基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討小檗堿治療肺癌的作用機(jī)制

鄒宇翔 柳 鑫 李 為▲

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430030；2.武漢市第四醫(yī)院藥學(xué)部，湖北武漢 430033

肺癌是世界重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，其發(fā)病率與病死率均占惡性腫瘤的首位，全球范圍內(nèi)的肺癌中有80%～85%被歸為非小細(xì)胞肺癌，臨床治療主要采用手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法等[1]?；瘜W(xué)藥物和分子靶向藥物的臨床應(yīng)用大大延長(zhǎng)了晚期肺癌患者的生存期并改善其生活質(zhì)量[2]，然而長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題，因此，尋找新的治療肺癌有效藥物成為科學(xué)研究的重要方向[3-4]。小檗堿是中藥黃連發(fā)揮臨床療效的重要活性成分。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿具有抗腫瘤、抗菌和調(diào)節(jié)血糖等作用[5-8]，然而其治療肺癌的機(jī)制尚不清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究其治療肺癌的潛在作用機(jī)制并進(jìn)行初步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為臨床使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞A549，由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供。

1.2 藥物與試劑

小檗堿（成都格利普，批號(hào)：2086-83-1），經(jīng)高效液相色譜（HPLC）分析含量為99.3%；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑法（CCK-8，日本同仁，CK04）；RPMI1640（Gibco，YS-R1018）；胎牛血清（Ausbian，VS500T/WS500T）；缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）試劑盒（Vazyme，A113-03）；p53抗體（AffinityBF8013）、Bax抗體（Affinity，AF0120）、Bcl-2抗體（Affinity，AF6139）。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（上海海向，CHW-80L）；電子天平（廣東鼎恒，ME104）；高壓滅菌鍋（上海博迅，YXQ-50SII）；酶標(biāo)儀（BIOBASE，F(xiàn)C）；電泳儀（北京六一，DYY-7C）。

1.4 方法

1.4.1 藥物和疾病靶點(diǎn)的獲取和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取小檗堿結(jié)構(gòu)式，導(dǎo)入Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)化合物的靶點(diǎn)。在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)，以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞，獲取肺癌的靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建化合物-疾病靶點(diǎn)（C-T）圖和“化合物-靶點(diǎn)－疾病”（C-T-P）圖。將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種為“智人（homo sapiens）”，構(gòu)建蛋白互作（PPI）關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.4.2 基因本體功能（GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析 將上述靶基因?qū)隓AVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定物種為“homo sapiens”，進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析，將數(shù)據(jù)可視化。

1.4.3 CCK-8檢測(cè)小檗堿對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用 人非小細(xì)胞肺腺癌A549采用10%血清培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種后于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育，貼壁后按實(shí)驗(yàn)方案操作。將A549細(xì)胞以7000個(gè)/孔接種于96孔板中，貼壁后，加入小檗堿，濃度設(shè)置為0、1、2、4、8、10、20和40 μg/ml，每組3個(gè)復(fù)孔。CCK8法檢測(cè)作用12、24、48 h后細(xì)胞的存活率。將酶標(biāo)儀設(shè)置于波長(zhǎng)450 nm，測(cè)量各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.4 TUNEL法檢測(cè)小檗堿對(duì)A549細(xì)胞凋亡作用 將爬好細(xì)胞的玻片固定后，按要求進(jìn)行操作，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)A549細(xì)胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞接種到6孔板中，分別根據(jù)上述結(jié)果按要求在各孔加入相應(yīng)試劑，作用24 h后，棄上清液。用PBS清洗后，提取總蛋白，檢測(cè)各組細(xì)胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化合物-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲取化合物靶點(diǎn)100個(gè)和疾病靶點(diǎn)23469個(gè)，得到潛在靶點(diǎn)92個(gè)，構(gòu)建C-T圖。將交集靶點(diǎn)和化合物與疾病等導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建C-T-P圖。見(jiàn)圖1～2。

圖1 C-T圖

圖2 C-T-P圖

2.2 構(gòu)建PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)

將92個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，度值高的靶點(diǎn)有SRC、CDC42、CDK4、CDK2、CHEK1等，推測(cè)可能是小檗堿治療肺癌過(guò)程中發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 靶點(diǎn)富集分析

2.3.1 GO功能富集分析 將篩選出的92個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析，以P＜0.05為閾值，以Count值為標(biāo)準(zhǔn)排序。生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）涉及蛋白質(zhì)磷酸化、信號(hào)傳導(dǎo)和藥物反應(yīng)等；細(xì)胞組分（cellular component，CC）涉及質(zhì)膜、胞漿和核質(zhì)等；分子功能（molecular function，MF）涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白激酶活性等。見(jiàn)圖4。

圖4 GO功能富集分析

2.3.2 KEGG通路富集分析 通過(guò)KEGG通路富集，分析靶標(biāo)信號(hào)通路，以P＜ 0.01為閾值，以Count值為標(biāo)準(zhǔn)排序，相關(guān)通路包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等。為進(jìn)一步探究小檗堿與凋亡生理過(guò)程的關(guān)聯(lián)性，挑選出富集程度和凋亡過(guò)程相關(guān)度較高的通路，包括P53等信號(hào)通路，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-通路關(guān)系。見(jiàn)圖5～6。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 化合物-靶點(diǎn)-通路分析

2.4 小檗堿對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用

與空白組（小檗堿濃度為0 μg/ml）比較，小檗堿干預(yù)12 h后，濃度大于10 μg/ml時(shí)A549細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；干預(yù)24 h后，濃度大于2 μg/ml時(shí)A549細(xì)胞存活率顯著降低（P＜ 0.01），其IC50值約為8.51 μg/ml；干預(yù)48 h后，除空白組外，各濃度小檗堿作用于A549細(xì)胞后存活率顯著降低（P＜ 0.01），提示小檗堿對(duì)A549細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用。見(jiàn)表1。綜合考慮選擇小檗堿作用時(shí)間為24 h，作用濃度為4、8和10 μg/ml開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

表1 小檗堿對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

表1 小檗堿對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響（%，±s）

注 與空白組（0 μg/ml）比較，**P ＜ 0.01

干預(yù)時(shí)間 n 0 μg/ml 1 μg/ml 2 μg/ml 4 μg/ml 8 μg/ml 10 μg/ml 20 μg/ml 40 μg/ml 12 h 3 100.00±0.00 96.80±5.10 94.75±2.72 94.91±10.55 95.32±9.10 93.90±3.06 80.05±2.30** 63.41±1.45**24 h 3 100.00±0.00 99.31±1.41 100.95±5.23 89.45±5.65** 69.87±2.19** 55.47±0.86** 31.39±1.92** 23.14±0.68**48 h 3 100.00±0.00 85.12±0.60** 75.04±4.90**53.36±4.90** 47.67±3.02**28.767±1.15** 16.94±2.18** 18.53±0.71**

2.5 小檗堿對(duì)A549細(xì)胞凋亡的作用

TUNEL結(jié)果顯示，與空白組比較，小檗堿濃度為4、8和10 μg/ml時(shí)，均能顯著促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，且細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用與小檗堿的干預(yù)濃度相關(guān)。見(jiàn)圖7。

圖7 TUNEL法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡（400×，熒光顯微鏡下組織切片上凋亡的細(xì)胞呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光）

2.6 p53、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平

結(jié)果顯示，隨著小檗堿干預(yù)濃度的增大，p53和Bax蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖8和表2。

圖8 Western blotting法檢測(cè)A549細(xì)胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

表2 Western blotting法檢測(cè)A549細(xì)胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（±s）

表2 Western blotting法檢測(cè)A549細(xì)胞中p53、Bax和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（±s）

注 與空白組（0 μg/ml）比較，**P ＜ 0.01

濃度（μg/ml） n p53/GAPDH Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH 03 0.19±0.01 0.18±0.01 0.54±0.0143 0.42±0.01** 0.31±0.01** 0.40±0.02**83 0.56±0.01** 0.37±0.04** 0.29±0.02**10 3 0.72±0.01** 0.61±0.01** 0.11±0.02**

3 討論

研究報(bào)道，中醫(yī)藥治療腫瘤在改善癥狀、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期和縮小腫瘤大小方面作用明顯[9]。中醫(yī)藥與西藥配合使用能起到減毒增效的作用，是我國(guó)創(chuàng)新性新藥研制的重要方向，也是藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[10-11]。中醫(yī)藥治療肝癌作用機(jī)制比較廣泛，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其中重要的治療途徑[12-13]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)小檗堿涉及抗腫瘤和細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程，提示其抑制腫瘤的作用機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)小檗堿對(duì)A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且作用與濃度成正比。p53蛋白是細(xì)胞正常運(yùn)行所必需的調(diào)節(jié)因子，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[14-15]。進(jìn)一步研究提示，小檗堿能夠通過(guò)上調(diào)p53和Bax蛋白，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，從而起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，為小檗堿的抗腫瘤研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有進(jìn)一步研究的重要價(jià)值。然而該研究?jī)H在細(xì)胞水平，具有一定的局限性，期待在體內(nèi)研究中出現(xiàn)更高級(jí)別證據(jù)，完善研究結(jié)論。