一種絞股藍根結線蟲的研究初報

李 瑜，覃劍鋒，劉運華，孫瑩瑩，唐曉東

（安康市農(nóng)業(yè)科學研究院，陜西 安康 725021）

0 引言

絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)屬葫蘆科絞股藍屬的多年生草質(zhì)藤本植物，又名五葉參、七葉膽、遍地生根，是中國傳統(tǒng)的中草藥之一，具有抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、強心壯體的功效，能有效抑制血清中中性脂肪、膽固醇的生成，可以降低血脂，保護肝臟，增加食欲[1-3]。其富含硒、鋅、錳等微量元素，對人體健康有明顯的促進作用，在保健食品和新型藥品研發(fā)上都有巨大的應用前景[4]，是一種新的藥食兩用植物資源[5-7]。安康是絞股藍的最佳適生區(qū)，已形成產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的格局，目前種植面積近67000 hm2，尤其是平利絞股藍已經(jīng)獲得了“國家地理標志”產(chǎn)品保護，開發(fā)絞股藍總甙片、絞股藍飲品、絞股藍食品等系列產(chǎn)品，經(jīng)濟效益十分顯著，在產(chǎn)業(yè)精準扶貧、國家生態(tài)功能區(qū)建設方面發(fā)揮著重要作用。

根結線蟲屬線蟲門(Nematoda)側尾腺口綱(Secementea)墊刃目(Tylenchida)異皮科(Heteroderidea)的根結線蟲屬(Meloidogyne)，蟲體相對較小，是一種重要的高度?；缘碾s食性植物病原物，主要危害植物的地下根系，尤其是幼嫩的側根和須根發(fā)病嚴重，使植物根系畸變形成大小不一的根結[8]，具有寄主廣、致病性強、繁殖快和易傳播擴散等特點[9]，在園藝和大田作物生產(chǎn)中具有很強的經(jīng)濟破壞力[10]。目前已報道的根結線蟲有100多種，為害的植物種類有蔬菜、經(jīng)濟作物、藥材、果樹、花卉和糧食等3000多種[11-12]。但目前還未有在絞股藍上發(fā)現(xiàn)根結線蟲的報道。

絞股藍的種植方式主要是傳統(tǒng)的農(nóng)田種植，由于連作障礙的影響必須2～3年輪作倒茬一次，使得用地短缺、病害頻發(fā)，嚴重影響了安康絞股藍的高質(zhì)量發(fā)展。常見的絞股藍病害有白粉病、葉斑病、立枯病、白絹病，蟲害有三星葉甲、小地老虎、蛞蝓及小地老虎等，而絞股藍根結線蟲病卻未見報道。基于此，為了解安康地區(qū)絞股藍根結線蟲的發(fā)生情況，揭示絞股藍連作與根結線蟲的關系，本研究對安康絞股藍主產(chǎn)區(qū)根結線蟲的發(fā)生情況進行調(diào)查，對絞股藍根結線蟲病的發(fā)病癥狀進行較為詳細的闡述，并采用會陰花紋形態(tài)特征[13]及PCR技術[14-16]對其病原根結線蟲進行分離鑒定，從而確定安康地區(qū)一種絞股藍根結線蟲病，為絞股藍根結線蟲病的防治提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

在安康發(fā)生根結線蟲危害的絞股藍主產(chǎn)區(qū)進行根結線蟲病根采集，并用清水將采集到的根結線蟲病根進行充分清洗，然后將洗凈的病根放置于體視顯微鏡下用鑷子或解剖針將根結表皮剝開觀察，出現(xiàn)的乳白色光滑梨形物即為根結線蟲的雌蟲，再用解剖針將白色雌蟲撥出后放入水中備用。

1.2 絞股藍根結線蟲田間調(diào)查

2021年4—5月，赴平利縣長安鎮(zhèn)中原村絞股藍種植基地、平利縣廣佛鎮(zhèn)廊坊村絞股藍種植基地、恒口鎮(zhèn)安康市農(nóng)科院絞股藍種植基地調(diào)查絞股藍根結線蟲危害。分別調(diào)查各調(diào)查點種植一茬、二茬、三茬及四茬以上種植的田塊，每種類型隨機調(diào)查10～15個地塊，每田塊采用“五點取樣”方法共調(diào)查15株，統(tǒng)計絞股藍根結線蟲發(fā)病株數(shù)及發(fā)病程度，并挖取完整的絞股藍根系帶回實驗室進行根結線蟲的分離鑒定。

根結線蟲分級采用呂軍等[17]的方法。0級，根系無根結；1級，根結占全部根系的1%～25%；2級，根結占全部根系的26%～50%；3級，根結占全部根系的51%～75%；4級，根結占全部根系的76%～100%。根結線蟲發(fā)生率計算見式(1)。

1.3 線蟲的分離及形態(tài)學觀察

參照劉維志[18]和謝輝[19]的方法將分離的絞股藍根結線蟲雌成蟲制作病原根結線蟲雌成蟲會陰花紋，并在顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。

1.4 根結線蟲分子生物學鑒定

1.4.1 根結線蟲DNA提取 參照王曦茁等[20]與章淑玲等[21]的方法進行絞股藍根結線蟲DNA提取，并置于-20℃冰箱中備用。

1.4.2 ITS核糖體DNA序列擴增和分析 參照王曦茁等[20]的研究及方法將所分離篩選獲得的絞股藍根結線蟲利用Vrain設計的線蟲通用引物V5367/26S(TTGATTACGTCCCTGCCCTTT/TTTCACTCGCCGT TACTAAGG)進行核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)擴增與測序。

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 測序結果在NCBI網(wǎng)站進行blast比對，并從Genbank中下載相似的序列，采用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 絞股藍根結線蟲發(fā)病癥狀

通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，安康市平利縣及安康市農(nóng)科院絞股藍種植基地2年生以上的植株均有根結線蟲的發(fā)生，危害較輕或根結線蟲侵染初期的絞股藍植株地上部分無癥狀表現(xiàn)；受害較重時，感病植株地上部分出現(xiàn)植株矮小、長勢弱，生長緩慢，葉片變小且黃化失綠或萎蔫，甚至有植株枯死的現(xiàn)象（圖1a～b），發(fā)病嚴重的種植基地死亡率達到50%～70%。在發(fā)病絞股藍植物根部有許多大小不一、形狀不定、表面粗糙隆起的根瘤狀根結（圖1c），新生側根及須根上有大量大小不等、米粒狀或近圓形的根結（圖1d），發(fā)病嚴重的根部呈現(xiàn)腐爛、壞死的狀態(tài)（圖1e～f）。將絞股藍受害根部根結洗凈后，放置在體視顯微鏡下切開后即能觀察到白色梨形根結線蟲的雌蟲。

圖1 絞股藍根結線蟲發(fā)病癥狀

2.2 絞股藍根結線蟲發(fā)病情況調(diào)查

由絞股藍主要種植區(qū)域根結線蟲危害情況調(diào)查結果（表1）可知，安康地區(qū)絞股藍根結線蟲發(fā)生危害較為普遍，在主產(chǎn)區(qū)平利縣以及安康市農(nóng)科院的種植區(qū)絞股藍根系上均發(fā)現(xiàn)了明顯的根結。從發(fā)病病株率及根結分級結果看，在平利縣長安鎮(zhèn)中原村相近海拔的種植基地，連作3年的絞股藍發(fā)病率較連作2年的增加21.6%，根結分級增加1級；連作4年后較連作2年的發(fā)病率增加了52.1%，根結分級增加2級；位于安康市農(nóng)科院的絞股藍種植基地情況類似，連作3年的植株發(fā)病率比連作2年的增加21.1%，說明隨著絞股藍種植年限的延長、連作茬次的增加，感染根結線蟲的發(fā)病株不斷增加，危害程度也依次加重，因此推測連作種植是安康市絞股藍根結線蟲危害不斷加重的直接原因之一；從絞股藍種植區(qū)海拔高度看，不同的海拔高度對根結線蟲的發(fā)生也有很大影響，位于低海拔地區(qū)的恒口鎮(zhèn)種植區(qū)的絞股藍發(fā)病病株率均比高海拔地區(qū)的長安鎮(zhèn)中原村、廣佛鎮(zhèn)廊坊村的高，平均高36.53%，且發(fā)病程度也較高海拔地區(qū)嚴重；相同種植年限下的絞股藍在低海拔區(qū)的發(fā)病病株率比高海拔區(qū)增加了38.2%～47.6%，發(fā)病程度均增加2級，說明海拔高度是影響絞股藍根結線蟲危害加重的重要原因，種植在適宜的海拔高度是防止絞股藍根結線蟲病加重的一個有效措施。

表1 絞股藍根結線蟲發(fā)生情況調(diào)查

2.3 絞股藍根結線蟲形態(tài)學特征

通過絞股藍根結中的根結線蟲分離及雌成蟲形態(tài)特征的觀察發(fā)現(xiàn)，分離到的根結線蟲雌成蟲為白色呈梨形，口針的針錐向背面彎曲，排泄孔位于口針基球處（圖2a），雌成蟲會陰花紋圖（圖2b）可見明顯高而方的背弓，線紋由平滑到波浪形，有些紋線向側面分叉，但無明顯側線。因此，初步判斷絞股藍根結線蟲可能為南方根結線蟲。

圖2 根結線蟲雌蟲分離及會陰花紋觀察

2.4 絞股藍根結線蟲分子生物學鑒定

利用通用引物V5367和26S將采集的絞股藍根結線蟲DNA標樣2-T-1進行rDNA-ITS區(qū)域擴增，得到約760 bp的片段。通過對ITS擴增樣品進行測序及BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)該NCBI序列號為2-T-1D的序列與南方根結線蟲的ITS序列(KJ476151.1、KP202352.1、KP202350.1)的一致性高達99.64%。通過將標樣ITS序列與在NCBI數(shù)據(jù)庫下載的南方、北方、花生、爪哇、象豆、西班牙、秀麗隱桿線蟲ITS序列進行聚類發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，樣品ITS序列與南方根結線蟲的序列處于同一個分支，且其置信度為100%（圖3）。由此確定，安康地區(qū)絞股藍根結線蟲為南方根結線蟲。

圖3 基于不同種群根結線蟲ITS序列的聚類樹

3 結論與討論

本研究對安康絞股藍主產(chǎn)區(qū)6個調(diào)查點的絞股藍根結線蟲病進行了取樣調(diào)查，在安康市絞股藍主產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)了不同程度的根結線蟲危害，嚴重的地塊發(fā)病率高達75.4%，給絞股藍種植戶造成了較大的經(jīng)濟損失。通過研究不僅初步了解了安康地區(qū)絞股藍根結線蟲危害情況、影響因素，也對絞股藍根結線蟲的發(fā)病癥狀進行了較為詳細的描述，同時將采集分離的根結線蟲病原進行形態(tài)學觀察及rDNA-ITS序列分析方法分離鑒定，確定了發(fā)生在陜西省安康地區(qū)絞股藍上的根結線蟲為南方根結線蟲，為進一步開展該病原線蟲的研究和防控提供了參考。

南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)作為根結線蟲屬(Meloidogynespp.)四大優(yōu)勢種群之一，分布廣、危害大，是中國最主要的根結線蟲種類，在中國的北方溫帶地區(qū)和南方熱帶地區(qū)皆有分布，目前報道的危害植物有蔬菜、水果、中藥材及園林樹木等[22]，但還未見有絞股藍上發(fā)生根結線蟲的文獻報道。位于秦巴山區(qū)的安康自然資源優(yōu)越，是絞股藍的原產(chǎn)地之一，特別是平利縣的絞股藍以種類多、資源豐富、品質(zhì)好在國內(nèi)外享有盛譽。但在種植上，安康絞股藍雖然有成熟的人工種植技術，卻仍然存在因連作障礙導致質(zhì)量下降、病害頻發(fā)的問題。研究發(fā)現(xiàn)，根結線蟲病作為一種較為嚴重的土傳病害，其危害程度會隨著重茬或連作次數(shù)的增加而加劇，本研究結果也表明絞股藍根結線蟲發(fā)病情況隨種植年限的延長和連作的次數(shù)增加而依次加重?？梢酝茰y，絞股藍根結線蟲病可能是導致絞股藍連作障礙的原因之一，因此，做好根結線蟲的防治對克服絞股藍連作障礙至關重要。

目前，根結線蟲的防治主要有化學藥劑防治、輪作、間作防治、生物防治和使用抗病品種等方法，其中，使用抗病品種被認為是最經(jīng)濟有效和無污染的方法[23]。Thies等[24]及王維華等[25]的研究表明，輪作抗根結線蟲的辣椒品種在抑制南方根結線蟲的生長和繁殖方面起到積極作用，可減輕黃瓜、西瓜和葫蘆等葫蘆科作物根結線蟲病的危害。鑒于絞股藍根結線蟲病的嚴重危害性，在未來的生產(chǎn)中，對于絞股藍根結線蟲的防控更要注重高效無公害和可持續(xù)。因此，今后可從選育抗病品種、控制連作次數(shù)及輪作抗根結線蟲的品種如辣椒等方面重點開展相關研究工作。

本研究對絞股藍根結線蟲病發(fā)生癥狀的詳細闡述，對絞股藍根結線蟲病的識別與診斷有一定的參考價值，在生產(chǎn)實踐中有重要的指導意義。同時首次確認了陜西省安康地區(qū)絞股藍的病原根結線蟲為南方根結線蟲，為絞股藍根結線蟲病的進一步研究與綜合防治技術體系建立提供一定的理論依據(jù)，從而保障安康絞股藍產(chǎn)業(yè)的健康高效發(fā)展。