復(fù)方益腎利石顆粒提取工藝優(yōu)化與顆粒成型性考察

覃新華 胡傳義

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地 （上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院），上海 200135；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院泌尿外科，上海 200135

復(fù)方益腎利石方是上海市基層名中醫(yī)的臨床經(jīng)驗方，全方由金錢草、海金沙等9味藥材組成。具有清熱利濕、理氣排石、益腎止血的功效，經(jīng)長期的用藥觀察，效果顯著。為使患者方便攜帶、使用與保存，擬將本處方制備成顆粒劑[1-2]。本研究采用正交試驗優(yōu)化復(fù)方水提工藝，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法考察顆粒劑成型工藝，并測定顆粒劑中主要有效成分的含量，對顆粒劑中有關(guān)藥材進(jìn)行薄層鑒別并檢查顆粒劑的粒度、水分、溶化性。本研究將為后續(xù)益腎利石復(fù)方藥效研究提供提取物制備工藝參考，為制劑工藝優(yōu)選實驗提供輔料選擇的前期數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS105十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；Agilent 1200高效液相色譜儀（安捷倫公司），MWD檢測器；CAT-022.7808薄層色譜全自動點樣儀（CAMAG公司）。

1.2 試藥

川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院（批號分別為：39524-08-8、110722-201815、111857-201804）；95%乙醇（食用級，成都市科龍化工試劑廠）。

2 實驗方法

2.1 正交試驗優(yōu)化復(fù)方水提工藝

2.1.1 吸水率測定 按處方比例的1/2稱取9味藥材（共89.5 g），加10倍量水，浸泡0.5、1、2、3、4、5、6、24 h后過濾，稱藥渣重量，重復(fù)3次。結(jié)果顯示藥材在浸泡30 min時達(dá)到最大值。因此，提取浸泡時間為30 min。

2.1.2 正交試驗優(yōu)化提取工藝 選擇正交試驗考察復(fù)方水提工藝[3]，按照L9（34）正交試驗表，考察提取次數(shù)（B）、提取時間（C）和溶劑倍數(shù)（D）因素對各指標(biāo)及得膏率的影響。

2.2 顆粒劑成型工藝考察

選擇星點設(shè)計-效應(yīng)面法對顆粒劑制備工藝篩選[4]，按照三因素五水平的中心設(shè)計，以麥芽糊精和乳糖的配比、輔料-浸膏粉的配比和乙醇濃度為考察因素。因素水平編碼見表1。

表1 因素水平及代碼表

2.2.1 稀釋劑考察 按最佳水提工藝提取該復(fù)方，濃縮成浸膏，粉碎，備用。取相同干浸膏粉若干份，加不同比例的稀釋劑，噴以30%的乙醇溶液制粒。

2.2.2 黏合劑考察 以不同濃度乙醇的水溶液作為黏合劑，考察乙醇濃度對顆粒的成型率、吸濕性、休止角和溶化性的影響。取相同干浸膏粉3份，按照2.2.1中的方法制粒。

2.3 顆粒劑的質(zhì)量評價

2.3.1 薄層色譜鑒別 ①續(xù)斷的薄層色譜鑒別：取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成l mg/ml的對照品溶液。取本品細(xì)粉0.2 g，加甲醇15 ml，使其溶解后，作為供試品溶液。取缺續(xù)斷的處方藥材制備陰性樣品，同供試品溶液制備方法。分別吸取上述4種溶液各5 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

②枳殼的薄層色譜鑒別：以枳殼為對照藥材，加入10 ml甲醇，超聲處理，取濾液，加入5 ml甲醇，使殘渣溶解，得對照藥材溶液。取復(fù)方顆粒與缺柚皮苷及新橙皮苷顆粒劑，同法制得供試品溶液與陰性樣品溶液。吸取上述4種溶液各10、20 μl，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶6∶2）的上層液，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置105℃恒溫箱中，加熱5 min，使用365 nm紫外光燈照射并觀察。

2.3.2 含量測定方法 ①總黃酮的含量測定[5]：取蘆丁對照品25 mg，置50 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻。精密量取10 ml，置50 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，即得對照品溶液。精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5 ml，分別置10 ml量瓶中，于510 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），以濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸 方 程 為Y=1.3212X-0.0022（r2=0.9999），線 性范圍0.099～0.495 mg/ml。取樣品溶液至干燥蒸發(fā)皿中得浸膏。精密稱取浸膏粉1 g，加30%乙醇25 ml，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量。取續(xù)濾液5 ml，置50 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度。取3批樣品（批號：2020092301、2020092302、2020092303）各1 g，按照上述方法測定吸光度并計算Y，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算復(fù)方顆粒劑中總黃酮的含量。②柚皮苷、新橙皮苷含量測定色譜條件[6]：高效液相儀Agilent 1200，MWD檢測器，Agilent 1200工作站；色譜柱：SyMMetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（2∶8）。精密吸取對照品溶液，分別以對照品進(jìn)樣濃度的對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的對數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程及線性范圍，柚皮苷Y=17913X-56.038（r2=0.9991），線性范圍0.042～0.288 mg/ml；新橙皮苷Y=A=19646X-82.457（r2=0.9999），線性范圍0.010～0.165 mg/ml。取浸膏粉0.2 g，加入50 ml甲醇，稱定重量，加熱回流1.5 h，得供試品溶液。按上述柚皮苷、新橙皮苷含量的測定方法，代入線性回歸方程，計算顆粒劑中柚皮苷、新橙皮苷含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)方的提取工藝

原方以煎湯劑的形式在臨床上服用，為保證與臨床使用方式一致，采取水提法進(jìn)行提取[7]。按照《中華人民共和國藥典四部通則》和相關(guān)文獻(xiàn)資料[6-8]，以總黃酮、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷含量及其轉(zhuǎn)移率為提取工藝考察指標(biāo)。采用多指標(biāo)的綜合評分法做出客觀全面的評價[9]。直觀分析結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗統(tǒng)計結(jié)果及極差分析

表3 正交試驗方差分析表

各因素對水提工藝的影響順序為：B ＞ C ＞ D，最佳提取工藝為B3C2D1。其中B對提取率有顯著影響（P＜ 0.05）。結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，確定最佳水提工藝為B3C2D1，即加8倍量水，提取3次，每次1 h。

稱取處方3份，分別按優(yōu)選工藝進(jìn)行提取驗證。結(jié)果得膏率均值為22.54%，總黃酮總含量均值為1762.09 mg，川續(xù)斷皂苷Ⅵ轉(zhuǎn)移率均值為36.92%，柚皮苷轉(zhuǎn)移率均值為97.71%，新橙皮苷轉(zhuǎn)移率均值為78.25%，三批驗證樣品的轉(zhuǎn)移率RSD均＜ 7.0%，出膏率RSD＜3.0%，結(jié)果表明提取工藝穩(wěn)定，可重復(fù)。

3.2 顆粒劑的成型性考察

本方日服處方量為179 g，浸膏日服用量為40.82 g，服用量大，因此適合制備成中藥顆粒劑。目前市場上的稀釋劑中，糖粉因吸濕性強，會干擾藥物成分，淀粉水溶性差，都不宜作為顆粒劑的稀釋劑[10]。經(jīng)實驗組篩選得出，以麥芽糊精和乳糖作為制劑輔料，藥物和輔料比為3∶1時，所得顆粒較好。

3.3 模型擬合

按照以上篩選結(jié)果，應(yīng)用Desgin-Expert 12.0軟件以O(shè)D值為因變量，對各因素進(jìn)行多元二次項擬合分析，得回歸方程為：OD值=69.12+8.43A+4.09B-6.76C-3.55AB-5.85A2-2.81B2-5.64C2。則OD值=-117.23+346.47A+558.86B+53.58C-319.87AB-210.61A2-633.06B2-111.48C2（r2=0.9407，P＜0.01）。方差分析結(jié)果見表4，可知失擬項P＞ 0.05，表明方程擬合度較好、模型具有極顯著差異、預(yù)測性高，各因素對綜合評分OD值的影響程度為A＞C＞B，其他因素AB、A2、B2、C2比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

表4 效應(yīng)面二次模型的方差分析

通過Desgin-Expert 12.0軟件，得到輔料配比（A）、輔料用量（B）、乙醇濃度（C）各因素交互對OD值的等高線圖和效應(yīng)面圖（圖1）。在A（50%～100%）、B（20%～30%）、C（0%～80%）的范圍內(nèi)，應(yīng)用Desgin-Expert 12.0軟件得到最佳成型工藝輔料配比60%、輔料用量28.8%、乙醇濃度24%，總評OD值為74.40?？紤]實際生產(chǎn)合理性和操作可行性，將最佳成型工藝確定為輔料配比60%、輔料用量30%、乙醇濃度24%，總評OD值為74.37。

圖1 輔料比與藥輔比對OD值的等高線圖和效應(yīng)面圖

3.4 顆粒劑質(zhì)量評價

3.4.1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷、新橙皮苷的薄層色譜鑒別 供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯示相同顏色的斑點，結(jié)果見圖2～3。

圖2 續(xù)斷的薄層色譜圖

圖3 枳殼的薄層色譜圖

3.4.2 總黃酮與柚皮苷、新橙皮苷含量的測定 以最佳工藝制備所得的顆粒劑中的總黃酮平均含量為78.16 mg/g，柚皮苷、新橙皮苷平均含量為41.03 mg/g，均符合要求。

3.4.3 檢查項 以最佳工藝制備所得的顆粒劑的水分、溶化性等指標(biāo)均符合《中華人民共和國藥典四部通則》[6]項下的相關(guān)規(guī)定。

4 結(jié)論

泌尿系結(jié)石是外科的常見病、多發(fā)病[11]。近年來，隨著人民工作生活節(jié)奏的加快、日?；顒恿康臏p少以及飲食結(jié)構(gòu)的重要轉(zhuǎn)變，我國泌尿系結(jié)石的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢[12]。西醫(yī)主要以微創(chuàng)手術(shù)[13]，術(shù)后予以解痙、抗炎、鎮(zhèn)痛藥物治療，但在碎石和排石的過程中仍會造成不同程度的機體損傷，而中醫(yī)藥從整體觀念出發(fā)，辨證施治，通過益腎、排石的方法，可彌補現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的不足。研究表明[14]，中醫(yī)藥在促進(jìn)結(jié)石排出、減少血尿以及保護(hù)腎臟功能方面有獨特優(yōu)勢，能夠減少體外震波手術(shù)對腎臟的損傷，提高手術(shù)成功率，減少并發(fā)癥。

本研究主要探討通過水提工藝優(yōu)化、濕法制粒技術(shù)，把臨床治療泌尿系結(jié)石的有效驗方制備為顆粒劑，方便患者服用，并且為動物藥效實驗解決了原料的制備工藝問題[15]，同時為該復(fù)方顆粒劑處方和所需工藝的篩選、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、穩(wěn)定性考察等提供了前期研究數(shù)據(jù)，為該復(fù)方后續(xù)的藥物開發(fā)提供了參考依據(jù)。