Sirt2抑制劑對(duì)大鼠出血性腦損傷的改善作用及其對(duì)血腦屏障通透性的影響

吳亞芳，亢崇仰，陳悅?cè)A，陸兆豐

創(chuàng)傷引起的出血性腦損傷在臨床上較為常見(jiàn)，具有較高發(fā)病率、致死率，較多存活病人可遺留不同程度后遺癥，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1]。出血性腦損傷的發(fā)生與腦血管病變密切相關(guān)，且發(fā)病后易出現(xiàn)較多并發(fā)癥，其中血腦屏障通透性增加較嚴(yán)重[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療出血性腦損傷多以藥物止血、降顱壓、血腫清除術(shù)為主，但仍無(wú)法直接解決大量神經(jīng)元壞死引發(fā)的神經(jīng)功能缺損[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent-mating information regulater 2，Sirt2)是一種NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶類，在細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)等多重生物學(xué)調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Sirt2抑制劑具有神經(jīng)保護(hù)作用，可減輕神經(jīng)功能受損[5-6]，但其對(duì)出血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能改善及血腦屏障通透性影響方面的研究較少，作用機(jī)制不明確。基于此，本研究開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，著重分析Sirt2抑制劑對(duì)出血性腦損傷大鼠的改善作用及對(duì)血腦屏障通透性的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取45只健康SD雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量260～280 g，購(gòu)自北京科興生物制品有限公司，許可證號(hào)SYXK(京)2019-0053。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，環(huán)境溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度45%～60%，光照周期12 h/12 h，自由獲得飲水、飼料。本研究經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處置符合“3R”原則。

1.1.2 藥物、試劑和儀器 Sirt2抑制劑AK-7(美國(guó)Gene Operation公司)，戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司)，伊文思藍(lán)染料(美國(guó)Amerso公司)，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(湖北武漢塞維爾公司)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)試劑盒(美國(guó)Genmed公司)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)試劑盒(美國(guó)KPL公司)，二喹啉甲酸法(BCA)蛋白試劑盒(湖北武漢富鑫遠(yuǎn)科技有限公司)，兔抗大鼠Sirt2、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(nuclear factor-κB，NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(phosphorylate-NF-κB p65，p-NF-κB p65)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。HN550型冷凍切片機(jī)(德國(guó)Microtome Cryostat)，XB51-32H01型病理圖像分析系統(tǒng)(日本奧林巴斯株式會(huì)社)，XSZ-H-9507285顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，DG5031酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀(華東電子醫(yī)療公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及分組 從45只大鼠中隨機(jī)取15只作為假手術(shù)組，另30只建立出血性腦損傷模型[7]：大鼠以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上。頂毛剃除，75%乙醇消毒。于頭皮正中作1 cm切口，骨膜剪開(kāi)，前囟暴露。鉆孔點(diǎn)為前囟前0.2 mm、中線旁開(kāi)2 mm處，用1 mL注射器沿鉆孔口緩慢進(jìn)針至尾狀核。以0.28 μL含0.5 U/μL的Ⅶ型膠原酶及6.25 U/μL肝素的生理鹽水緩慢注射，注射時(shí)間3 min，留針10 min后緩慢拔針，后骨蠟填充鉆孔，生理鹽水沖洗干凈，縫合皮膚。大鼠清醒后，采用神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(Neurological Severity Scores，NSS)評(píng)估神經(jīng)功能損傷情況[8]，神經(jīng)功能無(wú)異常，計(jì)0分；提尾時(shí)左前肢明顯屈曲，計(jì)1分；大鼠行走時(shí)不自主向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)2分；大鼠行走時(shí)不自主向左側(cè)傾斜，計(jì)3分；大鼠意識(shí)減退，無(wú)自發(fā)行走，計(jì)4分。以NSS評(píng)分1～3分為建模成功。30只大鼠建模成功24只，成功率為80%。24只大鼠隨機(jī)分為模型組與Sirt2抑制劑組，每組12只。假手術(shù)組術(shù)中僅注射等量生理鹽水，其余操作步驟同模型組、Sirt2抑制劑組，術(shù)后NSS評(píng)分0分入選，15只大鼠均納入研究。

1.2.2 干預(yù)方法 建模成功后立即給藥，Sirt2抑制劑組以25 mg/kg體質(zhì)量Sirt2抑制劑AK-7(用生理鹽水稀釋至0.25 mL)腹腔注射，假手術(shù)組、模型組以等體積生理鹽水腹腔注射，均給藥1次。

1.2.3 取材、處理 各組給藥后24 h，采用NSS評(píng)分法評(píng)估神經(jīng)功能損傷。完成評(píng)估后，以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉，斷頭處死。各組分別選擇4只大鼠，取腦組織，分為3份，2份置于液氮保存，用于炎性因子、蛋白表達(dá)檢測(cè)；1份置于4%多聚甲醛固定，用于HE染色。各組剩余大鼠中隨機(jī)選擇4只，剝?nèi)⊥暾X組織，置于干凈濾紙，表面滲液、血跡去除，稱重，記為濕重；置于60 ℃烘箱烘烤48 h，取出稱重，記為干重。以干濕法測(cè)定腦組織濕重/干重(wet/dry weight ratio，W/D)值。各組剩余大鼠取4只行血腦屏障通透性檢測(cè)。

1.2.4 炎性因子IL-6、TNF-α水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)炎性因子IL-6、TNF-α水平。取液氮保存腦組織，生理鹽水沖洗，冰浴下制備10%組織勻漿。4 ℃、12 000 r/min離心，離心半徑8 cm，10 min，取上清液。嚴(yán)格按照IL-6、TNF-α試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作：相應(yīng)反應(yīng)孔內(nèi)加不同程度標(biāo)準(zhǔn)品100 μL、標(biāo)本100 μL，37 ℃，溫育，2 h。甩干板內(nèi)液體，洗滌4次。各孔加100 μL一抗工作液，混勻，37 ℃，溫育，1 h。甩干板內(nèi)液體，洗滌4次。各孔加100 μL酶標(biāo)工作液，混勻，37 ℃，溫育，30 min。甩干板內(nèi)液體，洗滌4次。各孔加100 μL底物工作液，混勻，37 ℃，溫育，15 min。各孔加100 μL終止液，反應(yīng)10 min。20 min內(nèi)觀察酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處吸光度值。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)本吸光度值獲得濃度值。

1.2.5 腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè) 采用HE染色法檢測(cè)腦組織病理形態(tài)。取4%多聚甲醛固定腦組織，生理鹽水沖洗，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)浸泡12 h。脫水，石蠟包埋，切片，厚度4 μm，烤干。二甲苯透明，梯度乙醇脫蠟，水洗。蘇木精染色5 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗，共30 min。伊紅染色，流水沖洗，梯度乙醇脫蠟。二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)。

1.2.6 血腦屏障通透性檢測(cè) 采用伊文思藍(lán)灌注染色法檢測(cè)血腦屏障通透性。各組所選大鼠以2%溶于生理鹽水的伊文思藍(lán)染料4 mL/kg靜脈注射，靜待2 h，觀察大鼠四肢末梢、結(jié)膜、齒齦、尾部呈藍(lán)色后，以2%戊巴比妥鈉50 mg/kg(0.25 mL/100 g)腹腔注射麻醉。自大鼠左心室插入灌注針，止血鉗固定。右心耳剪破，以250 mL生理鹽水緩慢自左心室灌注，清除腦血管內(nèi)殘留血液，以右心耳流出清亮液體為止。大鼠斷頭處死，快速將出血側(cè)腦半球組織取出，腦表面以生理鹽水沖洗，避免雜質(zhì)、血跡影響吸光度值。出血側(cè)腦半球組織稱重，置入1 mL/100 mg甲酰胺，37 ℃，48 h。低溫離心，觀察酶標(biāo)儀620 nm波長(zhǎng)處吸光度值。通過(guò)倍比稀釋法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將所得吸光度值轉(zhuǎn)換為伊文思藍(lán)染料含量，進(jìn)行血腦屏障通透性評(píng)估。

1.2.7 腦組織Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腦組織Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量。取液氮保存腦組織，PBS沖洗2次。加RIPA裂解液，冰上裂解30 min。4 ℃，12 000 r/min離心，離心半徑10 cm，8 min，取上清液。BCA試劑盒行蛋白定量，加2×上樣緩沖液。沸水浴10 min，變性。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加5%脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65(1∶1 000)一抗，4 ℃搖床孵育，過(guò)夜。TBST洗膜4次，每次10 min。加二抗(1∶2 500)，室溫孵育，共2 h。TBST洗膜4次，每次10 min。加化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)試劑，成像儀曝光成像。經(jīng)目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值比值計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠NSS評(píng)分比較 與模型組比較，Sirt2抑制劑組NSS評(píng)分降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠NSS評(píng)分比較(±s) 單位：分

2.2 3組大鼠IL-6、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.3 3組大鼠腦組織W/D值比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組腦組織W/D值升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組腦組織W/D值降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組腦組織W/D值比較(±s)

2.4 3組大鼠腦組織形態(tài)比較 HE染色顯示，假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)無(wú)異常，神經(jīng)細(xì)胞有序排列，染色較均勻，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組腦組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)局部出血、水腫，損傷腦組織區(qū)伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，Sirt2抑制劑組腦組織結(jié)構(gòu)紊亂、局部出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象明顯改善。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化比較(HE，×400)

2.5 3組大鼠血腦屏障通透性比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組大腦皮層、基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)含量升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組大腦皮層、基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)含量降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 3組大鼠血腦屏障通透性比較(±s) 單位：μg/g

2.6 3組大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與假手術(shù)組比較，模型組、Sirt2抑制劑組Sirt2、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比較，Sirt2抑制劑組Sirt2、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖2、表5。

圖2 3組大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)條帶圖

表5 3組大鼠Sirt2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

3 討 論

腦出血是一種常見(jiàn)的急危重癥，其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多層次、多因素的復(fù)雜過(guò)程，而腦出血后繼發(fā)性腦損傷是導(dǎo)致病人殘疾、死亡的主要原因[9]。目前認(rèn)為出血性腦損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，包括細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放、炎癥反應(yīng)、血腦屏障破壞等[10]。腦出血后，血腦屏障被破壞，發(fā)病3 h至14 d內(nèi)，血腫周圍水腫持續(xù)增加，這是腦出血后致殘、致死的重要病理基礎(chǔ)[11]。另外，腦出血后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)在血腦屏障紊亂中也具有重要作用。因此，臨床上盡早診治出血性腦損傷病人，尋求新的治療靶點(diǎn)，減輕神經(jīng)功能損傷，控制血腦屏障破壞，已成為研究熱點(diǎn)之一。

Sirtuins屬于蛋白去乙?；割悾烧{(diào)控代謝、細(xì)胞分裂、老化等細(xì)胞和生物過(guò)程，而Sirt2為Sirtuins家族成員之一，主要定位于細(xì)胞質(zhì)[12]。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，雖有研究發(fā)現(xiàn)Sirt2敲除可引發(fā)髓鞘形成減慢[13]，但目前仍不知激活Sirt2在促進(jìn)損傷神經(jīng)髓鞘再生中是否有作用。另外，也有報(bào)道顯示，在神經(jīng)退行性疾病中，Sirt2抑制劑通過(guò)對(duì)固醇合成進(jìn)行抑制從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]?？梢?jiàn)，Sirt2抑制劑對(duì)神經(jīng)損傷的功能目前研究少且存在爭(zhēng)議，可能是腦損傷后潛在的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Sirt2抑制劑治療后，大鼠NSS評(píng)分、W/D值及IL-6、TNF-α水平降低，大腦皮層、基底節(jié)區(qū)伊文思藍(lán)含量減少；進(jìn)一步分析腦組織病理形態(tài)學(xué)，發(fā)現(xiàn)Sirt2抑制劑組腦組織結(jié)構(gòu)紊亂、局部出血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象明顯改善，提示Sirt2抑制劑可改善出血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能，減輕炎癥反應(yīng)、腦水腫，降低血腦屏障通透性，控制腦組織損傷。

NF-κB是一種含多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，可參與炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程。相關(guān)報(bào)道顯示，Sirt2可參與NF-κB信號(hào)通路，且在細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、多種糖脂代謝等方面發(fā)揮重要作用[15]。有學(xué)者提出，Sirt2在應(yīng)激條件下，可通過(guò)對(duì)NF-κB去乙?；?，調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激所致?lián)p傷[16]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Sirt2/NF-κB信號(hào)通路可參與免疫、炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)損傷，機(jī)制可能是Sirt2能對(duì)NF-κB活性進(jìn)行抑制，阻礙依賴NF-κB激活轉(zhuǎn)錄的炎性細(xì)胞因子釋放，以減輕炎癥反應(yīng)[17]。這些研究均提示Sirt2/NF-κB信號(hào)通路可能在出血性腦損傷中有一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Sirt2抑制劑后，大鼠Sirt2、p-NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，提示Sirt2抑制劑能對(duì)Sirt2/NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行抑制，這可能是Sirt2抑制劑發(fā)揮改善大鼠出血性腦損傷、降低血腦屏障通透性的重要作用機(jī)制之一。

綜上所述，Sirt2抑制劑可改善出血性腦損傷大鼠神經(jīng)功能，減輕炎癥反應(yīng)、腦水腫，降低血腦屏障通透性，作用機(jī)制可能與抑制Sirt2/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究存在一定不足之處，如研究局限于大鼠，并未實(shí)際應(yīng)用到臨床，且Sirt2抑制劑對(duì)大鼠出血性腦損傷改善作用及對(duì)血腦屏障通透性影響途徑較多，本研究并未就其他作用機(jī)制進(jìn)行分析，今后仍需進(jìn)一步深入研究。