大豆內(nèi)生細菌的分離及其作用效果研究

田振祥，丁偉*，程茁，戴航宇

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆作為中國重要的糧食作物，當(dāng)前面臨國內(nèi)生產(chǎn)不足、依賴進口的嚴峻形勢?；瘜W(xué)肥料的大量施用會導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化。大豆中存在豐富的內(nèi)生菌種群，具有多種生理生態(tài)學(xué)功能，如生物固氮、調(diào)節(jié)植物激素分泌、產(chǎn)生抑菌代謝物質(zhì)等[1]。探索大豆內(nèi)生菌作為環(huán)境友好型生物刺激素應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，對大豆生產(chǎn)中減少化學(xué)肥料的使用具有重要意義。

當(dāng)前從植物中分離和鑒定的內(nèi)生細菌主要包括根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas）、葡 萄 球 菌 屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacil l us）等[2]。大豆種子內(nèi)生細菌研究開展較晚[3]，目前國內(nèi)外對大豆內(nèi)生細菌的研究多是從根、莖或根瘤內(nèi)進行分離和鑒定，具體作用表現(xiàn)為具有分泌細胞素酶、果膠酶、植物生長素（IAA）能力和對某些植物病原菌具有拮抗作用[4-5]。從大豆根部分離獲得的賴氨酸芽孢桿菌與微桿菌能分泌大量的IAA內(nèi)生細菌，對大豆的生長具有顯著促進作用[6]。衡楠楠等[7]把大豆根瘤中分離獲得的內(nèi)生菌株SCAUS8接種到大豆植株上，對大豆生長和產(chǎn)量均有顯著促進作用。王玉霞等[8]從不同大豆品種的根、莖、葉中分離獲得芽孢桿菌，其對尖孢鐮孢菌、菌核病菌等病原菌具有良好生物防治效果。種子中也存在豐富的內(nèi)生菌，并具有合成植物激素、溶磷、固氮和抗逆等功能[9]。從水稻和田菁種子中分離得到檸檬色短小桿菌K12G2和BacillusSC60，該菌株具有產(chǎn)IAA、溶解無機磷、固氮及提高淀粉酶活性的促生特性，對種子萌發(fā)與幼苗生長具有促進作用[10-11]。如今生物刺激素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用發(fā)展迅速[12]，已有多項研究表明，應(yīng)用植物促生細菌作為生物刺激素具有促進植株生長和提高產(chǎn)量的作用[13-14]。大豆體內(nèi)具有豐富的內(nèi)生細菌，并具有多種生理生態(tài)學(xué)功能[15-17]，但目前關(guān)于內(nèi)生細菌的研究對象大多為禾本科植物和林木，關(guān)于大豆內(nèi)生細菌的相關(guān)研究相對較少，因此發(fā)掘并應(yīng)用大豆內(nèi)生細菌作為環(huán)境友好型生物刺激素，對減少化學(xué)肥料使用、促進大豆生長發(fā)育、提高大豆抗逆能力和產(chǎn)量等具有重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試種子 轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆呼交06-698及其受體蒙豆12由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，轉(zhuǎn)基因抗旱大豆T-DREB3-1及其受體東農(nóng)50由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)教育部重點實驗室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯（NA）培養(yǎng)基：牛肉粉3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4。

營養(yǎng)瓊脂（NB）培養(yǎng)基：牛肉粉3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

Pikovskava無機解磷固體培養(yǎng)基:葡萄糖10 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.3 g、Ca3(PO4)25 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.2 大豆種子內(nèi)生細菌的分離及純化

每個大豆品種各取10粒，分別裝入2層無紡布袋內(nèi)，埋藏于20 cm深土層中，試驗地點位于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院北側(cè)人煙稀少的樹林內(nèi)，在第3、第7天觀察種子有無腐爛變質(zhì)，若種子健康則放回深土層中，至第10天后取出種子，種子取出后用95%乙醇消毒1 min，0.5%升汞消毒2 min，70%乙醇消毒1 min，然后用無菌水清洗5～7次，用無菌濾紙吸干水分，用滅菌鑷子分別取出大豆放入NB培養(yǎng)基內(nèi)，每個培養(yǎng)皿放置5粒大豆種子。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)，胚根伸出后每天觀察種子和胚根周圍菌落生長情況。另取無菌水100μL涂于培養(yǎng)基表面作為對照。從胚根周圍出現(xiàn)菌落的培養(yǎng)皿中挑取單菌落至NB培養(yǎng)基劃線純化，純化后單菌轉(zhuǎn)到NB培養(yǎng)基斜面試管中保存。

1.3 促生細菌的初步篩選

挑選籽粒飽滿的大豆種子，取200 mL所得內(nèi)生菌懸液進行浸種4 h處理，使用不含內(nèi)生菌的滅菌NA培養(yǎng)基作為對照。把浸種后的種子置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，保持濾紙濕潤，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后測定發(fā)芽勢，7 d后測定發(fā)芽率、芽長，每處理3次重復(fù)；另取上述2種方法處理的種子播種在裝有滅菌土的小盆中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，晝夜溫度為25℃/20℃,光照時間12 h/12 h，分別于14、21 d測定大豆株高，每處理3次重復(fù)。從中篩選優(yōu)勢菌株進行16s rRNA鑒定和后續(xù)的作用效果研究。

宏波的畫風(fēng)恰恰兼容了海派與新浙派繪畫的一些特質(zhì)與精髓，既重視浙派花鳥畫的寫意精神與美學(xué)傳統(tǒng)，又照顧到了海派藝術(shù)的色彩明麗與雅俗共賞，呈現(xiàn)出瀟灑飄逸，古樸雄厚的繪畫特色，將新浙派的風(fēng)骨與海派的濃艷合二為一，因而其筆下的花鳥畫作品無論是何種題材，均能體現(xiàn)出一種艷而不俗，清而不媚，秀而不寒，多而不亂，清麗超脫的可人姿致。

1.4 內(nèi)生細菌的鑒定

按照細菌基因組提取試劑盒說明書（天根生化科技有限公司）提取大豆內(nèi)生菌株DNA。采用引 物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增16S rRNA序列，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR擴增體系：模板1μL，引物各1μL，PCR Super Mix 15μL，加入雙蒸水補足30μL。PCR擴增程序：96℃預(yù)變性5 min；96℃變性20 s，62℃退火20 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，16℃保溫。PCR產(chǎn)物利用1.0%的瓊脂糖凝膠進行檢測，觀察條帶性狀。將純化后的PCR產(chǎn)物交由北京六合華大基因科技有限公司進行測序，獲得拼接序列后在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，選擇相似度較高的菌株序列使用Mega 7.0軟件以Neighbor-joining鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，確定菌株種屬。

1.5 產(chǎn)IAA能力測定

取0.5 mol·L-1FeCl3溶液10 mL，加入500 mL 35%的HClO4溶液中，獲得Salkowski比色液。將優(yōu)勢菌株接種到NA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h（30℃、180 r·min-1）后，分別取100μL KC-1與MD12-2菌懸液接種至含200 mg·L-1色氨酸的NA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h（30℃、180 r·min-1），每錐形瓶含100 mL培養(yǎng)液，設(shè)3次重復(fù)。將菌株培養(yǎng)液8 000 r·min-1離心1 min，取上清液與Salkowski比色液等量混合，使用未接菌NA培養(yǎng)基與Salkowski比色液混合作為陰性對照，使用IAA水溶液與Salkowski比色液混合作為陽性對照，室溫下避光靜置30 min，觀察其變色情況。若3次重復(fù)均變紅，表明該菌株具備產(chǎn)IAA能力[11]。

1.6 內(nèi)生菌株溶磷能力測定

待無機解磷培養(yǎng)基凝固后，使用打孔器在培養(yǎng)基中間打孔，直徑約為0.5 cm，取培養(yǎng)所得內(nèi)生菌液50μL點入孔中[19]，30℃下培養(yǎng)4～7 d后，若菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明圈，表明該菌株溶磷能力良好[11]。

1.7 大豆內(nèi)生細菌促萌發(fā)效果測定

將菌株在NA培養(yǎng)基中接種后，于恒溫搖床（37℃，180 r·min-1）培養(yǎng)24 h，在血球計數(shù)板中觀察可知菌液含量約為10×107cfu·mL-1，稀釋菌液至1倍、2倍、4倍，即調(diào)整菌液含量為高（10.0×107cfu·mL-1）、中（5.0×107cfu·mL-1）、低（2.5×107cfu·mL-1）。選擇飽滿、大小均一的呼交06-698和蒙豆12大豆種子，表面消毒后分別取200 ml高、中、低3種含量的KC-1與MD12-2菌懸液進行浸種處理4 h，使用滅菌NA培養(yǎng)基（0.0 cfu·mL-1）作為對照，每處理20粒種子，設(shè)3次重復(fù)。將處理后的種子置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，保持濕潤，于恒溫培養(yǎng)箱25℃進行培養(yǎng)。每天觀察并記錄種子發(fā)芽情況。3 d后測定發(fā)芽勢、7 d后測定發(fā)芽率，并按以下公式計算內(nèi)生菌對種子萌發(fā)和幼苗的影響[20]。第7天采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法[21]測定大豆種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶含量。

式中，Gt指在時間t日內(nèi)發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)。

1.8 大豆內(nèi)生細菌的作用效果

在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)盆栽場內(nèi)，選用直徑30 cm，高40 cm的花盆，每盆裝草炭混合營養(yǎng)土3 kg，供試呼交06-698和蒙豆12大豆種子表面消毒后，分別用高（10.0×107cfu·mL-1）、中（5.0×107cfu·mL-1）、低（2.5×107cfu·mL-1）、滅菌NA培養(yǎng)基（0.0 cfu·mL-1）4種處理的菌懸液浸種4 h，將處理后的種子每盆播種3粒，播深3 cm，每處理5次重復(fù)。

1.8.1 內(nèi)生細菌促生長效果測定 在大豆生長苗期、初花期、結(jié)莢期，隨機選取植株對大豆株高、地上部干重、地下部干重、根瘤鮮重、根瘤干重和根瘤數(shù)進行調(diào)查。

1.8.2 大豆葉綠素含量和硝酸還原酶活性測定在大豆苗期、初花期、結(jié)莢期，各處理隨機挑選植株，選取新近完全展開的復(fù)葉，參照張憲政等[22]方法測定葉綠素含量和硝酸還原酶活性測定。

1.8.3 大豆根系活力測定 在大豆苗期、初花期、結(jié)莢期，每個處理隨機選取大豆根系，采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[23]測定大豆根系活力。

1.8.4 大豆根瘤固氮酶活性測定 在大豆苗期、初花期、結(jié)莢期，每個處理隨機選取大豆根系，參考ZabLotowicz等[24]和Ding等[25]的方法并改進，測定各處理大豆根瘤固氮酶活性。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013進行原始數(shù)據(jù)整理，應(yīng)用DPS 7.05軟件分析處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆內(nèi)生細菌的分離與優(yōu)勢菌株篩選

從4個大豆品種中共分離獲得8株內(nèi)生細菌，其中，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆呼交06-698中分離獲得2株，編號為KC-1、KC-2；蒙豆12中分離獲得2株，編號為MD12-1、MD12-2；轉(zhuǎn)基因抗旱大豆T-DREB3-1中分離獲得1株，編號為KH-1；東農(nóng)50中分離獲得3株，編號為DN50-1、DN50-2、DN50-3。分離所得內(nèi)生細菌菌液浸種處理后，與其他處理相比，KC-1與MD12-2菌液處理效果最好，大豆種子發(fā)芽勢、芽長與株高均顯著增加(P＜0.05)（表1），選擇菌株KC-1與MD12-2進行鑒定及后續(xù)效果試驗。

表1 不同內(nèi)生細菌浸種后大豆萌發(fā)性狀Table 1 Effect of different endophytic bacterial dips on germination and growth of soybean

2.2 優(yōu)勢內(nèi)生細菌的16S rRNA分析

對KC-1和MD12-2菌株DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見條帶清晰明亮，提取的DNA具有較高濃度與純度，可進行下一步試驗。通過16S rRNA序列比對，從結(jié)果中選取序列相似度高具有代表性的菌株，使用Neighbor-joining鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1、圖2）。Blast比對結(jié)果顯示，KC-1與Brevibacill us laterosporusDSM 25相似性高達100%，MD12-2與Bacillus subti l isstrain soil G2B相似性高達100%，一般情況下，16S rRNA序列之間存在97%以上相似性的原核生物被認為屬于同種[26]，因此KC-1屬于Brevib acil l us laterospor us，MD12-2屬于Bacillus s ubtilis。

圖1 菌株KC-1的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of strain KC-1

圖2 菌株MD12-2的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA of strain MD12-2

2.3 菌株產(chǎn)IAA能力

在含色氨酸的培養(yǎng)基中接種菌株KC-1與MD12-2，與比色液混合后，與陰性對照比對，呈現(xiàn)紅色，與陰性對照有明顯的差異(圖3)，說明菌株KC-1與MD12-2具有產(chǎn)生IAA的能力[27]。

圖3 菌株KC-1和MD12-2產(chǎn)IAA的能力Fig.3 IAA secreting ability of strains KC-1 and MD12-2

2.4 菌株溶磷能力

與對照相比，KC-1與MD12-2菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明圈（圖4），說明KC-1與MD12-2具有良好的溶磷能力。

圖4 菌株KC-1和MD12-2的溶磷能力Fig.4 Phosphate solubilizing ability of strains KC-1 and MD12-2

2.5 內(nèi)生細菌對大豆種子萌發(fā)特性的影響

在低含量KC-1與MD12-2菌液浸種處理下，大豆種子發(fā)芽勢較對照顯著增加41.68%和38.34%，種子活力分別較對照顯著提高45.54%和236.47%，發(fā)芽率未見顯著變化。各含量菌液浸種處理的種子在萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性較對照均有顯著提高，其中低含量KC-1與MD12-2菌液浸種處理大豆α-淀粉酶活性較對照升高最多，分別增加46.5%和144.9%（表2）?？梢?，低含量KC-1與MD12-2浸種對種子萌發(fā)具有明顯的促進作用。

表2 大豆內(nèi)生細菌的促萌發(fā)效果Table 2 Promoting germination of soybean endophytic bacteria

2.6 內(nèi)生細菌的促生長效應(yīng)

2.6.1 內(nèi)生細菌浸種對大豆生長指標(biāo)的影響MD12-2中含量和高含量浸種處理下，大豆苗期株高較對照分別顯著增加27.3%和25.5%；高含量KC-1與MD12-2處理大豆株高在初花期較對照分別顯著提高50.2%和28.9%，結(jié)莢期較對照分別顯著提高25.7%和29.5%。初花期，高含量KC-1與MD12-2處理大豆植株地上部干重較對照分別顯著增加24.6%和19.3%。苗期，各含量KC-1浸種處理大豆植株地下部干重均顯著增加；結(jié)莢期，中含量MD12-2浸種處理大豆植株地下部分干重較對照顯著增加26.5%?？梢?，中、高含量的KC-1和MD12-2浸種對大豆生長的促進效果最好（表3）。

表3 大豆內(nèi)生細菌的促生長效果Table 3 Promoting function of soybean endophytic bacteria

2.6.2 內(nèi)生細菌浸種對大豆葉綠素含量的影響 苗期，中、低含量MD12-2浸種處理，大豆葉綠素含量較對照分別顯著提高16.9%和13.0%；初花期，中含量MD12-2浸種處理下，大豆葉綠素含量較對照顯著提高27.4%；結(jié)莢期，各處理間均無明顯差異?？梢?，中、低含量MD12-2在大豆生長苗期和初花期可顯著增加葉綠素含量，菌株KC-1對大豆葉綠素含量無明顯影響（圖5）。

圖5 內(nèi)生細菌對大豆葉綠素含量的影響Fig.5 Effect of endophytic bacteria on chlorophyll content of soybean

2.6.3 內(nèi)生細菌浸種對大豆硝酸還原酶活性的影響 苗期，高、中含量KC-1與MD12-2浸種處理后，大豆硝酸還原酶活性提升幅度較為明顯，較對照分別提高119.5%、94.23%與70.7%、87.54%；初花期，中含量KC-1與MD12-2浸種處理，大豆硝酸還原酶活性較對照分別顯著提高109.1%和129.0%；結(jié)莢期，中含量KC-1與MD12-2處理下大豆硝酸還原酶活性較對照分別顯著提高66.9%與117.5%?？梢姡缙跁r高、中含量KC-1與MD12-2對提高大豆硝酸還原酶活性作用效果最好；初花期與結(jié)莢期時，中含量KC-1與MD12-2對提高大豆硝酸還原酶活性作用效果最好（圖6）。

圖6 內(nèi)生細菌對大豆硝酸還原酶的影響Fig.6 Effect of endophytic bacteria on nitrate reductase activity of soybean

2.6.4 內(nèi)生細菌浸種對大豆根系活力的影響 苗期，高、中、低含量KC-1與高、中含量MD12-2處理的大豆根系活力均有顯著提高；其中，中含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力提高幅度最大，較對照顯著提高75.4%和84.0%(P＜0.05)。初花期，高、中、低含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力均有顯著提高；其中，中含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力提高幅度最大，較對照分別顯著提高107.2%和195.3%。結(jié)莢期，中含量KC-1與高、中、低含量MD12-2處理的大豆植株根系活力均有顯著提高；其中，中含量KC-1與MD12-2處理的大豆根系活力提高幅度最大，較對照分別顯著提高45.0%與160.1%?？梢?，中含量KC-1與MD12-2對提高大豆根系活力作用效果最好（圖7）。

圖7 內(nèi)生細菌對根系活力的影響Fig.7 Effect of endophytic bacteria on root activity of soybean

2.6.5 內(nèi)生細菌浸種對大豆根瘤固氮酶活性的影響 苗期，低含量KC-1處理，大豆根瘤固氮酶活性顯著增加124.1%(P＜0.05)；初花期，高含量KC-1與MD12-2處理根瘤固氮酶較對照分別顯著提高100.4%和44.6%；結(jié)莢期，高含量KC-1處理根瘤固氮酶活性較對照顯著提高191.0%(P＜0.05)?？梢姡秃縆C-1在苗期對提高大豆根瘤固氮酶活性作用效果最好；高含量KC-1在初花期與結(jié)莢期對提高大豆根瘤固氮酶活性作用效果最好；高含量MD12-2在初花期對提高大豆根瘤固氮酶活性作用效果最好（圖8）。

圖8 內(nèi)生細菌對根瘤固氮酶的影響Fig.8 Effect of endophytic bacteria on nitrogenase activity in root nodules

3 討論

本研究采用種子埋藏的方法使土壤微生物定植于種子內(nèi)成為內(nèi)生菌，這與周怡等[28]直接選擇大豆種子破碎后進行內(nèi)生菌分離的方式不同，該方法不僅可以獲得大豆種子內(nèi)源本存在的內(nèi)生菌，還可獲得能侵入并定植于大豆種子內(nèi)的土壤微生物，更易得到豐富的內(nèi)生菌株。植物內(nèi)生菌分離因消毒、分離等方式的不同，所得內(nèi)生菌數(shù)量、種類及準(zhǔn)確性也存在區(qū)別。對種子表面消毒后采用無菌水清洗，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大豆并在胚根周圍獲得內(nèi)生菌，這種方法既可保證獲得菌株來自大豆種子內(nèi)部，又可避免破碎種子后分離內(nèi)生菌容易在操作過程中污染而造成準(zhǔn)確性差的不利影響。

本研究所得2株優(yōu)勢內(nèi)生細菌KC-1與MD12-2，經(jīng)16S rRNA鑒定分別為側(cè)孢芽孢桿菌（Brevib aci l lus laterosporus）和 枯 草 芽 孢 桿 菌（Baci l lus s ubtilis），利用菌株發(fā)酵液進行浸種處理后發(fā)現(xiàn)，種子的發(fā)芽勢、種子活力和種子萌發(fā)時α-淀粉酶活性較對照均有顯著提高，說明使用大豆內(nèi)生細菌浸種處理對大豆種子萌發(fā)有良好的促進效果，與張凱曄等[11]田菁種子內(nèi)生菌SC17浸種處理的研究結(jié)果一致。Khan等[29]接種內(nèi)生菌Peni cilliumminiol ut eumLHL09，使大豆芽伸長、葉面積和葉綠素含量等得到顯著提高，本研究中菌株KC-1與MD12-2發(fā)酵液浸種處理，可以增強大豆生長過程中硝酸還原酶與根瘤固氮酶活性，提高大豆葉綠素含量，從而保證大豆在生長期間健康的氮循環(huán)過程，保證大豆植株中高水平含量的氮，促進大豆的光合作用，大豆的株高、地上部干重和地下部干重顯著增加，使大豆獲得較高的干物質(zhì)積累，并提高大豆生育期內(nèi)根系活力，提高大豆的吸水能力與營養(yǎng)獲取能力，為大豆高產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。