi)差異；3種分組方法的組間差異均達(dá)到顯著水平；其中，不同干旱脅迫程度對(duì)樣品間差異的解釋度最大，種植馬鈴薯對(duì)土壤微生物也有較大影響。

圖1 3種分組方式的組內(nèi)和組間差異ANOSIM分析Fig.1 ANOSIM analysis of differences between groups and groups in 3 grouping methods

表5 相似性分析Table 5 Analysis of similarties

2.5 種植馬鈴薯對(duì)土壤細(xì)菌群落影響

將對(duì)照土和根際土測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果（圖2）表明，根際土中共鑒定出6 815個(gè)OTUs，歸屬于33個(gè)門(mén)，919個(gè)屬；對(duì)照土中共鑒定出5 254個(gè)OTUs，歸屬于31個(gè)門(mén)791個(gè)屬。兩者共有OTUs為4 784個(gè)，對(duì)照土和根際土特有OTUs分別為470和2 031個(gè)（圖2A），說(shuō)明種植馬鈴薯后土壤細(xì)菌群落發(fā)生了顯著變化。

在門(mén)水平上，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes，）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）在根際土和對(duì)照土中的相對(duì)豐度均較高，相對(duì)豐度之和均達(dá)91.73%，為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（圖2B）。進(jìn)一步對(duì)相對(duì)豐度排名前15的菌門(mén)在根際土和對(duì)照土中的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，結(jié)果（圖2C）表明，根際土中放線(xiàn)菌門(mén)、髕骨細(xì)菌（Patescibacteria）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）和藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）的相對(duì)豐度較對(duì)照土分別顯著提高26.45%、76.99%、54.32%和48.32%；而酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、棒狀桿菌門(mén)（Rokubacteria）、裝甲菌門(mén)（Armatimonadetes）和腸桿菌門(mén)（Entotheonellaeota）的相對(duì)豐度較對(duì)照土分別顯著降低35.24%、17.67%、11.87%、26.59%、24.32%、30.00%和41.38%。

通過(guò)基于細(xì)菌多樣性Bray-Curtis距離的PCoA分析，可研究不同樣本之間群落組成的相似性或差異性。圖2D中兩樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本的物種組成越相似。根際土和對(duì)照土細(xì)菌形成了2個(gè)截然不同的集群，PC1（13.04%）與PC2（38.28%）的累計(jì)貢獻(xiàn)量達(dá)51.32%，說(shuō)明其能夠表征微生物群落組成的特征，種植馬鈴薯顯著改變了土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 種植馬鈴薯后土壤細(xì)菌多樣性Fig.2 Effects of planted potato on bacterial diversity

2.6 干旱脅迫對(duì)馬鈴薯根際細(xì)菌群落組成的影響

維恩圖（圖3A）分析顯示，各處理根際土壤微生物樣品共有OTUs為1 691個(gè)，在S-T0和JZS-T0樣品中分別有261和240個(gè)OTUs；而干旱處理后各樣品的OTU數(shù)量明顯下降，表明干旱脅迫對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著。

分析馬鈴薯根際土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）和浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）的相對(duì)豐度較高，相對(duì)豐度之和為97.08%（圖3B）。干旱處理提高了馬鈴薯根際土壤中變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度，其中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）的相對(duì)豐度隨干旱脅迫程度的加劇逐漸增加，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）在JZS-T2處理和S-T3處理中分別較其T0處理增加85.53%和83.99%；而干旱處理降低了酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）的相對(duì)豐度，其余菌門(mén)在不同品種間表現(xiàn)趨勢(shì)不同。

在屬分類(lèi)水平上，nor ank_c_Sub group_6、芽孢桿菌屬（Bacillus）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、RB41、

norank_f_Gemmatimonadaceae、nor ank_f_JG30-KFCM45、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、類(lèi)諾卡氏屬（Nocardioides）、鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對(duì)豐度較高，為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度之和為31.04%（圖3C）。節(jié)桿菌菌屬（Arthrobacter）的相對(duì)豐度隨干旱脅迫程度的加劇逐漸降低。假單胞菌屬（Ps eudomonas）的相對(duì)豐度在干旱脅迫后顯著增加，在JZS-T3和S-T3中分別提高1 833.33%和5 800.00%。干旱脅迫使JZST3中芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對(duì)豐度較T0顯著增加109.13%。

圖3 干旱脅迫下馬鈴薯根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community abundance in potato rhizosphere under drought stress

對(duì)不同門(mén)、屬在各處理的相對(duì)豐度（Top10）進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果（圖4A和4B）表明，變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、髕骨菌門(mén)（Patescibacteria）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）和節(jié)桿菌屬（Arthrob act er）、nor ank_f_JG30-K F-C M45、假單胞菌屬（Pseudomonas）、類(lèi)諾卡氏屬（Nocar di oides）、鏈霉菌屬（S t rept omyces）在不同處理間呈顯著或極顯著差異。PCoA分析（圖4C）顯示，PC1（39.39%）與PC2（25.66%）的累計(jì)貢獻(xiàn)量達(dá)到65.05%，說(shuō)明其能夠表征微生物群落組成的特征，其中，T0和T1處理根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)相似性較高，T2和T3處理根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)相似性較高。

圖4 不同干旱脅迫下馬鈴薯根際菌群組間差異Fig.4 Difference and distribution of rhizosphere soils under drought stress

2.7 干旱脅迫對(duì)馬鈴薯根際土壤的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析及功能預(yù)測(cè)

將相對(duì)豐度排名前20的屬所對(duì)應(yīng)的OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)最大似然法設(shè)置Bootstrap值為1 000次重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖5A）表明，相對(duì)豐度排名前20的屬均屬于 變 形 菌 門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）。

利用PICRUSt對(duì)16S rRNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，結(jié)果（圖5B）表明，與代謝功能和基本生命活動(dòng)相關(guān)的功能基因在干旱處理中均有所富集，表明干旱處理下微生物的代謝和生命活動(dòng)可能更加活躍。在COG注釋的功能分類(lèi)有24個(gè)，除未知功能外，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝類(lèi)最多，其次為一般代謝、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物轉(zhuǎn)錄與運(yùn)輸、無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等；RNA加工和修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)類(lèi)較少。

圖5 根際微生物的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)及功能預(yù)測(cè)Fig.5 Taxonomic analysis through phylogenetic tree and microbial functional features

3 討論

干旱導(dǎo)致作物光合速率降低，而提高葉片凈光合速率是干旱脅迫下保證作物產(chǎn)量的重要途徑。本文研究了不同耐旱型馬鈴薯品種在干旱脅迫下的光合響應(yīng)模式，結(jié)果表明，干旱脅迫使馬鈴薯葉片Pn、Tr和Gs均有不同程度的降低，但Ci有所升高，與前人在馬鈴薯[20]和番茄[21]（Lyco per sicon esculentum）中的研究結(jié)果一致，表明干旱脅迫抑制了馬鈴薯葉片的光合能力，特別是重度干旱脅迫下，葉肉細(xì)胞CO2同化酶活力下降等非氣孔限制性因素是馬鈴薯光合下降的主要原因。作物在遭受干旱脅迫時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)被誘導(dǎo)，以保護(hù)細(xì)胞膜免遭氧化損傷，本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下馬鈴薯葉片的SOD、POD活性明顯上升，而CAT活性則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與前人研究結(jié)果一致[22]。干旱脅迫下，SOD活性的變化可作為衡量馬鈴薯抗旱能力的指標(biāo)之一，SOD活性的增加使體內(nèi)產(chǎn)生的超氧自由基加速分解，以緩解膜脂過(guò)氧化程度[16,20]；本研究還發(fā)現(xiàn)，冀張薯8號(hào)（JZS）的SOD活性的變幅大于夏波蒂，與抗艷紅等[19]研究結(jié)果存在差異，有待進(jìn)一步研究。綜上所述，干旱脅迫降低了馬鈴薯葉片的光合能力，使抗氧化酶活性增加，且不同干旱脅迫程度下，其響應(yīng)也存在一定差異。

不同基因型的馬鈴薯間根際微生物群落差異較大[23]。本研究通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序研究了正常條件下和干旱脅迫下馬鈴薯根際微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，種植馬鈴薯后土壤中細(xì)菌群落中變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度較高，為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，與前人研究結(jié)果一致[23-24]。大麥（Hordeum vulgareL.）根際微生物中酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[25]；花生（Arachis hypogaeaL.）根際微生物中以放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和藍(lán)藻菌門(mén)（Cyanobacteria）為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[26]；擬南芥（Arab i d opsis thalianaL.）根際微生物中以變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[27]。不同作物根際微生物中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)存在差異，可能與不同作物根系分泌物的不同有關(guān)。在本研究中，種植馬鈴薯后根際土壤中芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度較種植前有所降低，在高粱（Sorgh um b icolorL.）種植前后的根際土壤中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象[28]。

脅迫環(huán)境下，根際微生物群落的變化可能對(duì)植物的生長(zhǎng)和健康產(chǎn)生重要影響。通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使馬鈴薯根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且一些特定微生物種類(lèi)得到富集，如變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對(duì)豐度顯著升高。研究發(fā)現(xiàn)，芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）作為好氧/厭氧嗜熱菌，在干旱條件下生長(zhǎng)良好[29]；單胞菌屬（Pseudomonas）為革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)干旱具有較強(qiáng)的抗性，能夠在干旱條件下生長(zhǎng)良好。

對(duì)菌群代謝功能預(yù)測(cè)表明，多與氨基酸運(yùn)輸代謝相關(guān)，其次是能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物轉(zhuǎn)錄與運(yùn)輸、無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝及脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝。脂質(zhì)是微生物膜的重要組成部分，在環(huán)境脅迫響應(yīng)和生存中發(fā)揮著重要作用。在干旱脅迫下，脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝微生物的富集有利于增強(qiáng)植物的抗旱性[30]。放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）的主要功能是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及作為70%抗生素的來(lái)源[31]，其菌絲體抗干燥能力強(qiáng)，研究表明根際微生物組對(duì)干旱的響應(yīng)中涉及鐵代謝，但外源添加鐵又會(huì)破壞干旱引起的放線(xiàn)菌門(mén)富集[15]。本研究表明，輕度干旱下Actinobacteria得以富集；中度和重度干旱脅迫則降低了其相對(duì)豐度，說(shuō)明適宜的干旱可以使土壤中的放線(xiàn)菌門(mén)富集。厚壁菌門(mén)（Firmicutes）能夠抗脫水，對(duì)干旱和極端環(huán)境的適應(yīng)能力極強(qiáng)[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，重度干旱下厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度較高。不同的優(yōu)勢(shì)微生物群落可能代表了植物在相應(yīng)干旱條件下所需的微生物類(lèi)型，此外，一些基本的生物過(guò)程，如與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜生物合成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA加工與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞骨架和胞外結(jié)構(gòu)相關(guān)的類(lèi)群在干旱處理的土壤微生物群中也有所富集。因此，可以通過(guò)研究不同干旱處理下優(yōu)勢(shì)微生物的種類(lèi)，開(kāi)發(fā)微生物接種劑，提高植物的抗旱能力。作為植物生長(zhǎng)促進(jìn)菌，這些細(xì)菌可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高植物抗旱性[33-34]。干旱處理后，馬鈴薯根際土壤微生物群落具有較高的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和防御機(jī)制，對(duì)脅迫和有毒化合物具有較高的耐受性[35]。推測(cè)這些功能可能在一定程度上影響馬鈴薯的生長(zhǎng)和抗旱能力。在根際土壤中，根系分泌物在介導(dǎo)植物與微生物的相互作用中起重要作用[36]，為闡明植物-土壤-微生物互作關(guān)系，應(yīng)對(duì)根系分泌物進(jìn)行深入研究，為通過(guò)調(diào)控根際土壤微生物環(huán)境來(lái)提高植物抗旱性提供可能。