氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測酒醅中氨基甲酸乙酯的方法研究

常瑞紅，刁亞琴，郭亞飛，謝 旭，洪 勝，姜 勇，徐 麗

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800）

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)，又稱尿烷，易溶于水及醇類溶劑中，是食品發(fā)酵及貯藏過程中產(chǎn)生的一種可導致皮膚癌、肺癌、淋巴癌等疾病的內(nèi)源性2A類致癌污染物，廣泛存在于酒類、面包、乳酪、醬油等發(fā)酵食品中。白酒作為中國特有的發(fā)酵食品，深受大眾喜愛，EC 在各種香型白酒中普遍存在且含量相對較大，對消費者健康有潛在危害，因此白酒中EC 的安全風險成為行業(yè)關注的熱點問題。目前，國內(nèi)外針對白酒EC相關研究主要集中在酒中EC分析和相關控制技術方面，對白酒發(fā)酵相關的固態(tài)酒醅檢測方法研究相對較少，為深入探究EC形成機理及白酒中EC有效控制技術，研究酒醅中EC有效檢測方法具有重大意義。

目前，HPLC 法、GC 法、GC-MS 法等是常用的EC 檢測方法。由于酒醅基質(zhì)復雜，前處理技術是影響檢測方法的關鍵因素，國內(nèi)研究學者常采用溶劑（乙醚或水）萃取后離心過硅藻土小柱凈化，再經(jīng)有機溶劑清洗、洗脫、氮吹濃縮等步驟。整個前處理過程步驟繁瑣，操作不便，污染環(huán)境，不適宜生產(chǎn)企業(yè)大批量檢測應用。

本研究以乙醇溶液為萃取劑，經(jīng)活性炭凈化后直接進樣的方式建立酒醅中EC 檢測方法，重點考察萃取溶劑乙醇濃度（V/V）、方法線性等，旨在建立一種準確快速、操作簡便且適宜企業(yè)生產(chǎn)的酒醅檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒醅試樣：江蘇洋河酒廠股份有限公司出池酒醅。

試劑：氨基甲酸乙酯標準品（純度大于99.0 %）、氘代氨基甲酸乙酯標準品（純度大于98.0 %），上海安譜科技有限公司；活性炭，重慶霏洋環(huán)保科技股份有限公司；乙醇（色譜級），德國默克公司；一級水，實驗室制備。

儀器設備：7890A-5975C 氣相色譜儀-質(zhì)譜儀（帶EI 源），美國安捷倫；電子天平（萬分之一），梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

內(nèi)標儲備液（1.00 mg/mL）：準確稱取0.01 g（精確到0.0001 g）氘代氨基甲酸乙酯標準品，無水乙醇溶解、定容至10 mL。

內(nèi)標使用液（20.00 μg/mL）：準確吸取氘代氨基甲酸乙酯儲備液1.0 mL，無水乙醇定容至50 mL。

氨基甲酸乙酯儲備液（1.00 mg/mL）：準確稱取0.01 g（精確到0.0001 g）氨基甲酸乙酯標準品，無水乙醇溶解、定容至10 mL。

標準曲線工作溶液：用無水乙醇分別配制10.0 μg/mL 和0.50 μg/mL 氨基甲酸乙酯中間液，分別取0.50 μg/mL 氨基甲酸乙酯中間液100.0 μL、250.0 μL、500.0 μL、1.0 mL、2.0 mL 和10.0 μg/mL氨基甲酸乙酯標準中間液200.0 μL、400.0 μL 于5 mL 容量瓶中，無水乙醇定容至刻度，再各加20.0 μg/mL 內(nèi)標使用液50 μL，得到10.0 μg/L、25.0 μg/L、50.0 μg/L、100μg/L、200 μg/L、400 μg/L、800 μg/L的標準曲線工作溶液。

1.2.2 儀器條件

氣相色譜條件：DB-INNOWAX 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。進樣口溫度：230 ℃。升溫程序：初始柱溫70 ℃，保持l min，以6 ℃/min升溫至180 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升溫至240 ℃，保持2 min。載氣：氦氣（純度＞99.999%），流速：l mL/min。

進樣方式：不分流進樣。進樣量：1μL。

質(zhì)譜條件：電離方式：電子轟擊電離源(EI)。電離能量：70 eV。傳輸線溫度：280 ℃。

離子源溫度：230 ℃。四級桿溫度：150 ℃。溶劑延遲：8 min。

1.2.3 樣品處理

準確稱取出池酒醅樣品3.000 g(精確至0.001 g)于50 mL 離心管中，加入15 mL 的60%（V/V）乙醇溶液，超聲波振蕩儀浸提60 min，將浸提液離心，在4 ℃下，以10000 r/min 離心15 min，取上清液10 mL至25 mL 離心管中，加入0.3 g (3 % W/V)活性炭，超聲波振蕩儀超聲30 min，按上述離心條件離心，取5 mL 上清液至比色管中，加入50 μL 內(nèi)標使用液，混勻過0.22 μm濾膜，GC-MS分析檢測。

1.2.4 結果計算

不同濃度混合標準工作溶液分別重復進樣3次，利用色譜工作站對3 次進樣EC/D5-EC 濃度比和響應比建立標準曲線，測定結果保留兩位小數(shù)。

式中：X——樣品中EC含量，μg/kg；

c——測定液中EC含量，μg/L；

3——樣品萃取液稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g；

1000——換算系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度的優(yōu)化

EC 易溶于乙醇、水、甲醇、乙醚等極性溶劑，在萃取食品中EC 時，常用溶劑為乙醚、水等，乙醚毒性大，沸點低且易燃易爆，實驗步驟繁瑣；水是EC的良好溶劑，直接進GC-MS 分析EC，含水量大的試劑會嚴重影響柱效。有研究表明隨著乙醇濃度的升高EC 的響應值升高，由于EC 響應值足夠大，乙醇含量的影響亦可以忽略。王莉等在專利中采用了40%乙醇萃取-衍生-液相色譜分析以測定酒醅中氨基甲酸乙酯。故采用乙醇溶液作為萃取試劑。

由圖1 可知，不同濃度乙醇（V/V）對酒醅中EC萃取效果的影響顯著，純水萃取條件下，氨基甲酸乙酯檢出值較低，0 %（V/V）～60 %（V/V）乙醇濃度呈上升趨勢，60 %～100 %變化不顯著，雖然氨基甲酸乙酯在水中溶解度較好，但是采用直接進樣方式時，在GC-MS 中響應較低，乙醇在60 %處有較好的響應值，故采用60 %（V/V）乙醇作為萃取濃度。

圖1 不同乙醇濃度對EC萃取效果的影響

2.2 活性炭凈化用量的優(yōu)化

活性炭具有發(fā)達的孔結構，比表面積較大，可吸附酒中的高級脂肪酸酯、雜質(zhì)及降低雜味。酒醅經(jīng)過乙醇溶液萃取后，顏色較深，活性炭可利用多孔固體表面吸附色素、雜質(zhì)等，起到凈化的作用，減少對GC-MS 進樣口襯管污染，保證檢測結果穩(wěn)定性。

由表1 可知，添加活性炭和未添加，檢出的EC值無顯著差異，不同添加量對EC 的檢出結果影響不大，表明活性炭對EC 沒有顯著吸附作用；酒醅未經(jīng)活性炭處理或添加量少，都會因萃取液雜質(zhì)多，凈化不充分，導致經(jīng)常更換襯管使檢測成本增加，同時導致檢測重復性差結果不準，添加過量的活性炭，離心后取樣時活性炭粉末蕩起，上清液移取不便。綜上，添加3.0%(W/V)的活性炭作為凈化最適用量。

表1 不同活性炭用量對EC檢測的影響

2.3 方法線性、檢出限及定量限

在10～800 μg/L EC 線性范圍內(nèi)分析，得到以EC濃度為X坐標，以EC和D5-EC峰面積比為Y坐標擬合標準曲線，見圖2，回歸方程為Y=0.8023X+0.09613，相關系數(shù)為R=1，表明標準曲線的線性良好。

圖2 EC的標準曲線

以響應值的標準偏差法確定EC 的檢出限和定量限，分別用測定結果3δ/S 和10δ/S 計算檢出限和定量限，其中δ為標準偏差，S 為斜率。向空白樣品中加標樣，配置低濃度的10 μg/L 加標樣品進樣測試11 次，計算標準偏差，得到該分析方法的檢出限為2.8 μg/kg，定量限為9.2 μg/kg。

2.4 方法的精密度和回收率

隨機取兩種不同酒醅試樣，對處理樣用10.0 μg/mL EC 標樣進行3 水平添加，加標水平為20 μg/L、100 μg/L、400 μg/L，每個添加樣品重復測定6 次，通過定量結果計算該方法的加標回收率和RSD，結果見表2。

由表2 可知，EC 的RSD 在1.74 %～6.17 %之間，說明方法的重現(xiàn)性和精密度良好；加標回收率范圍在88.53 %～117.25 %之間，說明檢測結果準確度良好，方法準確可靠。

表2 酒醅試樣的相對標準偏差和回收率

2.5 實際樣品的測定

選取不同車間小組酒醅試樣采用本實驗方法進行檢測分析，每個試樣重復檢測6 次，結果見表3，在檢酒醅EC 檢測范圍為46.26～87.96 μg/kg，測定結果的RSD在1.40%～5.44%之間。

表3 不同車間小組酒醅中EC含量（n=6）

3 結論

本研究建立了乙醇溶劑萃取結合GC-MS 直接進樣檢測酒醅中EC 的測定方法。結果表明，60%（v/v）乙醇溶液萃取，3.0%(W/V)活性炭凈化前處理效果良好，標準曲線相關系數(shù)為1，檢出限為2.8 μg/kg，定量限為9.2 μg/kg，加標回收率在88.53%～117.25%之間，說明方法準確可靠。該方法具有樣品前處理簡便、綠色、快速等優(yōu)點，適用于大批量酒醅EC 的檢測，能夠滿足白酒生產(chǎn)企業(yè)對酒醅EC風險監(jiān)控的需求。