焦薏苡仁的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究

方君卉 張榮桂 侯紹遠 牛家豐 高 敏

1.山東省棗莊市食品藥品檢驗檢測中心，山東棗莊 277102；2.山東省棗莊市山亭區(qū)市場監(jiān)管綜合行政執(zhí)法大隊，山東棗莊 277200

薏苡仁為禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen（Roman.）Stapf的干燥成熟種仁，俗稱薏米、苡仁、薏仁、鐵玉蜀黍等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。薏苡仁為山東省臨床常用藥，全國多有分布種植，以貴州、福建、四川等省為主產(chǎn)地[1]，功效為清熱排膿、健脾止瀉、利濕除痹，臨床主治多種癌癥、高血壓、高血脂、炎癥及免疫力低下[2-3]。據(jù)古代醫(yī)方和現(xiàn)代文獻記載，薏苡仁的炮制方法有清炒、麩炒、糯米炒、土炒、姜汁炒、鹽制、法制、砂燙、炒焦等[4-6]。薏苡仁性涼，炒焦后涼性偏于平和，長于健脾止瀉。焦薏苡仁最早見于明代《奇效良方》，《山東中藥炮炙經(jīng)驗匯編》記載在山東青島、濟南曾使用，亦可用于四妙湯等方劑中。目前焦薏苡仁非藥典品種，且缺乏相關(guān)科學(xué)文獻，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善。為了對該飲片的安全性、有效性進行全面控制，本研究初步制訂焦薏苡仁的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其臨床應(yīng)用及開發(fā)提供資料。

1 材料與儀器

1.1 樣品收集

共收集11批薏苡仁，產(chǎn)地均為貴州，其中7批購自6家生產(chǎn)企業(yè)，4批購自河北安國藥材市場。按《中華人民共和國藥典》2020年版四部[7]炮制通則中單炒（清炒）法炮制，具體為：“取凈薏苡仁，置鍋中，用中火炒至表面焦褐色，斷面焦黃色，取出，放涼”，由6位中藥專業(yè)人員炮制加工成焦薏苡仁樣品，依次編號為1～11。全部樣品經(jīng)鑒定，均為《中華人民共和國藥典》2020年版一部收載品種。

1.2 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；XS205DU電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司]；IX51型電子顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；XP-501型偏光顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；SX2-8-10NP型馬弗爐（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

薏苡仁對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121254-201504）；薏苡仁油對照提取物（中國食品藥品檢定研究院，批號：111750-201703）；黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)示濃度分別為0.93、0.30、0.93、0.35 μg/ml，中國食品藥品檢定研究院，批號：610001-201804）；玉米赤霉烯酮（標(biāo)示濃度為50μg/ml，Sigma公司，批號：LC06967V）；甘油三油酸酯對照品（含量以99.6%計，中國食品藥品檢定研究院，批號：111692-202007）。甲醇、乙腈、二氯甲烷均為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品呈寬卵形或長橢圓形，微鼓起，長4～8 mm，寬3～6 mm；表面焦褐色，光滑，偶有殘存的黃褐色種皮；一端鈍圓，另端較寬而微凹，有一淡棕色點狀種臍；背面圓凸，腹面有1條較寬而深的縱溝。質(zhì)堅實；斷面焦黃色，粉性；有焦香氣，味微甜。見圖1。

圖1 焦薏苡仁樣品圖

2.2 顯微鑒別

樣品過四號篩，取適量粉末，用水合氯醛試液加熱透化制片，置顯微鏡下觀察。本品粉末類白色。主為淀粉粒，單粒類球形或多面形，直徑2～20 μm，臍點星狀；復(fù)粒少見，一般由2～3分粒組成。偶見黃棕色焦煳組織碎塊。見圖2。

圖2 焦薏苡仁粉末顯微特征

2.3 薄層色譜鑒別

考察并建立了焦薏苡仁的兩種薄層色譜鑒別方法。

取本品粉末1 g，加石油醚（60℃～90℃）10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加石油醚（60℃～90℃）1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取薏苡仁對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則0502），吸取上述兩種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-醋酸（10∶3∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。11批供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的熒光斑點。見圖3。

圖3 焦薏苡仁薄層色譜（1）圖

取本品粉末1 g，加石油醚（60℃～90℃）30 ml，超聲處理30 min，濾過，取濾液，作為供試品溶液。另取薏苡仁油對照提取物，加石油醚（60℃～90℃）制成每1 ml含2 mg的溶液，作為對照提取物溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙醚-冰醋酸（83∶17∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。11批供試品色譜中，在與薏苡仁對照提取物色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同顏色的斑點。見圖4。

圖4 焦薏苡仁薄層色譜（2）圖

2.4 水分測定

按水分測定法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則0832第二法）測定，11批焦薏苡仁測定結(jié)果在3.0%～6.0%，平均值為4.1%，見表1?？紤]樣品代表性和運輸、貯藏影響，參照《中華人民共和國藥典》中麩炒薏苡仁項下水分限度，暫定水分不得超過12.0%。

表1 焦薏苡仁測定結(jié)果

2.5 總灰分測定

按灰分測定法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則2302）進行測定，11批焦薏苡仁測定結(jié)果在1.4%～2.0%，平均值為1.7%，見表1。根據(jù)測定結(jié)果，暫定總灰分不得超過2.0%。

2.6 真菌毒素

有研究發(fā)現(xiàn)，藥食兩用中藥薏苡仁可能被黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、橘霉素等真菌毒素污染[8-12]。《中華人民共和國藥典》2020年版一部薏苡仁項下在已有黃曲霉毒素檢查的基礎(chǔ)上，增加了玉米赤霉烯酮的檢測方法，為監(jiān)督執(zhí)法提供強有力的技術(shù)支撐。為考察焦薏苡仁飲片的安全性，按真菌毒素測定法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則2351）中的黃曲霉毒素測定法（第一法）、玉米赤霉烯酮測定法（第一法），依次測定樣品。

根據(jù)黃曲霉毒素測定結(jié)果，7號樣品檢出黃曲霉毒素G1、B1（含量分別為1.12、0.71 μg/kg），其余樣品中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1均未檢出，結(jié)果詳見表1。暫定限度為：每1000 g含黃曲霉毒素B1不得超過5 μg，含黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素B2和黃曲霉毒素B1的總量不得超過10 μg。典型色譜圖見圖5～7。

圖5 黃曲霉毒素混合對照品HPLC色譜圖

圖6 樣品（檢出曲霉毒素）HPLC色譜圖

圖7 樣品（未檢出曲霉毒素）HPLC色譜圖

11批焦薏苡仁全部檢出玉米赤霉烯酮，測定結(jié)果在63.74～562.96μg/kg，結(jié)果詳見表1。暫定限度為：每1000 g含玉米赤霉烯酮不得超過500 μg。典型色譜圖見圖8～9。

圖8 玉米赤霉烯酮對照品HPLC色譜圖

圖9 樣品玉米赤霉烯酮HPLC色譜圖

2.7 浸出物測定

按浸出物測定法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則2201熱浸法）對11批焦薏苡仁進行測定，用無水乙醇作溶劑。測定結(jié)果在6.5%～9.7%，平均值為8.2%，結(jié)果詳見表1。根據(jù)結(jié)果，暫定醇溶性浸出物限度不得少于5.5%。

2.8 含量測定

薏苡仁中含脂肪酸及酯類、多糖、三萜類、黃酮類等成分[3，13]，其中甘油三油酸酯含量較高，為其主要活性成分之一[14-17]。參照《中華人民共和國藥典》2020年版一部薏苡仁藥材項，考察并建立焦薏苡仁中甘油三油酸酯的HPLC含量測定方法。

2.8.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-二氯甲烷（65∶35）為流動相；蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數(shù)按甘油三油酸酯峰計算應(yīng)不低于5000。柱溫：30℃，流速：1.0 ml/min。典型色譜圖見圖10～11。

圖10 甘油三油酸酯對照品HPLC色譜圖

圖11 焦薏苡仁甘油三油酸酯含量測定HPLC色譜圖

2.8.2 對照品溶液的制備 精密稱定甘油三油酸酯對照品17.66 mg，置100 ml量瓶中，加流動相使溶解，定容，搖勻，即得（濃度為0.1759 mg/ml）。

2.8.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50 ml，稱定重量，浸泡2 h，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用流動相補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.8.4 系統(tǒng)適用性 理論板數(shù)按甘油三油酸酯峰計為29283，與相鄰峰分離度為2.0，符合系統(tǒng)適用性要求。

2.8.5 精密度試驗 精密吸取2.8.2項下的甘油三油酸酯對照品溶液5 μl，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，測其峰面積，結(jié)果見表2。RSD為2.0%，表明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果

2.8.6 重復(fù)性試驗 取焦薏苡仁樣品（編號1），按照2.8.3方法平行制備6份，分別進樣，計算每份供試品的含量，結(jié)果見表3。RSD為1.2%，表明本方法的重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果

2.8.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的焦薏苡仁樣品（編號1）6份，每份約0.35 g，分別精密加入對照品溶液（濃度為0.1759 mg/ml）15 ml，按2.8.3方法制備供試品。分別進樣，結(jié)果見表4。平均加樣回收率為100.8%（RSD為1.3%），表明方法回收率符合測定要求。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果

2.8.8 樣品測定 取各樣品制備的供試品溶液，進樣分析，以干燥品用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算。11批樣品中甘油三油酸酯的含量在0.67%～1.08%，平均值為0.88%。測定結(jié)果詳見表1。暫定限度為含量不得少于0.40%。

3 討論

焦薏苡仁為山東地區(qū)臨床慣用炮制品種。本研究收集薏苡仁藥材并炮制成焦薏苡仁，對性狀和顯微特征進行觀察總結(jié)；建立了以薏苡仁對照藥材、薏苡仁對照提取物為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的薄層色譜鑒別，色譜圖斑點清晰，專屬性強；按《中華人民共和國藥典》2020年版通則方法對水分、總灰分、黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮及浸出物進行測定，初步確定各限量標(biāo)準(zhǔn)；探索并建立焦薏苡仁中有效成分甘油三油酸酯的含量測定方法及限度，方法學(xué)考察重復(fù)性好，選用3種不同色譜柱試驗，條件適用范圍廣，耐用性良好。根據(jù)測定結(jié)果，1批樣品檢出黃曲霉毒素G1、B1；全部樣品均檢出玉米赤霉烯酮，并且有一批結(jié)果高于500 μg/kg；其余項目結(jié)果均在擬定限度范圍內(nèi)，說明影響飲片質(zhì)量和安全的因素主要為黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的殘留，應(yīng)引起重視和重點監(jiān)管。

綜上所述，本研究收集的樣品具有一定代表性，實驗數(shù)據(jù)詳實、準(zhǔn)確，為焦薏苡仁的質(zhì)量評價提供參考。今后將進一步完善該飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以規(guī)范焦薏苡仁的生產(chǎn)及在山東地區(qū)的流通和使用。