冠心病病人外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2表達(dá)水平及其與炎性因子的相關(guān)性

王玉燕，鐵虎光，金麗山，馬萬程

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病，隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變及生活水平的不斷進(jìn)步，該病發(fā)病率和死亡率呈增加趨勢，引發(fā)的心源性死亡等嚴(yán)重不良預(yù)后成為重大的公共問題[1]。冠心病主要包括穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris，SAP)、不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina pectoris，UAP)、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，冠心病是一種慢性炎癥性疾病，與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等炎性因子均有密切聯(lián)系[2-3]。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)是位于細(xì)胞質(zhì)中的一種蛋白質(zhì)，可間接誘導(dǎo)炎癥體組裝，進(jìn)而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[4]。本研究旨在分析SAP、UAP、AMI病人外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2表達(dá)水平及其與血漿炎性因子的相關(guān)性，以期進(jìn)一步明確冠心病的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年7月—2020年5月于我院住院治療的221例冠心病病人，將冠心病病人分為SAP組(69例)、UAP組(74例)和AMI組(78例)；同期選取健康體檢者79名作為對(duì)照組。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：AMI符合急性ST段抬高型心肌梗死診斷及治療指南[5]，SAP符合慢性穩(wěn)定型心絞痛診斷與治療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，UAP符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；病人病例資料齊全；符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均為自愿參與本研究；近1個(gè)月內(nèi)無手術(shù)治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有感染性疾病、惡性腫瘤；伴有原發(fā)性心肌病或嚴(yán)重肝、腎功能不全；6個(gè)月內(nèi)發(fā)生過腦卒中及急性腦血管疾??；伴有其他血液系統(tǒng)及自身免疫疾??；近1周內(nèi)使用免疫抑制劑、抗炎藥物。

1.3 觀察指標(biāo) 查閱門診及住院病歷，收集病人入院時(shí)臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史、高血壓、糖尿病、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血糖水平。

1.4 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號(hào)：YT9197)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：YT9036)購自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR?Green Master Mix(貨號(hào)：11202ES)購自上海翊圣生物科技有限公司；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：ABE10038)、IL-1 ELISA試劑盒(貨號(hào)：ABE10470)、IL-8 ELISA試劑盒(貨號(hào)：ABE10308)均購自上海瓦蘭生物科技有限公司；IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào)：SEKH-0013)購自北京索萊寶科技有限公司；MCP-1 ELISA試劑盒(貨號(hào)：FT-P31471R)購自上海梵態(tài)生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)儀(型號(hào)：7500)購自美國ABI公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：INSTSUN-1)購自瑞士Tecan公司。

1.5 研究方法

1.5.1 樣品采集及保存 抽取所有研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血樣置于離心管中，加同等體積生理鹽水；將混勻的血樣加入含有人外周血淋巴細(xì)胞分離液的離心管中；將上述樣品以3 000 r/min離心30 min后取出，此時(shí)離心管最上層為血漿(收集血漿待測)，血漿層下的一白色薄層為外周血單個(gè)核細(xì)胞層；收集單個(gè)核細(xì)胞層，2 000 r/min離心5 min后取出，棄上清液，收集乳白色細(xì)胞；EP管中加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)吹懸數(shù)次，以2 000 r/min離心5 min后取出，棄上清液，重復(fù)2次或3次。

1.5.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2水平測定 采用試劑盒提取外周血單個(gè)核細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄得cDNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用RT-qPCR儀擴(kuò)增AIM2及內(nèi)參GAPDH。AIM2及內(nèi)參GAPDH的引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL，SYBR?Green Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-△△CT法計(jì)算外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列(5′-3′)

1.5.3 血漿炎性因子水平檢測 采用ELISA檢測血漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 4組臨床資料比較 對(duì)照組、SAP組、UAP組、AMI組性別、年齡、BMI、吸煙史比例、高血壓比例、糖尿病比例、TC、LDL-C、TG、血糖水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HDL-C水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見表2。

表2 4組臨床資料比較

2.2 4組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平比較 對(duì)照組、SAP組、UAP組、AMI組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平依次上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3、圖1。

表3 4組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平比較(±s)

圖1 4組外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平比較

2.3 4組血漿炎性因子水平比較 對(duì)照組、SAP組、UAP組、AMI組血漿TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均依次上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 4組血漿炎性因子水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.4 冠心病病人AIM2 mRNA水平與炎性因子的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：冠心病病人AIM2 mRNA水平與TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1均呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見表5。

表5 冠心病病人AIM2 mRNA水平與炎性因子的相關(guān)性分析

2.5 影響冠心病發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 將是否發(fā)生冠心病作為因變量，以AIM2、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1、HDL-C作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：AIM2是冠心病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)，HDL-C是冠心病發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.01)。詳見表6。

表6 影響冠心病發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說、氧化刺激學(xué)說、損傷應(yīng)答學(xué)說、免疫炎癥學(xué)說等，其中免疫和炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)[8]。冠心病病人病變局部有炎性細(xì)胞浸潤，且體內(nèi)炎性因子水平與心血管事件發(fā)生有關(guān)[9]。冠心病不良預(yù)后發(fā)生率極高，給家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)，同時(shí)影響病人生活質(zhì)量和生命健康[10]。因此，分析冠心病病人體內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)的生物指標(biāo)，可能為進(jìn)一步探討冠心病發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)，為治療提供新思路。

目前研究證實(shí)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等炎性因子與冠心病密切相關(guān)，其中TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞合成，是體內(nèi)重要的炎癥介質(zhì)，在炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)中均可發(fā)揮生物學(xué)功能，觸發(fā)冠心病發(fā)生、發(fā)展[11]；IL-1通過促進(jìn)B細(xì)胞增殖及抗體分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可間接參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成[12]；IL-6參與炎癥反應(yīng)，在炎癥早期、局限性炎癥及機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)等多種因素中有不同程度升高[13]；IL-8在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞合成，其他細(xì)胞可少量產(chǎn)生[14]；MCP-1是趨化因子CC家族成員，可與趨化因子受體結(jié)合，從而在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[15]。本研究通過檢測SAP、UAP、AMI病人血漿炎性因子，結(jié)果顯示TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均高于健康人群，且AMI病人血漿炎性因子水平最高，與史麗紅等[16-17]研究結(jié)果一致。AIM2可識(shí)別細(xì)胞質(zhì)雙鏈DNA，并與其結(jié)合形成炎性復(fù)合體，之后通過與熱蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用招募接頭蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)[18]。張席軍等[19]研究表明，乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎病人AIM2表達(dá)水平升高，且與IL-1β等多種炎性因子存在密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，健康人群、SAP病人、UAP病人、AMI病人外周血單個(gè)核細(xì)胞AIM2 mRNA水平依次上升，且AIM2是冠心病發(fā)生的影響因素。提示AIM2高表達(dá)可能與冠心病發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。進(jìn)一步研究顯示，冠心病病人體內(nèi)AIM2 mRNA表達(dá)水平與炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相關(guān)。推測冠心病病人AIM2表達(dá)水平升高后，可感知并結(jié)合胞質(zhì)雙鏈DNA，形成復(fù)合體后促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子成熟和分泌。

綜上所述，SAP、UAP、AMI的冠心病病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中AIM2呈高表達(dá)，且與炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相關(guān)。AIM2可能通過促進(jìn)炎性因子表達(dá)，參與冠心病發(fā)生發(fā)展，推測其可能成為冠心病潛在的治療靶點(diǎn)。臨床應(yīng)密切監(jiān)測冠心病病人AIM2及TNF-α、IL-1等炎性因子水平變化，及時(shí)制定合理有效的治療措施。今后需通過體外或體內(nèi)干預(yù)AIM2表達(dá)，如建立AIM2基因敲除小鼠模型驗(yàn)證本研究結(jié)論。