枯草芽孢桿菌分離鑒定及其對煙葉化學(xué)成分和吸味品質(zhì)的影響

毛多斌，黃曉玉，周利峰，劉 強，陳芝飛，馮穎杰，黃 申，張俊嶺*

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136號 450001 2.河南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)第三大街8號 450002 3.山西昆明煙草有限責任公司，太原市小店區(qū)大昌南路21號 030000

芽孢桿菌屬（Bacillus）是土壤和植物生態(tài)環(huán)境的優(yōu)勢菌屬之一，具有生長快、抗逆性強以及生物安全性高等特點［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，多種芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物能夠釋放揮發(fā)性物質(zhì)，并對植物病原菌具有抑制作用［3-4］。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），是芽孢桿菌屬的一種，因生物安全性高、無致病性以及具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶等特性，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究［5］、醫(yī)藥生產(chǎn)、植物抗病［6］及畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域中。

在煙葉陳化進程中芽孢桿菌屬（Bacillus）多為煙葉表面優(yōu)勢菌屬［7-9］，用該類微生物發(fā)酵烤煙［10］、雪茄煙［11］以及煙草浸提液［12］后，香氣量和吸食品質(zhì)都有明顯提高。梁開朝等［13］篩選到一株蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus），用其發(fā)酵煙草浸提液5 d后，煙葉中2,3-丁二醇、苯乙酮以及乙酸丁酯等香氣成分增加。呂欣等［14-15］篩選到包括芽孢桿菌（Bacillus sp.）在內(nèi)的多株微生物，發(fā)酵55 g煙葉48 h后，煙葉感官品質(zhì)明顯提升。瞿嬌嬌等［16］從豆豉中分離出枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），發(fā)酵煙葉15 d后，可減少雜氣、降低刺激性。王芳等［17］從茅臺酒致香微生物中篩選出枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），發(fā)酵中、下部煙葉各1 kg，發(fā)酵20～25 d后增香效果明顯。陳興等［18］通過嗅香及感官評吸，從煙葉表面分離得到一株產(chǎn)香西姆芽孢桿菌（Bacillussiamensis），發(fā)酵煙葉48 h能有效改善煙葉的吸味品質(zhì)。然而，利用上述芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物發(fā)酵煙葉存在發(fā)酵時間長、處理量小等問題，且其發(fā)酵機制尚未明確。為此，借助平板涂布法從初烤后煙葉表面分離篩選菌株，利用嗅香變化挑選出菌株H11，采用分子生物學(xué)方法對其進行鑒定，再將此菌株用于低等級煙葉的發(fā)酵處理，分析其對煙葉化學(xué)成分和吸味品質(zhì)的影響，旨在開發(fā)新菌株并縮短發(fā)酵時間，為微生物發(fā)酵低等級煙葉提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

供試煙葉產(chǎn)地為平頂山，采收年份為2017年，等級為DCFB，由河南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心提供。

Taq酶、DNA Marker DL10000購自日本Takara公司；DNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自北京麥克羅科技有限公司；瓊脂粉、酵母粉和蛋白胨購自英國Oxoid公司；氯化鈉和無水乙醇等常規(guī)分析純試劑購自上海麥克林生化科技有限公司。

每升液體LB培養(yǎng)基含酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g；固體LB培養(yǎng)基含酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g；再造煙葉濃縮液培養(yǎng)基含再造煙葉濃縮液200 mL。上述3種培養(yǎng)基經(jīng)121℃高壓滅菌25 min后用于菌種培養(yǎng)和發(fā)酵。

恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162（太倉市科教器械廠）；恒溫搖床TH2-C（太倉市試驗設(shè)備廠）；GC-MS色譜聯(lián)用儀6890a（美國Agilent公司）；連續(xù)流動分析儀AA3（德國SEAL公司）；PCR儀2720 thermal cycler（美國Applied Biosystems公司）；顯微鏡DM6B（德國徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

采集河南省三門峽市陜州區(qū)煙葉種植基地不同品種的初烤后煙葉樣品30個，各取5 g煙葉，加入100 mL無菌水，在30℃、150 r/min條件下震蕩培養(yǎng)2～4 h，將其按照體積分數(shù)1%接種至液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h。將得到的富集菌液按照6個稀釋梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6）稀釋后分別涂布到固體LB培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2 d。從平板上挑選單菌落，采用平板劃線法獲得純菌。將分離到的微生物接種至再造煙葉濃縮液培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，利用嗅香變化篩選菌株。

1.2.2 菌種鑒定

用細菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以該基因組DNA為模板，利用通用引物27-F/1492-R和gyrB-34-F/gyrB-977-R分別對16S rDNA基因和gyrB基因進行PCR擴增。隨后將PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，將陽性克隆送生工生物工程（上海）有限公司測序。將測序得到的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，使用NCBIBlast在線工具與數(shù)據(jù)庫中已有的細菌16SrDNA序列以及gyrB序列進行比對分析，獲得相似性較高的序列信息，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹，最終明確篩選微生物的分類地位。

1.2.3 煙葉發(fā)酵處理

經(jīng)篩選鑒定的菌株在液體LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，當OD600nm為0.8～1.2時將菌液于4℃、10 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，用等量無菌水重懸，獲得種子液。按照接種量6.3×107CFU/g將3 L種子液均勻噴灑到20 kg煙葉表面，裝于密封袋，放置于溫度為35℃濕度80%的恒溫恒濕房中發(fā)酵30 h。不做任何處理的煙葉為CK 1，加等量無菌水相同條件處理的煙葉為CK 2。

1.2.4 感官評價

樣品和對照煙葉的切絲、烘絲在鄭州煙草研究院中試車間進行，單料煙樣品在河南中煙駐馬店卷煙廠制作。由河南中煙技術(shù)中心13名專業(yè)評吸人員組成評吸小組，采用對比評吸方式和九分制單料煙評吸標準進行感官評價［18］。

1.2.5 煙葉常規(guī)成分測定

參照YC/T 160—2002［19］、YC/T 161—2002［20］、YC/T 159—2002［21］、YC/T 217—2007［22］以及YC/T 162—2011［23］的標準，用連續(xù)流動分析儀分別測定發(fā)酵前后煙葉中的化學(xué)成分（煙堿、總氮、水溶性總糖、還原糖、鉀和氯）。每個待測樣品各指標測定3次，取平均值。

1.2.6 煙葉中性香味成分測定

采用同時蒸餾萃取法分離中性香味成分。稱取煙葉粉末30 g放入1 000 mL的圓底燒瓶中，加入4粒沸石和400 mL去離子水，將100 mL的二氯甲烷倒入圓底燒瓶中。同時蒸餾萃取2.5 h后，將得到的萃取液進行酸堿萃取，得到中性萃取液后，加入適量的無水硫酸鈉進行干燥過夜，再加入100μL 2,6-二氯甲苯作為內(nèi)標，蒸餾濃縮至1 mL，進行GC/MS檢測分析。分析條件為：色譜柱：HP-5MS毛細管柱（60 m×250μm×0.25μm）；進樣口溫度：240℃；進樣量1.0μL；載氣：He；流速：1.0 mL/min；分流比：不分流；升溫程序：50℃下保持4 min，3℃/min升至70℃并保持5 min，2℃/min升至100℃并保持17 min后，繼續(xù)升溫至120℃保持10 min，再以6℃/min升至280℃。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊（EI），電子能量70 eV；溶劑延遲10 min；全掃描檢測，掃描質(zhì)量范圍（m/z）35～500 amu。煙葉中性香味成分的GC檢測結(jié)果利用NIST20標準譜庫進行檢索，結(jié)合標準樣品的GC保留時間和煙草中化學(xué)成分進行定性分析。對有標準樣品的香味成分采用GC內(nèi)標工作曲線法定量，沒有標準樣品的香味成分采用峰面積相對定量法（化合物峰與內(nèi)標峰面積之比）定量。

1.2.7 菌株基因組測定及分析

將篩選得到的菌株從-80℃冰箱中取出進行活化，將活化好的菌液離心，棄去上清液，保留沉淀。PCR引物合成和DNA測序均由生工生物工程（上海）有限公司完成。使用HiSeq測序儀（美國Illumina公司）進行測序。為了校正原始數(shù)據(jù)中序列，首先用SPAdes軟件對原始序列進行校正，然后綜合Kmer值，填補拼接后重疊群并對其矯正。采用Blast算法比較兩段核酸或者蛋白序列之間的相似性。將蛋白序列與CAZy數(shù)據(jù)庫進行比較。

1.2.8 煙葉表面微生物宏基因組測定及分析

將用到的量筒、紗布、三角瓶和剪刀等器材全部進行高溫滅菌處理（121℃，20 min）。稱取樣品煙葉和對照煙葉各40 g剪碎后置于500 mL的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.1 M、pH 7.0）中，在37℃、200 r/min的搖床上震蕩30 min。震蕩結(jié)束后，在超凈工作臺中將震蕩后的PBS溶液用雙層紗布過濾，重復(fù)兩次，去除PBS中的雜質(zhì)。將過濾后的PBS溶液在4℃、10 000 r/min的條件下離心10 min，將微生物富集到離心管底部，棄去上清，沉淀置于-80℃低溫冷凍保存。

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］對其沉淀微生物進行DNA提取。以提取的總DNA為模板，利用通用引物27-F/765-R對DNA的V區(qū)進行PCR擴增。PCR的最終產(chǎn)物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測。并用熒光試劑對PCR擴增回收產(chǎn)物進行定量分析。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需要，對各樣本按相應(yīng)比例進行混合。使用MiSeq測序儀（美國Illumina公司）進行雙端測序。測序完成后進行數(shù)據(jù)分析，首先獲得拼接成的Tags數(shù)據(jù)，將拼接的Tags經(jīng)過優(yōu)化后，在97%相似度下將序列聚類為操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的篩選

共從初烤后煙葉中分離篩選出16株菌株，編號分別為H1、H2、H3～H16，分別接種至再造煙葉濃縮液培養(yǎng)基中，在28℃，150 r/min條件下培養(yǎng)24 h，根據(jù)發(fā)酵前后嗅香變化，發(fā)現(xiàn)菌株H11嗅香變化明顯，因此選定H11為煙草發(fā)酵候選菌株。

2.1.2 菌株的鑒定

2.1.2.1 菌株的形態(tài)鑒定

將菌株H11接種至LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后（圖1A），菌落表面有光澤、邊緣整齊，染色后在普通光學(xué)顯微鏡（×100油鏡）下觀察，菌體呈絲狀，菌體長為2μm左右（圖1B），為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株H11菌落及細胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of strain H11

2.1.2.2 菌株H11的系統(tǒng)發(fā)育分析

擴增測序得到菌株H11的16SrDNA基因長度為1 427 bp，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫中同源分析后發(fā)現(xiàn)，菌株H11與枯草芽孢桿菌亞種（B.subtilis subsp.）的同源性在94%以上。下載相似度較高的相關(guān)菌株序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明，菌株H11與枯草芽孢桿菌亞種（B.subtilis subsp.）的多個已知菌株序列聚類為一個獨立分支，表明菌株H11屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

圖2 菌株H11 16Sr DNA區(qū)域序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S r DNA region sequence of strain H11

擴增測序獲得菌株H11的gyrB基因，長度為907 bp。將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源分析后發(fā)現(xiàn)，菌株H11與枯草芽孢桿菌枯草亞種（B.subtilis subsp.subtilis）的同源性為100%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后分析結(jié)果（圖3）表明，菌株H11與枯草芽孢桿菌枯草亞種（B.subtilis subsp.subtilis）聚為一個單獨分支，初步鑒定該菌株屬于枯草芽孢桿菌枯草亞種（B.subtilis subsp.subtilis）。

圖3 菌株H11基于gyr B基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain H11 based on gyr B gene sequence

2.2 發(fā)酵前后單料煙的評吸結(jié)果

發(fā)酵前后煙支感官評吸結(jié)果見表1。與對照相比，H11菌株發(fā)酵后香氣質(zhì)有所改善，甜感和香氣量得分都有所增加，刺激性明顯下降，勁頭有所減少，余味尚干凈。發(fā)酵后煙葉總體得分比CK 1高1.2分，比CK 2高1.4分，說明H11發(fā)酵后煙葉的整體品質(zhì)有所提升。

表1 感官質(zhì)量評吸結(jié)果Tab.1 Results of sensory quality assessment（分）

CK 2相比CK 1刺激性略大，整體評分少0.2分，可能是煙葉自身微生物作用的結(jié)果，因此后續(xù)實驗樣品不再與CK 2進行比較。

2.3 煙葉發(fā)酵前后理化指標變化

2.3.1 煙葉常規(guī)成分

發(fā)酵前后煙葉化學(xué)成分測定結(jié)果如表2所示。相比CK 1，經(jīng)H11菌株發(fā)酵后，煙葉常規(guī)化學(xué)成分中的水溶性總糖、還原糖含量（質(zhì)量分數(shù)）變化明顯，煙堿、總氮、鉀和氯的含量（質(zhì)量分數(shù)）變化不明顯。水溶性總糖增加可能是淀粉水解的結(jié)果所致。其中水溶性總糖含量和還原糖含量分別上升了2.52%和1.92%。還原糖含量的增加，使得H11菌株發(fā)酵后煙葉中的糖堿比增加，吸味品質(zhì)提升。水溶性總糖和還原糖含量增加可提升煙氣醇和度。

表2 H11發(fā)酵前后煙葉常規(guī)成分變化Tab.2 Variations of routine components in tobacco leaves from Pingdingshan before and after H11 fermentation（%）

2.3.2 煙葉中性香味成分

發(fā)酵前后煙葉的中性香味成分結(jié)果見表3，檢測到中性香味成分26種，其按官能團分類結(jié)果見圖4。

圖4 煙葉發(fā)酵前后香味成分含量變化Fig.4 Variations of aroma components in tobacco leaves before and after fermentation

表3 H11發(fā)酵對香味成分的影響Tab.3 Effects of H11 fermentation on aroma components

表3（續(xù)）

由表3可見，多種香味成分含量均有不同程度的提升。發(fā)酵前后茄酮含量分別為41.916 9μg/mL和45.739 2μg/mL，增加了9.12%；（E）-β-大馬酮含量分別為5.864 8μg/mL和7.385 1μg/mL，增加了25.92%；二氫獼猴桃內(nèi)酯含量分別為7.728 2μg/mL和8.544 9μg/mL，增加了10.57%；巨豆三烯酮C含量分別為13.056 5μg/mL和14.642 9μg/mL，增加了12.15%；法尼基丙酮含量分別為47.053 6μg/mL和53.785 2μg/mL，增加了14.31%。這些成分含量的增加提升了煙氣品質(zhì)，與感官評吸結(jié)果一致。

由圖4可見，發(fā)酵后煙葉的醇類、酮類和醛類香味成分含量均有不同程度增加。醛類、酮類、醇類和呋喃類香味成分含量分別增加了6.5%、8.5%、8.2%和10.7%，上述成分的提高有利于提高煙葉的吸味品質(zhì)。

2.4 煙葉表面微生物變化分析

2.4.1 煙葉表面微生物OTU豐度分析

為探究發(fā)酵前后煙葉表面微生物的群落變化，采用OTU統(tǒng)計工具中的維恩（Venn）圖進行群落分析。如圖5所示，2個樣品中細菌在多樣性O(shè)TU聚類后有253（15.14%）個是共有的，對照樣品CK1有844（50.51%）個為獨有；H11發(fā)酵的樣品有574（34.35%）個為獨有。H11菌發(fā)酵后的樣品細菌種類數(shù)量減少270個，占OTUs總數(shù)的24.61%。

圖5 煙葉表面微生物操作分類單元（OTU）Venn圖Fig.5 Venn diagram of microbial operational taxonomic units（OTUs）on tobacco leaves

為進一步分析維恩圖中各個區(qū)域的物種豐度組成，在門和屬水平上統(tǒng)計每個區(qū)域相應(yīng)OTU的豐度。由圖6可見，對照煙葉中優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes），分別占總的高質(zhì)量序列的81%、11%和4%，其中變形菌門為主要的優(yōu)勢菌門。用H11發(fā)酵后的煙葉中厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度最高，為90%。由圖7可見，對照煙葉中優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas），但用H11發(fā)酵后煙葉中芽孢桿菌屬（Bacillus）成為豐度最高的屬，其相對豐度為76%。由此可見，用H11發(fā)酵可明顯改變煙葉表面微生物的多樣性，其中厚壁菌門和芽孢桿菌屬微生物占優(yōu)勢。

圖6 發(fā)酵前后煙葉表面微生物門水平的相對豐度柱狀圖Fig.6 Relative abundances（phylum level）of microorganisms on tobacco leaves before and after fermentation

圖7 發(fā)酵前后煙葉表面微生物屬水平的相對豐度柱狀圖Fig.7 Relative abundances（genus level）of microorganisms on tobacco leavesbeforeand after fermentation

2.4.2 煙葉表面微生物物種組成熱圖分析

在屬水平上將細菌群落組成按照其在樣品中的相對豐度大小排序，并選擇排名前20的屬繪制物種豐度聚類熱圖（圖8）。經(jīng)H11發(fā)酵后的煙葉表面大多數(shù)細菌屬的相對豐度都有所減少，而芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度增加較為明顯，說明H11對煙葉表面微生物組成有較大的影響，并對其他菌屬有抑制作用。

圖8 屬水平上發(fā)酵前后煙葉表面微生物分布熱圖Fig.8 Heat map of distribution（genus level）of microorganisms on tobacco leaves before and after fermentation

2.5 枯草芽孢桿菌枯草亞種碳水化合物活性酶分析

分析菌株H11基因組后發(fā)現(xiàn)，該菌株基因組中具有725 520 bp堿基，共編碼7 960個基因。將菌株H11的蛋白序列與CAZy數(shù)據(jù)庫進行比對，得到其對應(yīng)的碳水化合物活性酶注釋信息共284條（圖9）。推測參與煙葉增香提質(zhì)的關(guān)鍵酶主要為糖苷水解酶（GH）、氧化還原酶（AA）和糖類酯解酶（CE）（表4）。

圖9 枯草芽孢桿菌枯草亞種碳水化合物活性酶（CAZy）分類統(tǒng)計Fig.9 Classification and statistics of carbohydrate active enzymes（CAZy）in Bacillus subtilis subsp.subtilis

由表4可見，菌株H11具有過氧化氫酶、過氧化物酶、4-羥基苯乙酮單加氧酶、α-淀粉酶以及纖維素酶等碳水化合物活性酶。在酶促作用下，煙葉中的大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素和西柏烯發(fā)生降解，生成香味物質(zhì)，對吸味品質(zhì)的提升起到重要的作用。

表4 枯草芽孢桿菌枯草亞種關(guān)鍵碳水化合物活性酶信息Tab.4 Information of key carbohydrate activity enzymes in Bacillus subtilis subsp.

常規(guī)成分分析結(jié)果顯示，發(fā)酵后煙葉中水溶性糖和還原糖的含量增加。與對照相比，發(fā)酵后煙氣更醇和，香氣質(zhì)也有提升。原因可能是H11中存在α-淀粉酶將淀粉水解成水溶性糖和還原糖，有利于提高煙氣醇和度，且糖類成分與氨基酸縮合生成煙葉香氣前體物，還能提升煙葉香氣品質(zhì)［25］；對比分析發(fā)酵前后煙葉中性香味成分變化，發(fā)酵后煙葉中的茄酮、二氫大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮和金合歡基丙酮等香味成分含量增加。評吸結(jié)果顯示，H11發(fā)酵后香氣質(zhì)提升、香氣量增加。

3 討論

從初烤后煙葉中篩選到一株枯草芽孢桿菌枯草亞種，用其發(fā)酵河南平頂山2017年產(chǎn)DCFB煙葉后，評吸結(jié)果顯示增香提質(zhì)效果明顯，這與瞿嬌嬌等［16］對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）煙葉增香提質(zhì)效果的研究結(jié)果一致。煙葉香氣質(zhì)的提升主要表現(xiàn)為重要致香成分的增加，另外還可能與其他成分的減少有關(guān)。枯草芽孢桿菌發(fā)酵煙葉后對吸食品質(zhì)產(chǎn)生有益影響，發(fā)酵后煙葉中香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和巨豆三烯酮C等香味成分含量均有不同程度的增加，這可能是類胡蘿卜素、糖苷以及西柏烯等香氣前體物發(fā)生降解，增加了煙葉中小分子致香物質(zhì)的總量，進而整體提高了感官品質(zhì)［26］。前人研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵煙葉存在發(fā)酵時間長，發(fā)酵量小的問題。楊培香等［27］在枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）Van3菌株提高煙絲品質(zhì)的研究中將40 mL菌液噴施于200 g煙葉表面，并在22℃、60%的恒溫恒濕條件下發(fā)酵煙葉，30 d后香氣量增加，品質(zhì)提升。本研究中發(fā)現(xiàn)的菌株H11發(fā)酵20 kg煙葉僅30 h時即能達到增香提質(zhì)的作用，大大縮短了發(fā)酵時間，擴大了發(fā)酵量。

H11菌株關(guān)鍵酶有纖維素酶和α-淀粉酶等，其中α-淀粉酶可以水解淀粉，從而使水溶性糖和還原糖含量增加，糖類成分又可與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成對煙葉香氣有貢獻的物質(zhì)，進而改善煙葉的香氣品質(zhì)。

菌株H11發(fā)酵煙葉后，煙葉表面微生物多樣性減少，芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物豐度顯著升高，這與黃亞麗等［28］在枯草芽孢桿菌菌劑不同施用方式對甜瓜土壤微生物多樣性及生長影響的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

從初烤后煙葉中篩選出一株新的增香提質(zhì)的微生物菌株H11，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為枯草芽孢桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis）。對河南平頂山2017年產(chǎn)DCFB煙葉用H11發(fā)酵30 h后，煙葉甜感增強、香氣質(zhì)提升、香氣量增加，吸味品質(zhì)改善明顯。對比分析煙葉發(fā)酵前后常規(guī)成分、中性香味成分和煙葉表面微生物種群變化，結(jié)果表明：發(fā)酵后煙葉水溶性糖、還原糖含量分別增加了2.52%、1.92%；（E）-β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和巨豆三烯酮C等香味成分含量分別增加了25.92%、10.57%和12.15%；經(jīng)H11發(fā)酵后，煙葉表面微生物多樣性有所減少，H11芽孢桿菌屬（Bacillus）微生物豐度大幅度增加。與已報道的相關(guān)煙葉發(fā)酵技術(shù)相比，菌株H11發(fā)酵工藝用時更短、發(fā)酵量更大，具有更好的工業(yè)應(yīng)用潛力。