血管內(nèi)皮聚集受體-1 rs12041331位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)初發(fā)腦梗死病人認(rèn)知功能的影響

郭宏偉，胡義奎，劉濤生，譚龍君，劉迪龑?zhuān)T 瓊

腦卒中后認(rèn)知功能障礙是指腦卒中后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)的各種類(lèi)型和程度的認(rèn)知功能障礙，其危險(xiǎn)因素包括腦卒中反復(fù)發(fā)作、高齡及受教育程度低等[1]。有研究表明， 血小板內(nèi)皮聚集受體-1(PEAR1)基因(rs12041331)純合突變不僅影響抗血小板藥物療效，并且與腦卒中反復(fù)發(fā)作有關(guān)[2]。為排除腦卒中反復(fù)發(fā)作對(duì)病人認(rèn)知功能損害的影響，本研究選取初發(fā)腦梗死病人為研究對(duì)象，旨在分析PEAR1 基因(rs12041331)純合突變與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1月—2020年1月在武漢市武昌醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診或住院治療的初發(fā)腦梗死病人150例。所有病人均符合第四屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，且經(jīng)我院顱腦計(jì)算機(jī)斷層掃描或磁共振成像檢查確診為腦梗死。排除標(biāo)準(zhǔn)：短暫性腦缺血發(fā)作、小卒中病人；嚴(yán)重精神障礙或嚴(yán)重器官功能衰竭病人。所有病人均自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)。本研究得到武漢市武昌醫(yī)院倫理道德委員會(huì)的批準(zhǔn)。根據(jù)發(fā)病后6個(gè)月內(nèi)7次(入組時(shí)及每個(gè)月1次)簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)評(píng)分[4]最高分將病人分為認(rèn)知功能正常組(112例)和認(rèn)知功能障礙組(38例)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 臨床資料 記錄病人臨床資料。測(cè)量身高和體重并計(jì)算體質(zhì)指數(shù)。高血壓：收縮壓≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒張壓≥90 mmHg，或既往曾診斷為高血壓，或正服用降壓藥物治療的病人。糖尿?。嚎崭寡?FPG)≥7.0 mmol/L或/和糖耐量試驗(yàn)測(cè)定餐后2 h血糖(2 hPBG)≥11.1 mmol/L，或正在接受降糖治療的病人。吸煙：幾乎每日吸煙，且每日平均吸煙≥1支，持續(xù)時(shí)間>1年。飲酒：幾乎每日飲酒，且每日飲酒≥50 g，持續(xù)時(shí)間>1年。高齡：年齡>75歲。低教育程度：中學(xué)以下文化程度或未接受過(guò)任何教育。統(tǒng)計(jì)兩組入院時(shí)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分[5]，評(píng)分越高提示病人神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.2 PEAR1基因(rs12041331)單核苷酸多態(tài)性測(cè)定 所有病人入組后次日清晨抽取空腹肘靜脈血3 mL，使用乙二胺四乙酸(EDTA)管抗凝處理，保存于-20 ℃冰箱中，按照DNA提取試劑盒(Tiangen)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行規(guī)范操作提取DNA，保存在-20 ℃冰箱中備用。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)及直接PCR測(cè)序法檢測(cè)基因型。PCR反應(yīng)系統(tǒng)：2 μL基因組DNA，正向和反向各5 μL 2×Taq Mix 12.5 μL引物(Aidlab Biotechnologies Co，Ltd)，將0.5 μL超純凈化水加入25 μL體系中。PCR在此項(xiàng)檢測(cè)中的擴(kuò)充條件：94.0 ℃預(yù)變性3 min，94.0 ℃變性30 s，58.5 ℃、59.5 ℃及72 ℃各變性30 s，72.0 ℃擴(kuò)增 5 min，擴(kuò)增后再用2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用凝膠成像檢測(cè)，rs12041331反向引物為5′-GCCCTCTCAGCCTCCGAGC-3′，正向引物為5′-CACTAATCTTATCCCCATTTTCTAGGTG-3′，將退火溫度設(shè)置為59.5 ℃，進(jìn)行30次循環(huán)，內(nèi)切酶為BCCI，酶切片段大?。篈A分別為178 bp和230 bp；AG分別為408 bp、178 bp及230 bp；GG為408 bp。取2 μL上述擴(kuò)增產(chǎn)物，1 μL內(nèi)切酶，2 μL的IOxNEB buffe，5 μL無(wú)菌雙蒸水，建立10 μL反應(yīng)體系。37 ℃條件下，至少進(jìn)行1 h酶切反應(yīng)，之后終止。反應(yīng)終產(chǎn)物與2%瓊脂糖一起制成凝膠，采用Gelred核酸染色，在140 V電壓和300 mA電流下，進(jìn)行電泳，40 min后將該系統(tǒng)進(jìn)行成像，觀察最終結(jié)果并拍照。PCR引物制作和受試者DNA測(cè)序交由上海生工生物工程股份有限公司操作。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 認(rèn)知功能障礙組高齡、低教育程度、吸煙、糖尿病比例及LDL-C水平高于認(rèn)知功能正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組PEAR1 rs12041331位點(diǎn)多態(tài)性分布比較 認(rèn)知功能障礙組野生型GG頻率低于認(rèn)知功能正常組，純合突變型AA頻率高于認(rèn)知功能正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組PEAR1 rs12041331位點(diǎn)多態(tài)性分布比較 單位：例(%)

2.3 初發(fā)腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的Logistic多因素回歸分析 以初發(fā)腦梗死病人是否發(fā)生認(rèn)知功能障礙作為因變量，以高齡、低教育程度、吸煙、糖尿病、LDL-C、PEAR1 rs12041331純合突變型(AA)為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：PEAR1 rs12041331純合突變型(AA)、高齡、低教育程度、糖尿病與初發(fā)腦梗死病人認(rèn)知功能障礙有關(guān)(P<0.01)。詳見(jiàn)表3。

表3 初發(fā)腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的Logistic多因素回歸分析

3 討 論

PEAR1是一種與巨核細(xì)胞生成及血小板活化有關(guān)的跨膜受體，其表達(dá)受DNA甲基化驅(qū)動(dòng)，在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)最多。PEAR1基因位于人類(lèi)染色體1q23.1，包括22個(gè)內(nèi)含子及23個(gè)外顯子，長(zhǎng)度約30 kb。有研究顯示，PEAR1多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與血管內(nèi)皮功能和血小板活化等密切相關(guān)[6]，不同的PEAR1基因位點(diǎn)變化可能影響血小板的反應(yīng)性。

正常情況下，PEAR1在人體外周血液血小板表面表達(dá)水平較低，在二磷酸腺苷、膠原相關(guān)多肽及其他應(yīng)激情況下，PEAR1酪氨酸磷酸化和膜表達(dá)均增加，導(dǎo)致血小板膜糖蛋白(GP)Ⅲa和GPⅡb結(jié)合，成為與纖維蛋白原特異性結(jié)合受體，后者與纖維蛋白原結(jié)合是引起血小板聚集的最終共同路徑，進(jìn)而參與血栓形成[7]。有研究顯示，PEAR1基因與腦卒中和冠心病之間的關(guān)系，可能與其影響血小板激活，延緩巨核祖細(xì)胞增殖、分化等有關(guān)[8]。有研究顯示，PEAR1基因多態(tài)性可能與冠心病病人發(fā)生阿司匹林抵抗有關(guān)，其中AA型病人對(duì)阿司匹林抵抗最為嚴(yán)重[9]。陳靜靜等[10]研究表明，PEAR1基因rs12041331(GA+AA)是阿司匹林抵抗的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，PEAR1基因rs12041331位點(diǎn)A等位基因與缺血性腦卒中病人發(fā)生阿司匹林抵抗有關(guān)。

PEAR1單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與人體血小板的功能和反應(yīng)有關(guān)，因此相關(guān)研究報(bào)道較多，單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)研究主要集中在rs12401331、rs4661012、rs9550270、rs11264579、rs1273215、rs1256688、rs3737224，其中rs12041331研究較多。Keramati等[11]研究顯示，通過(guò)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)PEAR1的532個(gè)變體中，內(nèi)含子1變體rs12041331與所有受試者血小板聚集表型均相關(guān)，全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，與血小板聚集相關(guān)的內(nèi)含子1變體是rs12041331。

Pi等[12]研究顯示，PEAR1單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，特別是rs12041331、rs12566888，與心血管疾病的發(fā)生有關(guān)。PEAR1的單核苷酸多態(tài)性盡管與川崎病易患性無(wú)關(guān)，但rs12041331多態(tài)性可增加川崎病與冠狀動(dòng)脈瘤的形成風(fēng)險(xiǎn)。Faraday等[13]研究顯示，PEAR1 rs12041331基因內(nèi)含子變異影響相關(guān)蛋白的表達(dá)，而相關(guān)蛋白與血小板聚集相關(guān)的多種激動(dòng)劑觸發(fā)和功能變異有關(guān)。

相關(guān)研究顯示，PEAR1 rs12041331 基因多態(tài)性與血小板功能及抗血小板藥物的療效有關(guān)[14]。有研究顯示，PEAR1 rs12041331與阿司匹林血小板聚集改變和心血管事件風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[15]。石秀錦等[16]研究顯示，我國(guó)人群PEAR1 rs12041331野生G基因頻率為0.61，突變A基因頻率為0.39，PEAR1單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與病人血小板活性增高有關(guān)，突變型AG、AA血小板聚集率高于野生型GG，使用抗血小板聚集藥物(阿司匹林和/或氯吡格雷)情況下，突變型AG心血管事件發(fā)生率增高。李建設(shè)等[17]在114例初診腦梗死病人中發(fā)現(xiàn)3種PEAR1 rs12041331基因表型，其中野生型GG占50.9%，雜合突變型GA占42.1%，純合突變型AA占7.8%，突變型AG、AA即使長(zhǎng)期堅(jiān)持服用阿司匹林，病人腦梗死患病和復(fù)發(fā)概率均增加，除外吸煙、年齡、糖尿病、高水平LDL-C、其中PEAR1基因純合突變與腦梗死復(fù)發(fā)的相關(guān)性最強(qiáng)。

腦卒中具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率及高致死率的特點(diǎn)，是全球殘疾和致死的主要疾病之一[18]。腦卒中導(dǎo)致病人肢體和生活能力降低，但認(rèn)知功能障礙起病隱匿，輕度認(rèn)知功能障礙若未干預(yù)，極易錯(cuò)過(guò)最佳恢復(fù)時(shí)機(jī)，給病人、家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[19]。

認(rèn)知功能減退是急性腦卒中病人常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一，包括認(rèn)知障礙非癡呆至癡呆不同程度的認(rèn)知障礙，該病發(fā)生機(jī)制尚未明確，導(dǎo)致早期診斷及治療困難，部分早期認(rèn)知障礙非癡呆經(jīng)過(guò)積極治療，可延緩疾病進(jìn)程，若發(fā)展到癡呆階段，病人病情多表現(xiàn)為階梯式加重，病程呈波動(dòng)性，治療難度加大。認(rèn)知功能減退不但影響病人社會(huì)適應(yīng)及日常生活能力，同時(shí)影響綜合康復(fù)治療與二級(jí)預(yù)防，主要危險(xiǎn)因素包括高齡、低教育程度、復(fù)發(fā)性腦卒中等[20]。早期認(rèn)識(shí)、預(yù)防和治療癡呆的相關(guān)危險(xiǎn)因素可提高病人生活質(zhì)量并減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)，應(yīng)引起臨床醫(yī)生廣泛重視，做到早期評(píng)估、早期預(yù)防。

目前，MMSE是國(guó)內(nèi)外應(yīng)用廣泛的認(rèn)知篩查量表，該量表共30道題(回答正確得1分，回答錯(cuò)誤或不知道得0分)，總分0～30分，包含以下7方面：時(shí)間定向力、地點(diǎn)定向力、即刻記憶、注意力及計(jì)算力、延遲記憶、語(yǔ)言和視空間。MMSE評(píng)分與文化水平密切相關(guān)，文盲>17分，小學(xué)>20分，初中及以上>24分[21]。曹輝等[22]研究顯示，MMSE可作為多發(fā)腔隙性腦梗死早期認(rèn)知功能診斷的參考標(biāo)準(zhǔn)。

本研究單因素分析結(jié)果顯示，認(rèn)知功能障礙組高齡、低教育程度、吸煙、糖尿病比例和LDL-C水平高于認(rèn)知功能正常組(P<0.05)。因此，干預(yù)常規(guī)危險(xiǎn)因素，保持積極的學(xué)習(xí)和良好的生活方式，可有效控制代謝異常，可能降低認(rèn)知功能障礙發(fā)生率。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，認(rèn)知功能障礙組野生型GG頻率低于認(rèn)知功能正常組，純合突變型AA頻率高于認(rèn)知功能正常組(P<0.01)，提示PEAR1基因多態(tài)性可能與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，PEAR1 基因 rs12041331純合突變(AA)、高齡、低教育程度、糖尿病與初發(fā)腦梗死病人認(rèn)知功障礙的發(fā)生有關(guān)(P<0.001)。

PEAR1基因純合突變可增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，加速病人認(rèn)知功能障礙的進(jìn)程，且PEAR1基因純合突變影響抗血小板藥物活性和療效?；A(chǔ)研究顯示，PEAR1除了在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)外，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞中表達(dá)，衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)一步提示PEAR1可能與認(rèn)知功能障礙病理生理有關(guān)[23]。因此，PEAR1的基因型分布可能與認(rèn)知功能減退有關(guān)，病人年齡、低教育程度、吸煙、血糖、LDL-C水平及PEAR1 rs12041331位點(diǎn)(AA)均是初發(fā)腦梗死病人認(rèn)知功障礙的獨(dú)立影響因素。

由于PEAR1基因多態(tài)性影響血小板功能和血小板聚集過(guò)程，因此PEAR1可作為影響腦血管疾病病人療效的必要因素。PEAR1多態(tài)性可能是腦梗死病人的一個(gè)危險(xiǎn)因素，且PEAR1基因純合突變也可能是初發(fā)腦梗死病人認(rèn)知功障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此，通過(guò)基因檢測(cè)和PEAR1多態(tài)性評(píng)估管病人有助于改善療效，具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，評(píng)估PEAR1基因多態(tài)性對(duì)預(yù)測(cè)初發(fā)腦梗死病人認(rèn)知功障礙有一定的作用，初出發(fā)腦梗死病人應(yīng)積極尋找認(rèn)知障礙的危險(xiǎn)因素，以便合理應(yīng)用相關(guān)藥物，加強(qiáng)病人的綜合管理，對(duì)改善預(yù)后、提高生活質(zhì)量具有重要的意義。PEAR1有多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，在我國(guó)人群中均有分布，且存在一定的種族差異。本研究中研究對(duì)象局限，今后應(yīng)進(jìn)行涉及多個(gè)族群或群體，大樣本量和多個(gè)基因位點(diǎn)的研究，分析腦梗死病人認(rèn)知功障礙的相關(guān)因素。