云煙凈油的制備及主要成分

許克靜，蔡莉莉，席高磊，王清福，王二彬，趙學(xué)斌，項 攀，劉前進，陳芝飛

河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)開區(qū)第三街8號 450000

煙草凈油是一種從煙草中提取并通過脫色、脫蠟等工藝處理后得到的煙草提取物［1-3］，具有多種揮發(fā)性和半揮發(fā)性致香成分，對卷煙感官品質(zhì)和風(fēng)格特征有顯著影響。常見的煙草凈油提取方式有溶劑萃?。?-5］、水蒸氣蒸餾［6-8］、同時蒸餾萃?。?］、超臨界CO2萃?。?0-12］、分子蒸餾［13-15］、微波輔助提?。?6］等。其中，超臨界CO2萃取技術(shù)是一種安全高效的提取技術(shù)［11-12］，被廣泛應(yīng)用于煙草提取物的制備以及茄尼醇、煙堿等功能性成分的提?。?0］。由于超臨界CO2萃取技術(shù)對弱極性成分不具有選擇性，造成煙草超臨界提取物成分復(fù)雜，含有大量不良風(fēng)味的化學(xué)成分。要制備作用效果顯著的超臨界煙草凈油，則需要進一步脫除不良風(fēng)味成分。然而，目前超臨界CO2萃取煙草提取物的研究主要集中在萃取溫度、壓力和時間的工藝優(yōu)化方面［12］，鮮有對煙草超臨界提取物的后續(xù)精制研究的報道。

煙草蠟質(zhì)作為煙草超臨界提取物中的一類重要成分，主要是指煙草中C18～C34之間的正構(gòu)或異構(gòu)高級烷烴，主要集中在煙葉表面，作為植物葉片的表面屏障，可減弱紫外線對植物的損害、防止自由水的損失［17-19］。劉菲等［17］采用超聲輔助萃取技術(shù)對云煙87品種煙葉中的高級烷烴進行提取分析，發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)最高可達1 614.5μg/g，其中，在C25～C35之間的烷烴占烷烴總量的99%。目前，有關(guān)煙草蠟質(zhì)的研究主要集中在煙葉烷烴成分分析［17-19］、煙絲保潤性［20］及煙草保水性［21］等方面，而有關(guān)蠟質(zhì)成分對卷煙風(fēng)味特征影響的研究較少。因此，本研究中以云南清香型煙葉模塊碎片為原料，通過超臨界CO2提取、乙醇脫蠟和冷凍離心等工藝，制得云煙超臨界提取凈油及其蠟質(zhì)脫除物；通過GC-MS分析和感官質(zhì)量評價，確定各組分的化學(xué)組成及感官作用，旨在為煙草超臨界提取物的精制化研究及煙草特征成分分析提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

云南清香型煙葉模塊在打葉復(fù)烤環(huán)節(jié)產(chǎn)生的煙葉碎片［昆明DCJ59sp，其葉組信息為昆明C1F（12.50%）、文山C1F（8.33%）、紅河C1F（5.56%）、昆明C2F（37.50%）、昆明C3F（5.56%）、大理C2F（8.33%）、麒麟C2F（2.78%）、麒麟C3F（8.33%）、紅河C2F（11.11%）］由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

95%乙醇（AR）、乙酸苯乙酯（色譜純）（阿拉丁生化科技股份有限公司）；水楊酸乙酯（色譜純）、二氯甲烷（AR）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

HA220-40-15型超臨界CO2萃取裝置（南通市華安超臨界萃取有限公司）；7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Büchi公司）；GL-10MD冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；BW200S電子天平（感量0.000 1 g，北京賽多利斯公司）；BL-3000型臺式中藥材粉碎機（浙江省臺州巴菱電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

稱取一定量的煙葉碎片置于粉碎機料斗中，選擇孔徑為0.9 mm（20目）的篩網(wǎng)用于控制粉碎粒徑，收集篩分后的粉末并置于密封袋中常溫保存。

1.2.2 超臨界CO2提取

稱取1.0 kg煙葉粉末置于5 L萃取釜中，密閉萃取釜后設(shè)置超臨界提取參數(shù)：超臨界提取壓力30 MPa，提取溫度40℃，CO2提取流量35～40 L/h；分離釜Ⅰ壓力8 MPa，分離溫度40℃；分離釜Ⅱ壓力4 MPa，分離溫度45℃；提取時間2 h。提取結(jié)束后，打開分離釜出料口，收集萃取物；室溫靜置分層，除去水層后得超臨界提取物（記為YS0），提取率為3.15%。

1.2.3 醇提脫蠟

超臨界提取物的制備及脫蠟工藝流程見圖1。準確稱取500.0 g YS0，置于10 L圓底燒瓶中，再加入10倍質(zhì)量的95%乙醇使其溶解；然后將圓底燒瓶置于80℃水浴中，加熱攪拌10 min后，體系分為上下兩層。將分離后的上層乙醇溶液冷卻至室溫，－5℃冷凍離心分離得到123.0 g固體析出物（W1，得率24.6%）和濾液，濾液經(jīng)濃縮后得278.0 g脫蠟產(chǎn)物（YS1，得率55.6%）；將下層非醇溶性液體冷卻至室溫后得到99.0 g蠟質(zhì)（W2，得率19.8%）。

圖1 云南煙葉超臨界提取物制備及脫蠟工藝流程Fig.1 Preparation and dewaxing process of supercritical extract of Yunnan tobacco

1.2.4 GC-MS分析方法

采用GC-MS法對超臨界提取物和醇提脫蠟產(chǎn)物進行定性分析。

準確稱取0.50 g待分析樣品于容量瓶中，然后加入5 mL內(nèi)標溶液，超聲5 min以使樣品完全溶解；然后取1 mL溶液加入色譜瓶中。其中，內(nèi)標物為水楊酸乙酯，溶劑為二氯甲烷，內(nèi)標溶液濃度為3.131 6 g/L。采用NIST14數(shù)據(jù)庫對色譜圖進行檢索定性（匹配度≥90%），以面積歸一化法定量。GC-MS分析條件：

色譜柱：HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25μm）毛細管柱；進樣口溫度：310℃；載氣：He，1 mL/min；進樣量：1μL；分流比：15∶1；程序升溫：50℃（4 min）；溶劑延遲：5 min。電離方式：電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度：230℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280℃；四極桿溫度：150℃；隔墊吹掃流量：3 mL/min；掃描方式：全離子掃描（Scan）模式；質(zhì)量掃描范圍：33～550 amu。

1.2.5 超臨界提取率和蠟質(zhì)脫除率的計算方法

按照公式（1）計算超臨界提取物的提取率（%）：

式中：m1為超臨界提取物的質(zhì)量，g；m0為煙末投料質(zhì)量，g。

按照公式（2）計算蠟質(zhì)脫除率：

式中：Ai為扣除溶劑峰后蠟質(zhì)的峰面積；n為組分的數(shù)量；As為扣除內(nèi)標的譜圖峰面積。

1.2.6 感官評價

依據(jù)YC/T 138—1998［22］的方法，將制備的樣品按0.02 mg/g的加香量施加于煙絲上，經(jīng)平衡水分等相應(yīng)處理后，由卷煙感官評價專家小組（9人）進行評吸，對香氣質(zhì)、香氣量、透發(fā)性、雜氣、濃度、勁頭、細膩程度、成團性、刺激性、干燥感、干凈程度、回甜等12個指標分別評分（各項指標分值越高越好），取9位評委對單項指標評分的平均值作為該項指標的得分。

2 結(jié)果與討論

2.1 醇提脫蠟工藝結(jié)果分析

根據(jù)超臨界提取浸膏中的致香成分與高級烷烴在溶劑中的溶解性差異，采用溶劑脫蠟法實現(xiàn)蠟質(zhì)的脫除。本研究中以95%乙醇作為脫蠟溶劑，用10倍質(zhì)量的95%乙醇加熱萃取出浸膏中的致香成分。由于蠟質(zhì)在乙醇中溶解度較低，加熱條件下出現(xiàn)一部分溶于乙醇（上層）和一部分密度大于乙醇的熔融物（下層）。將上、下兩層分離后冷卻至室溫，下層直接凝固得到一種蠟質(zhì)脫除物，上層經(jīng)冷凍離心后得到另一種蠟質(zhì)脫除物。兩種蠟質(zhì)成分相對質(zhì)量百分數(shù)分別為19.8%和24.6%，其總和占超臨界提取浸膏總量的44.4%?？梢?，直接通過超臨界提取技術(shù)所得超臨界提取浸膏中蠟質(zhì)的質(zhì)量百分數(shù)較高。通過脫蠟處理，可有效降低超臨界提取物中的蠟質(zhì)成分。

2.2 超臨界提取物各組分的GC-MS分析

為了進一步明確脫蠟工藝的脫蠟效果，通過GC-MS分析確定超臨界提取物各組分的化學(xué)成分。

YS0的GC-MS分析結(jié)果如圖2、表1和表2所示。由圖2可知，超臨界提取浸膏中化學(xué)成分復(fù)雜，出峰保留時間主要集中在30～55 min之間。共鑒定出56種化合物（表1和表2），主要包括生物堿類（4種）、醇類（10種）、烴類（13種）、酸類（9種）、酮類（12種）、酯類（3種）、酚類（3種）、吡啶類（1種）、吡喃類（1種）。關(guān)鍵致香成分主要有煙堿、巨豆三烯酮、二氫大馬酮衍生物、吡喃酮、新植二烯、西柏三烯二醇等，共占揮發(fā)性致香成分出峰面積的72%（相對質(zhì)量分數(shù)達157.69 mg/g）。其中，煙堿質(zhì)量分數(shù)較高，峰面積所占比例達49.55%（相對質(zhì)量分數(shù)達98.15 mg/g）。雖然煙堿是煙草提取物中的關(guān)鍵成分，但高質(zhì)量分數(shù)的煙堿會引起卷煙勁頭增大、舒適性降低。由表1可以看出，YS0中主要含有C19～C32的12種蠟質(zhì)烷烴。煙草提取物中的蠟質(zhì)往往對卷煙煙氣產(chǎn)生一定的負面作用，比如煙氣粗糙感增加、口腔殘留明顯等。值得注意的是，雖然在GC-MS分析時蠟質(zhì)成分的出峰面積僅占所有揮發(fā)性致香成分面積的5.15%，但在脫蠟工藝中蠟質(zhì)的質(zhì)量所占比例卻達到44.4%。說明蠟質(zhì)成分在GC-MS分析中的響應(yīng)強度較低，易被其他揮發(fā)性成分掩蓋，這可能就是煙草超臨界提取物中蠟質(zhì)往往被忽視的重要原因。

表2 云煙超臨界提取物各組分GC-MS匹配的非蠟質(zhì)成分及相對質(zhì)量分數(shù)Tab.2 Non-waxy components and their relative mass fractions of each component of Yunnan tobacco supercritical extracts matched by GC-MS

圖2 云煙超臨界提取浸膏（YS0）的總離子流圖Fig.2 Total ions current chromatogram of supercritical extract of Yunnan tobacco（YS0）

由圖3、圖4和表1可知，云煙超臨界提取浸膏通過乙醇脫蠟工藝后，主要得到C25～C33的21種蠟質(zhì)烷烴。其中，正構(gòu)烷烴9種（分別是C25～C33的直鏈正構(gòu)烷烴），支鏈烷烴12種（主要為2-位和3-位甲基取代的C27～C33支鏈烷烴）。除9-辛基二十烷僅在W1中檢出外，其他蠟質(zhì)烷烴均在W2中檢出。說明支鏈化程度高的蠟質(zhì)烷烴較支鏈化程度低的在乙醇中的溶解度更大。另外，3-甲基二十七烷、二十八烷、2-甲基二十九烷、2-甲基三十一烷、3-甲基三十二烷和3-甲基三十三烷6種蠟質(zhì)烷烴僅在W2中檢出，說明該6種烷烴在乙醇中的溶解性較其他烷烴低。值得注意的是，十九烷和二十烷僅在YS0和YS1中檢出，而在W1和W2中未檢測到。這可能是由于C20及以下的正構(gòu)烷烴在乙醇中的溶解性良好，通過在乙醇中的溶解性差異不能很好地脫除低分子量的蠟質(zhì)。從結(jié)構(gòu)特征上可以看出，煙草在代謝過程中，支鏈烷烴一般以2-位或3-位甲基形式出現(xiàn)，且較少出現(xiàn)更為復(fù)雜的支鏈烷烴［23］。

圖3 云煙超臨界提取浸膏的蠟質(zhì)脫出物（W1）的總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of wax components（W1）in Yunnan tobacco supercritical extract

圖4 云煙超臨界提取浸膏的蠟質(zhì)脫出物（W2）的總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatogram of wax components（W2）in Yunnan tobacco supercritical extract

表1 云煙超臨界提取物各組分的蠟質(zhì)成分及相對質(zhì)量分數(shù)Tab.1 Waxy chemical components and their relative contents in supercritical extract of Yunnan tobacco

表2（續(xù)）

YS0的脫蠟產(chǎn)物（YS1）的GC-MS分析結(jié)果如圖5和表2所示?？芍?，將蠟質(zhì)成分脫除后，揮發(fā)性致香成分進一步富集，GC-MS共鑒定出61種化合物，主要包括生物堿類（3種）、醇類（19種）、烴類（5種）、酸類（11種）、酮類（12種）、酯類（6種）、酚類（3種）、吡啶類（1種）和吡喃類（1種）等9類化合物。與YS0對比發(fā)現(xiàn)，YS1中醇類和烴類成分變化明顯，醇類成分多出9種，烴類成分減少8種。同時，除化學(xué)成分種類的變化外，各單組分的相對質(zhì)量分數(shù)也變化顯著。其中，相對質(zhì)量分數(shù)均有所增加的達55種；典型致香成分如巨豆三烯酮、西柏三烯類化合物、莨菪亭、植醇等增加明顯；脂肪酸的相對質(zhì)量分數(shù)變化也十分顯著，十四酸、十五酸、十六酸、十七酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸和二十酸的總量由14.4 mg/g增加至203.18 mg/g；天然維生素E（生育酚A、生育酚B和生育酚C）的相對質(zhì)量分數(shù)則由9.31 mg/g顯著增加至107.12 mg/g。值得注意的是，煙堿在YS0和YS1中的相對質(zhì)量分數(shù)變化并不顯著，但煙堿在總揮發(fā)性成分中的相對比例則由49.55%降低至13.07%。說明乙醇脫蠟工藝具有一定的煙堿脫除作用，同時對其他揮發(fā)性成分的富集作用明顯。另外，通過對比蠟質(zhì)成分質(zhì)量分數(shù)發(fā)現(xiàn)，YS1中僅保留十九烷和二十烷兩種烷烴，而其余21種高級烷烴均被有效脫除，蠟質(zhì)成分的脫除率高達99.83%。說明乙醇溶劑具有很好的蠟質(zhì)脫除效果。

圖5 云煙超臨界提取凈油（YS1）的總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of essential oil（YS1）of Yunnan tobacco supercritical extract

另外，蠟質(zhì)等成分被脫除后，煙草凈油中的甾醇類化合物得到進一步富集，共鑒定出膽固醇、菜油甾醇、豆甾醇、γ-谷甾醇、（3β，24Z）-豆甾-5，24（28）-二烯-3-醇、β-香樹脂醇和環(huán)阿屯醇等7種甾醇類化合物。這些化合物中，除膽固醇、菜油甾醇、豆甾醇和γ-谷甾醇有文獻報道［24-25］外，其他甾醇化合物在煙草提取物成分分析中鮮有報道。研究表明，煙草中的甾醇在高溫裂解時可產(chǎn)生苯并芘等致癌類稠環(huán)芳烴［24-26］，掌握煙草中甾醇的種類和質(zhì)量分數(shù)對卷煙“減害增香”具有重要的研究意義。

2.3 云煙超臨界提取物各組分在卷煙中的感官作用評價

云煙超臨界提取物各組分在卷煙中的感官作用評價結(jié)果如表3所示。可知，相比于空白卷煙，YS0在提升香氣質(zhì)和香氣量方面效果顯著，同時煙氣濃度、回甜、透發(fā)性、成團性增加，刺激性降低；能增強云南煙草特征香氣，清甜感顯著，煙氣爆發(fā)力增強。但口感特征上有一定的殘留，舌面顆粒感明顯。W1和W2的感官質(zhì)量則明顯變差，主要表現(xiàn)為煙氣粗糙、口腔殘留明顯，有明顯的蠟質(zhì)感，香氣質(zhì)、香氣量降低，刺激性增加。通過GC-MS分析可知，W1和W2主要含有C25～C33的蠟質(zhì)成分，而在YS0中除含有一定量的煙草特征致香成分外，仍含有45%左右的蠟質(zhì)成分。因此，在口感特征上均表現(xiàn)出一定的蠟質(zhì)感。

表3 云煙超臨界提取物各組分的卷煙感官質(zhì)量評價結(jié)果Tab.3 Evaluation sensory quality of components in Yunnan tobacco supercritical extract added to cigarette

相比于空白卷煙和YS0，脫蠟后所得凈油（YS1）在香氣特征、煙氣特征和口感特征上改善顯著，主要表現(xiàn)為香氣質(zhì)和香氣量較空白增加顯著，同時比YS0也有顯著改善；煙氣濃度增加，細膩程度和成團性也顯著改善；口感特征表現(xiàn)為刺激性降低、回甜感增加顯著，同時口腔殘留明顯減小，無明顯蠟質(zhì)感。相較于W1和W2的副作用，YS1的正向作用明顯，有效改善了卷煙的口感特征。

綜合YS0、W1、W2和YS1的感官對比評價結(jié)果，YS1的作用效果最好，YS0次之，而W1和W2的作用效果則較差，說明超臨界提取物中的蠟質(zhì)對卷煙感官質(zhì)量存在顯著副作用。通過脫蠟工藝除去云煙超臨界提取浸膏中的蠟質(zhì)成分可有效改善浸膏的卷煙感官作用效果，降低對感官質(zhì)量的不利影響，提升卷煙品質(zhì)。

3 結(jié)論

①通過煙草超臨界提取物脫蠟方法，21種C25～C33的蠟質(zhì)烷烴得到有效脫除，蠟質(zhì)脫除率高達99.83%，煙草凈油中揮發(fā)性致香成分、煙草甾醇和天然維生素E得到有效富集。②同時發(fā)現(xiàn)（3β，24Z）-豆甾-5，24（28）-二烯-3-醇、β-香樹脂醇和環(huán)阿屯醇等3種新型煙草甾醇。③感官評價結(jié)果表明，煙草超臨界提取物脫蠟后可有效改善卷煙感官作用效果，降低對口感的不利影響，提升卷煙品質(zhì)。