基于TLR/NF-κB通路探究蓬子菜總黃酮對動脈粥樣硬化模型家兔的干預效果

徐 丹 ，陶永梅，宋 丹，周振興，周 悅，王瑞珩，劉樹民

動脈粥樣硬化屬于循環(huán)系統(tǒng)疾病，是心血管內科常見疾病，也是動脈硬化最重要也最常見的一種類型，發(fā)病位置為血管處，按照動脈粥樣硬化受累動脈部位可以分為腸系膜動脈、冠狀動脈、腦動脈、四肢動脈硬化等，動脈粥樣硬化臨床表現(xiàn)多為體力衰退、腦力衰退，并會隨著血管斑塊的形成，不同的病變部位也會出現(xiàn)不同程度的缺血癥狀，其中腦缺血會引起頭暈、眩暈以及暈厥等癥狀[1-3]。有研究證明，服用蓬子菜總黃酮可以減輕動脈粥樣硬化臨床癥狀，蓬子菜總黃酮可通過抑制Toll樣受體(TLR)/核轉錄因子-κB(NF-κB)的表達，進而改善血管病變[4]?，F(xiàn)有的藥物及手術治療方法只能短時間控制病情，見效快，但西藥副作用較大，且不能根治此病，但目前缺乏關于蓬子菜總黃酮用于動脈粥樣硬化模型家兔的相關資料。故本研究基于TLR/NF-κB通路研究蓬子菜總黃酮對動脈粥樣硬化模型家兔的干預效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取75只家兔，由廣東金石醫(yī)療科技服務有限公司提供[動物許可證號：SYXK(粵)2020-0232]，兔齡3～5(3.80±0.95)個月，體質量225～263(231.80±18.05)g，將家兔放置在室溫23～25 ℃、濕度40%～70%、自然光照、通風的無病原菌的干凈籠子中飼養(yǎng)，飲用水和食物均經(jīng)消毒。本實驗經(jīng)我院倫理委員會批準。主要試劑及藥物來源：酶聯(lián)免疫試劑盒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；TLR3抗體購于上海群己生物科技有限公司；NF-κB p62抗體購于上海梵態(tài)生物科技有限公司；蓬子菜全草的藥物均購自同仁堂。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模 在75只家兔中隨機選取15只作為正常組，不做任何處理，其余家兔隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15只，參照李枚娟等[5]研究建立動脈粥樣硬化家兔模型，除正常組外，其余各組家兔均在早晨將尼古丁25 mg/kg溶于花生油對家兔進行灌胃，18：00時使用與早晨相同劑量的尼古丁重復灌胃，同時給予高脂飼料誘發(fā)家兔動脈粥樣硬化，每周2次，持續(xù)2周，正常組灌胃等體積生理鹽水。建模成功標準：家兔出現(xiàn)動脈粥樣硬化癥狀。

1.2.2 給藥 將蓬子菜全草粉碎，采用75%乙醇進行提取，醇提液濃縮至一定密度，乙醇洗脫液濃縮后干燥，得總黃酮，檢測純度是否達到59%，保存?zhèn)溆?。低劑量組、中劑量組、高劑量組家兔分別給予蓬子菜總黃酮灌胃6周，劑量分別為0.05 mg/kg、1.00 mg/kg、1.50 mg/kg，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.2.3 病理組織學觀察 家兔灌胃6周后，禁食不禁水12 h，麻醉處死，迅速摘取主動脈后立即固定在染色液中，將所制備的家兔主動脈組織樣本在甲醛溶液中固定24 h后，行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制備厚度為4 μm的組織切片，取主動脈組織石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.2.4 檢測白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1α(IL-1α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平 抽取各組家兔的空腹靜脈血2 mL，離心半徑5 cm，32 s平均轉速3 000 r進行離心處理3 min，分離上層血清，在-42 ℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆茫捎妹嘎?lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IL-6、IL-1α、TNF-α、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平，實驗步驟：設置10個標準孔并準備相應水平標準品，設置1個空白孔及若干待測樣品在10 μL待測樣品中加入40 μL樣本稀釋液，封板膜封板，置于37 ℃水浴箱溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶標液50 μL，封膜溫育30 min，清洗反應板5次，每次間隔30 s，拍干，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光環(huán)境下顯色15 min，在反應孔內加入終止液每孔50 μL以終止反應，450 nm波長測量每孔吸光度，檢測IL-6、IL-1α、TNF-α、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.2.5 檢測6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α)、血栓素B2(TXB2)水平 用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基制備1×105/mL細胞懸液，均勻接種于2個24孔板，每組設6個復孔，每孔細胞懸液1 mL。在細胞完全貼壁并將細胞放置培養(yǎng)箱直到細胞近50%匯聚時，換用不同含血清的DMEM同步化處理24 h，棄上清，加入干預培養(yǎng)基進行實驗：正常組加入正常組培養(yǎng)基1 mL 24 h，吸去上清液；模型組加入模型組培養(yǎng)基1 mL 24 h，吸去上清液；低劑量組、中劑量組、高劑量組加入低劑量組、中劑量組、高劑量組培養(yǎng)基1 mL 24 h，吸去上清液。在37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取上清液用放射免疫法檢測6-keto-PGF1α、TXB2含量。

1.2.6 測定TLR/NF-κB信號通路蛋白表達量 采用蛋白質印跡法(Western Blot)檢測蛋白表達量，實驗步驟：將主動脈組織接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進行處理，并使用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜，每次5 min，共3次，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜，每次5 min，共3次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內參蛋白為GAPDH。

2 結 果

2.1 各組家兔病理組織學觀察 正常組家兔血管平滑肌細胞排列整齊，不存在脂質沉積，色澤較鮮艷，未見粥樣硬化斑塊；模型組家兔主動脈壁增厚，內膜下存在脂質沉積，存在大量泡沫細胞以及明顯的動脈粥樣硬化斑塊；藥物干預后，低劑量組、中劑量組家兔血管平滑肌細胞排列相對規(guī)整；高劑量組家兔視血管平滑肌細胞結構基本完整，未見明顯脂質沉積。詳見圖1。

圖1 各組家兔病理組織學觀察(HE，×400)

2.2 各組家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組IL-6、IL-1α、TNF-α水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組IL-6、IL-1α、TNF-α水平低于中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平比較(±s) 單位：ng/L

2.3 各組家兔6-keto-PGF1α、TXB2水平比較 中劑量組、低劑量組、模型組6-keto-PGF1α水平均低于正常組，TXB2水平均高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組6-keto-PGF1α水平高于模型組，TXB2水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組6-keto-PGF1α水平高于低劑量組，TXB2水平低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組6-keto-PGF1α水平高于中劑量組，TXB2水平低于中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組家兔6-keto-PGF1α、TXB2水平比較(±s) 單位：mg/L

2.4 各組家兔TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較 中劑量組、低劑量組、模型組TG、TC、LDL-C水平均高于正常組，HDL-C水平均低于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組TG、TC、LDL-C水平低于模型組，HDL-C水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組TG、TC、LDL-C水平低于低劑量組，HDL-C水平高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組TG、TC、LDL-C水平低于中劑量組，HDL-C水平高于中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組家兔TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較(±s) 單位：mmol/L

2.5 各組家兔TLR/NF-κB通路蛋白表達水平比較 中劑量組、低劑量組、模型組TLR3、NF-κB p62水平高于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組、低劑量組TLR3、NF-κB p62水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量組、中劑量組TLR3、NF-κB p62水平低于低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4、圖2。

表4 各組家兔TLR/NF-κB通路蛋白表達水平比較(±s)

圖2 各組家兔TLR/NF-κB通路蛋白表達條帶圖

3 討 論

動脈粥樣硬化屬于心血管疾病，已逐漸成為我國居民最主要的死亡原因。心血管系統(tǒng)是人體重要的血管系統(tǒng)之一，該處的血管容易堵塞，動脈粥樣硬化是血管病中最常見的一種，當血管發(fā)生老化以及衰退時，血管內脂肪以及類脂等物質聚集成斑塊，呈黃色粥樣，斑塊數(shù)量達到一定限度時會造成血管壁增厚、變硬，從而失去彈性，形成動脈粥樣硬化[6-7]。動脈粥樣硬化會引起心律失常以及心絞痛，甚至會造成嚴重的器官損傷，目前主要的治療方法只能短時間控制病情，且治療效果與病變的程度、部位以及血管狹窄程度、受累器官受損等因素有關[8]。如心血管系統(tǒng)受損則會嚴重地影響病人的日常生活，甚至危及生命。且目前有效治療動脈粥樣硬化的方法較少，常采用西藥進行病情控制，但西藥不能根治此病，且副作用較大，為更好地研究出有效的治療方案，本研究基于TLR/NF-κB通路探討蓬子菜總黃酮對動脈粥樣硬化模型家兔的干預效果，為動脈粥樣硬化的治療提供參考。

動脈粥樣硬化會增加毛細血管的阻力，造成嚴重的器官損傷，蓬子菜具有行血、清熱解毒、利膽的功效，主要含有黃酮、環(huán)烯醚萜、蒽醌、有機酸等化學成分，是從中藥和天然植物中提取的黃酮類化合物，具有明顯的抗氧化以及清除自由基的作用[9]。董均明等[10]研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮可以降低毛細血管的血管阻力以及血管滲透性，對血管內皮細胞的損傷有著較強的保護作用。朱玉良等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮有誘導急性早幼粒細胞白血病細胞株細胞凋亡的作用。目前，關于蓬子菜總黃酮在動脈粥樣硬化中應用效果的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮可明顯減輕動脈粥樣硬化家兔毛細血管阻力，其原因可能與蓬子菜黃酮類成分具有明顯的抗氧化以及清除自由基的作用，且生物利用度高，最終發(fā)揮改善動脈粥樣硬化毛細血管阻力的作用有關。

IL-6、IL-1α、TNF-α屬于炎性細胞因子，IL-6具有較強的抗感染以及免疫防御功能，對血管內皮細胞具有一定的保護作用[12]。而TNF-α是一種多功能的細胞因子，高水平的TNF-α會誘發(fā)細胞產(chǎn)生凋亡刺激因子以及中性粒細胞黏附，同時還會活化中性粒細胞，從而導致血管內皮細胞產(chǎn)生氧自由基或者蛋白酶[13]。易瓊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可作用于多種靶向細胞，對細胞的生長以及分化具有調節(jié)及誘導作用，可參與內皮細胞損傷、單核細胞內膜下遷移以及促凝性質的改變，并可與其他炎性細胞因子起到協(xié)調的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α具有多重生物學效應，可導致炎癥，促進內皮素的產(chǎn)生，促進動脈粥樣硬化的形成[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮治療后，家兔IL-6、IL-1α、TNF-α水平明顯降低，此類藥物還具有消腫、抗炎的作用，說明IL-6、IL-1α、TNF-α可反映機體炎癥反應。

動脈粥樣硬化家兔在發(fā)病期會出現(xiàn)血小板過度激活的現(xiàn)象，從而導致TXB2釋放增加。楊雪等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TXB2具有強烈的血小板聚集以及收縮血管功能，會導致血管以及血管內形成微血栓。本研究結果顯示，蓬子菜總黃酮治療可降低TXB2水平，升高6-keto-PGF1α含量，說明蓬子菜總黃酮有抑制血小板TXB2合成及促進6-keto-PGF1α生成的作用，可發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生與機體脂質過氧化作用密切相關[17]。鄭曲等[18]研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)機體脂質代謝水平可提高家兔的抗脂質過氧化能力，預防心腦血管疾病，提高HDL-C水平，影響血清TC、TG、LDL-C水平，從而調節(jié)機體的脂質代謝。本研究發(fā)現(xiàn)，蓬子菜總黃酮治療后家兔TG、TC、LDL-C水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高，說明蓬子菜總黃酮可很好地治療動脈粥樣硬化，調節(jié)機體脂質代謝水平。

TLR/NF-κB通路是較為常見的信號通路之一，此信號通路被證實在多種疾病中存在表達失調現(xiàn)象，是一條重要的調節(jié)通路，其中TLR3、NF-κB p62是TLR/NF-κB通路中的蛋白因子[19-20]。此通路可促進動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)，通過調控TLR3、NF-κB p62表達，可阻止動脈粥樣硬化的病變進程，減輕炎癥反應以及免疫紊亂[21]。TLR3可以在內皮細胞中廣泛表達，耿瑞麗等[22]研究表明，激活TLR3不僅可以損傷內皮細胞功能，還會促進疾病的進展，TLR3的激活還可以誘導具有抗炎效應的炎性基因，此外，TLR3的激活還可以抑制動脈損傷后新生內膜的形成及內膜彈性薄層的斷裂。NF-κB信號機制可促進動脈粥樣硬化的疾病進展，引起抗微生物感染的免疫應答，介導固有免疫向獲得性免疫轉換。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB可促進炎癥的發(fā)生發(fā)展，加重動脈粥樣硬化[23]。故本研究中高劑量蓬子菜總黃酮可能通過抑制TLR/NF-κB信號通路，下調TLR3、NF-κB p62表達，緩解動脈粥樣硬化的發(fā)展。

綜上所述，蓬子菜總黃酮可能通過調控TLR/NF-κB信號通路中相關重要信號傳導分子的蛋白表達，降低動脈粥樣硬化模型家兔毛細血管的血管阻力以及血管的滲透性。